The authors would like to acknowledge Alexandra Quackenbush for assisting with surgical procedures during filming of the video protocol, Hadley Holden for histological support, Sonali Jindal for input on tumor and liver pathology during method development, and Breanna Caruso for critical review of the manuscript. The D2A1 and D2.OR mammary tumor cells were a gift from Dr. Ann Chambers, the D2A1-GFP tumor cells were a gift from Dr. Jeffrey Green, and the 4T1 tumor cells were a gift from Dr. Heide Ford. The OHSU Advanced Light Microscopy Core at the Jungers Center was utilized for imaging. The work included in this manuscript includes funding from NIH/NCI NRSA F31CA186524 (to ETG) and NIH/NCI 5R01CA169175 (to PS).

Alle tierischen Verfahren in diesem Artikel wurden von der Oregon Health &amp; Science University Institutional Animal Care und Use Committee überprüft und genehmigt. 1. Vorbereitung der OP-Bereich und Instrumente <ol><li> Bereiten Sie die Scheren, Zangen und hemostat durch Autoklavieren bei 124 ° C für 30 min, 1 - 2 Tage vor der geplanten Operationen. Achten Sie darauf, den Zugang zu autoklavierten oder sterilen Betten, Käfige, und Lebensmittel für postoperative Genesung. </li><li> Bereiten Sie eine aseptische OP-Bereich, vorzugsweise in einem Laminar-Flow-Haube. <ol><li> Wischen Sie alle Oberflächen des OP-Bereich mit 10% Bleichmittel, einschließlich des Heizkissen, Lichtquelle, Anästhesie Schlauch und Nasenkegel und einem anderen Teil des chirurgischen Suite, die in unmittelbarer Nähe zu dem chirurgischen Eingriff sein wird, während es wird durchgeführt . </li><li> In der aseptischen OP-Bereich, stellen Sie das gereinigte Heizkissen mit sterilen Tuch, Lichtquelle, Anästhesie Schläuche und nosecone, Insulinspritzen, 1 ml Spritzen, Bupivacain, künstliche Tränen, steriler Kochsalzlösung, 2 x 2 &quot;steriler Gaze Schwämme, 4 x 4&quot; steriler Gaze, hämostatische Gaze Schnitt in 0,5 bis 1 cm 2 Stück, Scheren, Pinzetten, hemostat, 4-0 Vicryl Nähten mit Kegel Nadel und 50 ml 2% Chlorhexidingluconat in einem autoklavierten Behälter. </li><li> Stellen Sie sicher, dass es Raum in diesem Raum für vorbereitete Tumorzellen auf Eis gelagert ist. </li><li> Auf der Bank neben dem OP-Bereich, bereiten Sie die Recovery-Bereich mit einem zweiten Heizkissen und saubere Käfige mit sterilen Betten. HINWEIS: In diesem Bereich können auch Hausgegenstände wie einen Wulst Sterilisator. </li></ol></li></ol> 2. Portal Veneninjektion <ol><li> Eine Stunde vor der geplanten Injektionen behandeln weibliche Balb / c-Mäuse im Alter von 8 bis 15 Wochen lang mit 100 &amp; mgr; l von 0,015 mg / ml Buprenorphin, subkutan, für die Schmerztherapie. Hinweis: Dieses Injektionsprotokoll in jedem Alter zu jeder Stamm von weiblichen oder männlichen Maus angewendet werden kann, unter Verwendung der entsprechendenZelllinien für die Änderungen an den Stamm. </li><li> Bereiten Sie die Tumorzellen für die Injektion basierend auf Protokolle für die Zelllinie oder Tumor Explantation der Wahl. Testen Sie alle Tumorzelllinien, bevor auf die Anwesenheit von Maus-Krankheitserreger auf die Verabreichung das Risiko der Einführung solcher Pathogene in die Tierkolonie zu reduzieren. <ol><li> Für syngenen Balb / c-Tumorzelllinien, einschließlich D2A1, D2.OR und Tumorzellen 4T1, Tauwetter Zellen in eine 10 cm-Gewebekulturplatte 3 Tage vor der Injektion, so dass die folgenden Tag-Zellen bei ~ 90 sind - 100% Konfluenz. </li><li> 1 Tag nach der Tumorzell thaw wash Zellen einmal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), und die konfluent Tumorzellen unter Verwendung von 2 ml 0,05% Trypsin bei 37 ° C für 5 min trypsinize. In 8 ml Vollmedium (DMEM hohe Glucose, 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin) und Passage 01.10 in ein frisches 10-cm-Schale mit 10 ml komplettem Medium. </li><li> Am Tag der Injektionen, waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS und trypsinize wie oben beschrieben. </li><li> Resuspendieren trypsiniert Zellen in 8 ml komplettem Medium, Spin für 5 min bei 1500 × g, entfernen Sie die Medien und resuspendieren in 5 ml 1x PBS. </li><li> Zählen von Zellen auf einem Hämozytometer unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss für Rentabilitätsprüfung. Die Zellen für die Injektion in 1x PBS bei einer vorbestimmten Konzentration und Volumen. HINWEIS: 5 - 10 &amp; mgr; l wird empfohlen, da kleinere Injektionsvolumina unnötige Schäden an der Leber zu verhindern. </li><li> Halten Zellen auf Eis für die Dauer der Einspritzungen. Nach Beendigung der Injektionen, Rückkehr einer Probe von Zellen ins Labor und in Kultur in Komplettmedium für 1 Tag Lebensfähigkeit zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Platzieren Sie die Maus unter Anästhesie mit 2-2,5% Isofluran (2-Chlor-2- (Difluormethoxy) -1,1,1-Trifluor-Ethan) in Sauerstoff geliefert. Pflegen Körpertemperatur das Heizkissen verwenden. Stellen Sie sicher, komplette anesthetization für eine Reaktion durch die Bewertung zu einer Zehe Prise, und dann halten anesthesia bei 2 - 2,5% Isofluran. HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Tiere die Atemfrequenz zu überwachen und die Isofluran Flussrate entsprechend während des gesamten Verfahrens einzustellen. </li><li> Legen Sie eine kleine Menge von künstlichen Tränen oder Tierarzt Salbe über jedem Auge ein übermäßiges Austrocknen der Augen während des chirurgischen Eingriffs zu vermeiden. </li><li> Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf dem Rücken mit Bauch ausgesetzt. </li><li> Entfernen Haare auf der ventralen linken Seite des Nagetier aus der zweiten Rippenraum bis zum 4. inguinal Nippel Brustdrüse durch den Bereich mit chemischen Enthaarungscreme Abwischen. Lassen Sie das Enthaarungsmittel für 1 zu sitzen - 2 min und entfernen Sie dann vollständig mit Gaze und H 2 O. Dieser Schritt kann 1 erfolgen - 2 Tage im Voraus , Zeit zu sparen , wenn zahlreiche Operationen geplant. </li><li> Nehmen Sie eine 2 x 2 &quot;steriler Gaze Schwamm (getränkt in 2% Chlorhexidin) und wischen Sie die Maus an der Stelle der Haarentfernung. Sterilisieren Sie die gesamte Umgebung, einschließlich der Schwanz, bakterielle cont zu minimierenAminierung von Instrumenten. </li><li> Wischen Sie die Website der Haarentfernung und Umgebung nach unten mit einem Alkoholtupfer. </li><li> Wiederholen Sie 2% Chlorhexidin und Alkohol Schritte noch einmal und beenden mit einem abschließenden Chlorhexidin abzuwischen für insgesamt drei 2% Chlorhexidin und zwei Alkoholtupfer wäscht. Sie die endgültige Chlorhexidin wischen, so dass die Chemikalie nicht um die Operationsstelle tropft immer Chlorhexidin auf die inneren Organe zu vermeiden. HINWEIS: Anwendung von großen Mengen an Chlorhexidin und Alkohol auf die Haut und die umgebenden Fell in einem signifikanten Abfall der Körpertemperatur führen kann. Nicht mit überschüssiges Volumen während der Schritte 2,7-2,9 wischen. Pflegen Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen. </li><li> Mit einer sterilen Handschuhe und ein sterilisiertes Skalpell mit sterilen Klinge, machen einen einzelnen 1-Zoll-Schnitt in die Haut zwischen den mittleren und Sagittalebene auf der linken Seite der Maus starten, gerade unterhalb der Rippen und knapp oberhalb der Ebene der vierten Leistenende Brustdrüse Zitze. </li><li> Mit autoklaviert oder Wulst Schere und Pinzette sterilisiert, machen eine ähnliche 1-Zoll-Schnitt in das Peritoneum. Vermeiden Sie in das Brustfettpolster schneiden und gewährleisten nicht den Darm, Leber oder Membran zu schneiden. </li><li> Legen Sie eine 4 x 4 &quot;Mullbausch getränkt in steriler Kochsalzlösung auf der linken Seite der Maus, wo der Schnitt gemacht wurde, so dass die inneren Organe können auf die Gaze gelegt werden und nicht in Kontakt mit der umgebenden Haut oder Operationsbereich. </li><li> Bereiten Tumorzellen durch Auf- und Abpipettieren mehrmals als Tumorzellen während der Herstellung der Maus absetzen. Bereiten Sie eine 25 &amp; mgr; l abnehmbare Nadelspritze und 32-Gauge-Nadel mit Tumorzellen. Schieben auf der Spritze, bis Tumorzellen an der Spitze der Nadel und der Kolben ist auf der geeigneten Volumen für die Injektion; vermeiden Injektion von Luftblasen. </li><li> Wischen Sie die Außenseite der Nadel mit einem sterilen Alkoholtupfer alle externen Tumorzellen zu entfernen. Seien Sie vorsichtig, Nadelstiche zu vermeiden. </li><li> Halten Sie die mittlere side des Einschnitts, einschließlich Haut und Peritonealüberzug, beiseite mit der Zange und ein steriles Wattestäbchen vorsichtig die Dick- und Dünndarm zu ziehen, so dass sie auf dem steriler Gaze Platzierung in steriler Kochsalzlösung getränkt. Ziehen Sie Dick- und Dünndarm, bis die Pfortader sichtbar gemacht wird. </li><li> Decken Sie die inneren Organe in der Salz getränkten Gaze interne Feuchtigkeit und zur Aufrechterhaltung der Sterilität. </li><li> Haben Sie einen Assistenten, auch sterile Handschuhe tragen, halten die in der Kochsalzlösung getränkten Gaze gehüllt Darm sanft aus dem Weg mit einem sterilen Wattetupfer vollständig die Pfortader offenbaren. Zusätzlich kann es notwendig sein, die autoklaviert hemostat oder Zange zu verwenden Gewebe zu halten beiseite auf der medialen Seite des Einschnitts. </li><li> Führen Sie die Nadel mit Tumorzellen ~ 3 geladen - 5 mm in die Pfortader ~ 10 mm unterhalb der Leber in einem Winkel &lt;5 ° zur Ader, mit Fase nach oben zeigt. injizieren Sie langsam das volle Volumen Tumorzellen enthält. Das Blut an der Nadel vorbei h fließenead für mehrere Sekunden Fluss von Tumorzellen aus der Vene zu vermeiden zurück. Minimieren Sie die Nadel in die Vene während der Injektion zu bewegen. Auch hier seien Sie vorsichtig, Nadelstiche zu vermeiden. HINWEIS: Die Visualisierung der Pfortader wird ohne Vergrößerung getan, aber ein Stereomikroskop, wenn sie bevorzugt verwendet werden. </li><li> Entfernen Sie die Nadel, während gleichzeitig eine sterile Wattestäbchen auf die Vene mit Druck zu setzen. Mit noch der Assistent den Darm hält beiseite legen ein Stück von 0,5 bis 1 cm 2 hämostatische Gaze über der Injektionsstelle auf der Vene. HINWEIS: hämostatische Pulver wurde auch für diesen Schritt im Protokoll versucht, war aber beim Stoppen venösen Blutverlust nach der Injektion nicht wirksam. </li><li> Halten Sie die hämostatische Gaze an der Injektionsstelle mit Druck aus einer sterilen Wattestäbchen für 5 min. </li><li> Beurteilen Verschluss der Vene durch vorsichtiges die hämostatische Gaze, wenn die Gaze haftet an dem umgebenden Gewebe, eine kleine Menge Steril Hebee Salzlösung kann verwendet werden, um die Gaze zu tränken und zu heben. </li><li> Wenn der Blutverlust zu diesem Zeitpunkt auftritt, stellen ein zusätzliches Stück hämostatische Gaze an der Stelle mit dem Druck für weitere 5 min. Wenn der Blutfluss vollständig aufgehört hat, entfernen Sie die Gaze von der Maus. HINWEIS: Der Blutverlust während der Operation muss sorgfältig geprüft werden und wenn die Gesamt erlaubt Blutverlust Volumen erreicht oder überschritten wird (basierend auf regulatorischen Standard-Betriebsverfahren für die Institutional Review Boards des Prüfers) die Maus muss, während unter durch Herzperfusion Narkose eingeschläfert werden. </li><li> Sobald die Injektionsstelle intakt gehalten wird, ohne dass Blut an der Injektionsstelle zu verlassen, legen Sie die inneren Organe in der Bauchhöhle sanft zurück. </li><li> Suture die Peritonealüberzug und dann die Haut mit sterilem 4-0 Vicryl Naht und Kegel Nadel eine einfache kontinuierliche oder unterbrochene Nahtmuster verwendet. Typischerweise erfordert die Inzision zu schließen 10-15 Fäden. </li><li> Inject 100 ul BUPIvacaine (5 mg / ml), die entlang der Einschnittstelle für das Management lokale Schmerzen eine Insulinspritze. Injizieren von 0,5 ml steriler Kochsalzlösung subkutan mit einer 1-ml-Spritze mit 26-Gauge-Nadel für Feuchtigkeit. Operationen nehmen 15 bis 25 min zu vervollständigen. </li><li> Um sterile Bedingungen während der Operation erhalten, sicherzustellen, dass alle Werkzeuge und Materialien in Kontakt mit der Maus kommen, einschließlich der behandschuhten Hände, werden in geeigneter Weise vor gereinigt zu kontaktieren. Wo es möglich ist die Verwendung sterilen Materialien und Handschuhe oder minimal eine 70% ige Ethanollösung oder 10% Bleichlösung zu reinigen verwenden. </li><li> Wenn mehrere Operationen für eine einzige Sitzung geplant Remake des ursprünglichen OP-Bereich mit frischen sterilen Tuch, Insulinspritzen, 1 ml Spritzen, sterile Kochsalzlösung, 2 x 2 &quot;steriler Gaze Schwämme, 4 x 4&quot; steriler Gaze, hämostatische Gaze in 0,5 geschnitten - 1 cm 2 Stück, 4-0 Vicryl Nähte mit Kegel Nadel und 2% Chlorhexidin. Bead-sterilisieren die Scheren, Zangen und hemostat zwischen Operationen und ermöglichenvor dem erneuten Gebrauch ausreichend abzukühlen. </li></ol> 3. Wiederherstellung, Nagetier Health Monitoring und End-Punkt-Analysen <ol><li> Nach dem chirurgischen Eingriff abgeschlossen ist, halten Mäuse auf einem Heizkissen für die Verwertung in der Bettwäsche freie, saubere Käfige für mindestens 20 min. Die Mäuse nehmen in der Regel 2 bis 4 min aus der Narkose aufwachen. </li><li> Nicht ein Tier zurück, die Operation zu Kohabitation mit anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig aus der Narkose erholt hat. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, während sie das Bewußtsein wiederzugewinnen und zu überwachen, bis das Tier die Fähigkeit wiedererlangt hat sich in Brustlage zu halten. </li><li> Geben Mäuse 0,05 bis 0,1 mg / kg Buprenorphin für die Schmerztherapie alle 6-12 Stunden nach der Operation, für bis zu 72 Stunden. </li><li> Überprüfen Sie Nähte täglich, um sicherzustellen, sie während der Heilung intakt bleiben. Im Falle, dass Nähte rückgängig gemacht werden, legen Sie die Maus unter Narkose, entfernen Sie restlichen Nähte und zu ersetzen. Im Falle einer Infektion oder Inflammation konsultieren Tierarzt Personal. HINWEIS: Die Infektion oder Entzündung wurde nicht mit diesem Protokoll festgestellt. </li><li> Für Metastasierung Studien durchführen, tägliche Gesundheitschecks bis äußeren Anzeichen von Metastasen einschließlich beobachtet werden, aber nicht beschränkt auf:&gt; 10% Gewichtsverlust / Gewinn, scruffiness, Verlust der Aufmerksamkeit für die Umgebung, Bauch Ödeme / Aszites, hellen Augen und Ohren, oder eine gebeugte Position. HINWEIS: Tägliche Gesundheitskontrollen besonders wichtig sind, wenn das Modell für die Verwendung mit einer neuen Zelllinie oder Zellkonzentration, bis die Timeline der Metastasierung ist gut verstanden zu entwickeln. </li><li> Bei Studienendpunkt, einschläfern Mäuse durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte. HINWEIS: Alternative Methoden der von der Ermittler Aufsichtsgremium genehmigt Euthanasie verwendet werden können, einschließlich Perfusion mit 1x PBS während der Narkose. Perfusion der Leber wird durch Kanülierung der Pfortader, schnippeln die untere Hohlvene und drücken 1x PBS th durchgeführtrau die Gefäße der Leber mit einer Geschwindigkeit von 4 ml / min mit 1 - 2 Minuten zu entfernen, Blut und Leukozyten zirkulieren. HINWEIS: Je nach dem Endpunkt für die Studie, die Zelllinie, und der verwendeten Konzentration, offene Lebermetastasen bei der Obduktion kann oder auch nicht offensichtlich sein. Mikrometastatische Läsionen können mit histologischen Untersuchung der Leber enthüllt werden. Endpunkte auf das Studiendesign variieren. </li><li> Extrahieren, die Leber mit einer Schere und Pinzette, indem zuerst die Gallenblase zu entfernen, dann durch die inferior vena cava superior schneiden in die Leber. Schnitt durch die Hohlvene, Pfortader und Leberarterie schlechter als die Leber. </li><li> Entfernen Sie die ganze Leber sanft und waschen 5x in 1x PBS. </li><li> Trennen Sie die Leber in links, rechts, Median und Nucleus caudatus Lappen. </li><li> Formalin fix Leber in 10% neutral gepuffertem Formalin für 48 Stunden, während Schütteln bei Raumtemperatur. Verfahren Geweben durch eine Reihe von Alkoholen in steigender Konzentration und Xylol; Paraffin einbetten fixiertem Gewebe 71 </sup&gt;. HINWEIS: Alternativ kann die Leber, indem Gewebe in einem cryomold mit optimalen Schnitttemperatur (OCT) Formel und das Einfrieren auf Trockeneispellets unter Wasser in 95% Ethanol schockgefroren werden. <ol><li> Mit einem Mikrotom geschnitten in das Paraffin eingebetteten Gewebeblock, so dass ein Spiel-Kopfgröße von Gewebe offenbart. </li><li> Schneiden Sie fünf 4-Mikron-Serienschnitte, stellt diese die erste Ebene für die Analyse. </li><li> Schnitt durch 250 &amp; mgr; m von Gewebe, diese Abschnitte in den Abfall werfen. </li><li> Bei 250 &amp; mgr; m geschnitten, um eine zweite Ebene von fünf 4-Mikron-Serienschnitte. </li><li> Bei Bedarf wiederholen, um Schnitt durch die gesamte Leber. Hämatoxylin und Eosin - Färbung der erste Abschnitt jeder Ebene für 72 Metastasierung zu beurteilen. HINWEIS: Für schockgefroren Gewebe eines Kryostaten verwenden Abschnitte zu schneiden. Hinweis: Der Nachweis von micrometastatic Krankheit wird von Tumorzellen spezifische Färbung erfordern. </li></ol></li><li> Entfernen Mäuse aus der Studie, wenn das Tumorwachstum bei den Einschnitt ist sitzene, so zeigt dies an, nach der Injektion von Tumorzellen Leckage in die Bauchhöhle. Hinweis: Dieses Problem wurde nicht beobachtet. </li></ol>

The authors have nothing to disclose and declare no competing financial interests.

Die Balb / c-Maus Pfortader Injektions Modell erlaubt die Untersuchung von Brustkrebs Läsionen in der Leber in der Abwesenheit von Störfaktoren Multiorganmetastasen und in einem vollständig immunkompetenten Wirt. Unser Protokoll ist eine Weiterentwicklung der bisher chirurgische Verfahren veröffentlicht , die zur Injektion von Tumorzellen 16,55,56 direkt in die Leber Zugriff auf die Pfortader ermöglichen. Eine Weiterentwicklung wir gemacht haben , ist signifikant die Anzahl der injizierten Tumorzellen reduzieren von ≥ 1 x 10 5 Zellen / Injektion 16,55,56 unten 10.000 Tumorzellen auf ≤ / Injektion. Wir haben auch das Modell für die Untersuchung von Brustkrebs Metastasen in der Leber erweitert. Mit diesem Protokoll, zwei Brustkrebszelllinien mit bekannten Metastasepotential Lebermetastasen mit kürzerer Latenz als eine Ruhebrusttumorzelllinie zu entwickeln. Ferner werden zu frühen Zeitpunkten, Tumorzellen in der gesamten Leberparenchym als einzelne oder kleine Gruppen von Einzel ce verteiltenlls nach der Tumorzellinjektion. Das Modell ist bereit, Fragen von metastasierendem Effizienz einschließlich Tumorzelle Extravasation, das Überleben der Zellen, Dormanz und Proliferation zu adressieren - alle Phänotypen, die zur Entwicklung von Mikro-metastatischen und offene Metastasen in der Leber beitragen. Es ist wichtig, zahlreiche Aspekte der Pfortader Injektionsprotokoll vor Beginn der Studien zu berücksichtigen. Sorgfältig Entscheidung über Zelllinien, Zellkonzentration wird die Gesamtzellzahl und Endpunkte von Interesse basierend auf kleineren Sondierungsstudien sehr zu empfehlen. Ferner ist die Verwendung von immunkompetenten Wirten und syngenen Zelllinien von größter Bedeutung Wechselwirkungen Wirtszelle, Tumor für das Verständnis. Der neu entwickelte &quot;glühenden Kopf&quot; Maus , die eGFP und Luciferase aus der vorderen Hypophyse ausdrückt , ist ein wichtiges Instrument Host Reaktionen auf exogene eGFP und Luciferase zur Eliminierung von Proteinen verwendet häufig Brusttumorlinien 75 zu markieren , </sup&gt;. Die Verwendung des &quot;glühenden Kopf&quot; Maus und syngenen markierte Tumorzellen durch IHC einfache Identifizierung der einzelnen disseminierten Zellen und micrometastatic Brennpunkte ohne die Sorge von Entzündungsreaktionen zu eGFP oder Luciferase erleichtern. In ähnlicher Weise sorgfältige Auswahl Schmerz-Management-Strategien minimal Anti- oder Pro-Tumor Wirkung aus dem Drogenbehandlungsschema, um sicherzustellen, wird dringend empfohlen. Kritische Schritte in diesem Protokoll umfassen Aufrechterhaltung sterile Bedingungen während Operationen, die Infektion zu gewährleisten, nicht auftritt, da dies keine Ergebnisse durcheinander bringen wird. Es ist auch wichtig, daß die Nadel richtig in die Pfortader angeordnet wird, um sicherzustellen, dass Tumorzellen in die Leber geliefert werden. Üben Sie das Protokoll mit Farbstoffen wie Indien Tinte wird mit diesem Problem helfen. Das Tumorwachstum an der Hauteinschnittstelle ist der beste Indikator dafür, dass falsche Nadel Platzierung aufgetreten. Schließlich ist es wichtig, dass der Blutverlust aus der Pfortader ausreichend kontrolliert wird und ganz aufhört vor suturing das Tier. Die Verwendung von hämostatischen Gaze verringert erheblich die Gefahr einer unkontrollierten Blutverlust aus der Pfortader nach der Injektion. In unseren Händen, nach Injektion verfahrens Mortalität aufgrund von Blutverlust aus der Pfortader wurde von 30% auf 2% der Mäuse, die mit der Verwendung von hämostatischen Gaze reduziert. Es ist wichtig zu beachten, dass die Pfortader Injektion Modell nicht die volle metastatischen Kaskade repliziert, wird aber auf die Untersuchung von Tumorzellen Extravasation, Tumorzellnische Wechselwirkungen folgenden Extravasation und das Tumorwachstum begrenzt. Modelle, die die volle metastatic cascade zur Leber genau nachzubilden, wie beispielsweise bei Patienten auftritt, werden dringend benötigt. Eine zusätzliche Einschränkung des Injektionsmodell Pfortader ist , dass es durch die Auswirkungen der Operation auf dem Host, mit der Wundheilung bekannt auszuwirken Krankheitsprogression 76,77 verwechselt wird. Die Pfortader Injektion Modell stellt eine Verbesserung gegenüber anderen InjektionsModelle Lebermetastasen, einschließlich intrakardialer und intralienale Modelle zu studieren. Insbesondere ermöglicht die Pfortader Injektions Modell für die Untersuchung eines größeren Bereichs der Krankheitsprogression als der intrakardialen Modell, das oft durch gleichzeitige Metastasen in anderen Geweben beschränkt ist. Ferner wird die Pfortader Modell durch Entfernung der Milz nicht kompliziert, wie in der intralienale Modell durchgeführt wird. Die Pfortader Injektionsmodell kann ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Lebermetastasen im allgemeinen erweisen. Lebermetastasen ist die häufigste Ort der Metastasierung in Adenokarzinomen insgesamt mit besonders hohen Raten in Bauchspeicheldrüsenkrebs (85% der Metastasen in der Leber), Kolon und Rektum-Adenokarzinome (&gt; 70%), sowie Magen und Speiseröhre (&gt; 30 %) 1. Obwohl spontan und orthotoper primären Tumormodellen von Pankreas- und Kolon - Adenokarzinome schneller in die Leber metastasieren 78,79 kann die Pfortader Injektion Modell prove nützlich, um den metastatischen Prozess dieser Krebsarten zu verstehen, wie kontrollierte Abgabe von Tumorzellen ermöglicht, biochemische, molekulare und histologischen Beurteilungen zu bestimmten Zeiten nach der Tumorzellenankunft. Zusammenfassend stellt die Pfortader Injektionsmodell eine wichtige Verbesserung gegenüber verfügbaren Lebermetastase Modelle von Brustkrebs, und auch auf die Lebermetastasen Gebiet allgemein anwendbar sein.

Brustkrebs Metastasierung in die Leber Die Leber ist eine gemeinsame Website von Brustkrebs Metastasen, zusammen mit Knochen und Lunge 1-3. Lebermetastasen bei Brustkrebspatientinnen ist ein unabhängiger prognostischer Faktor für die sehr schlechte Ergebnisse 4,5, als mediane Überleben von Brustkrebspatienten mit Lebermetastasen im Bereich von 4,8 bis 15 Monate 6-9. Im Gegensatz dazu haben Brustkrebs Patienten mit Lungen- oder Knochenmetastasen mediane Überlebensraten von 9 zur 27,4 Monate 8,9 und 16,3 zu 56 Monate 8,10-12 sind. Metastasierung ist ein mehrstufiges Verfahren, bezeichnet als der metastatischen Kaskade, die mit Tumorzelldissemination im Primärtumor beginnt und endet mit Patientensterblichkeit aufgrund der Aussaat und Auswachsen der Tumorzellen innerhalb eines entfernten Organs 13-15 zirkuliert. Nagetiermodellen von Metastasen haben ergeben, dass die metastatischen Kaskade bemerkenswert ineffizient ist, mit nur 0,02 bis 10%zirkulierender Tumorzellen Festlegung manifester Metastasierung 16,17. Ein wesentlicher Engpass von metastasierendem Ineffizienz wird durch die einzigartige Gewebemikroumgebungen an sekundären Standorten diktiert, metastasierendem Nischen 18 genannt, was die Bedeutung des Verständnisses ortsspezifische Metastasierung. Die metastatischen Nische zum Ort des erneuten Auftretens einzigartig ist, und wird teilweise durch Ablagerung von verschiedenen extrazellulären Matrixproteinen 19,20, Infiltration verschiedener Immunzellpopulationen 21-23, und veränderte Gewebshomöostase einschließlich dysregulated Produktion zahlreicher Zytokinen, Chemokine und Wachstumsfaktoren 15,18,24,25. Somit voran ein Verständnis der gewebsspezifische metastatic Nische zu verstehen, wie Metastasen abzuzielen. Allerdings robuste Modelle von Lebermetastasen fehlen. Des Weiteren wird eine verbesserte Modelle von Lebermetastasen zu Identifizierung neuer Ziele und wirksame Behandlungen für Brustkrebspatienten wi wesentlich seinth Lebermetastasen. Etablierte Modelle Metastasierung von Brustkrebs in die Leber zu studieren Derzeit verfügbare Modelle Metastasierung von Brustkrebs zu untersuchen, um die Leber menschlichen Krebszelle Xenotransplantate in immungeschwächten Mäusen enthalten. Diese Modelle verwenden in der Regel gut untersuchten menschlichen Brustkrebszelllinien wie MCF-7 und MDA-MB-231 und Nude, Rag1 - / - oder SCID immungeschwächten Maus - Wirte 26-29. Xenograft - Modelle bieten den Vorteil der Menschen abgeleitet Krebszelllinien beteiligt, aber die jüngste Aufwertung für Immunzellen bei der Metastasierung gegeben 30-32 und in der therapeutischen Widerstand 33-35, die Untersuchung der Metastasierung in einem vollständig immunkompetenten Wirt ist von größter Bedeutung. Modelle für Brustkrebs Metastasen in der Leber in immunkompetenten Wirten umfassen orthotope Injektion von syngenen Tumorzellen (zB 4T1 und D2A1 Zelllinien) in das Brustfettpolster, mit oder ohne chirurgischen studierenResektion des Primärtumors und die anschließende Beurteilung der Metastasierung 36-38. Zu beachten ist , ist die Rate von Lebermetastasen aus orthotope Transplantation Modelle sehr gering oder gar nicht vorhanden im Vergleich zu anderen metastatischen Stellen wie Lunge 39,40, oder tritt nach ist Lungenmetastasen festgestellt, die Untersuchung der leberspezifischen Metastasierung zu verkomplizieren 37,39 . Tumor-Explantate von spontanen gentechnisch veränderten Brustkrebs-Modelle können in die Brustfettpolster von naiven Wirte als syngenen Tumorzellen wieder injiziert werden. Zum Beispiel wurde kürzlich berichtet , dass die spontane Tumoren von K14 Cre ECAD f / f P53 f / f Mäuse, die Modell - invasiven lobulären Mammakarzinom, Tumoren entwickeln , wenn orthotop in Wildtyp- Wirte injiziert. Nach chirurgischer Resektion dieser Tumoren , wenn sie 15 mm 2 erreicht, 18% der Mäuse fortgeschritten , um Lebermetastasen 40,41. Ein dritter Ansatz Lebermetastasen nutzt zu modellierenspontane Metastasierung in gentechnisch veränderten Mäusen. Bis heute Berichte von spontanen murine Modelle von Brustkrebs Metastasen, die leicht auf die Leber ausgebreitet sind selten. Ausnahmen schließen die H19-IGF2, die p53 fp / fp MMTV-Cre Wap-Cre und die K14 Cre eCAD f / f P53 f / f gentechnisch veränderte Maus - Modellen, in denen Lebermetastasen in einem geringen Prozentsatz von Mäusen entwickelt 38,41- 43. Während also genetisch veränderte Mausmodelle die Untersuchung von allen Stadien der metastatischen Kaskade und bietet leistungsfähige und klinisch relevante Modelle zu erleichtern, sind sie aufgrund der niedrigen Raten von Lebermetastasen 38 begrenzt. Mehrere Metastasierung Modelle umgehen die ersten Schritte der metastatischen Kaskade einschließlich der Verbreitung von Tumorzellen aus dem Primärtumor und intravasation. Diese Modelle erlauben Untersuchung in die späteren Schritte der metastatischen Kaskade von Extravasation Einrichtung von Tumoren an sekundären Standorten. Der intracardiac Injektions Modell liefert Tumorzellen in den linken Ventrikel, die über die Aorta Tumorzellen in das Kreislaufsystem verteilt. Intrakardial erfordert Ultraschall-geführte Bildgebung der Injektionsstelle oder andere bildgebende Verfahren wie Biolumineszenz von Luciferase-Zellen getaggt erfolgreich Injektion zu bestätigen. Die Tumorzellinjektion über den linken Ventrikel kann in Knochen führen, Gehirn, Lunge und / oder Lebermetastasen unter anderen Organen 44-48. Aufgrund der Multi-Organ Metastasen, müssen diese Mäuse häufig vor der Entwicklung einer manifesten Lebermetastasen eingeschläfert werden, negiert die Fähigkeit zur vollständigen Metastasenwachstum in der Leber zu untersuchen. Ein alternativer Ansatz, der die Entwicklung von Multi-Site-Metastasierung signifikant minimiert, ist die intralienale Injektion Modell. Intralienale Injektion liefert über die Milzvene Tumorzellen , die mit der mesenterica superior verbindet 49,50 die Pfortader zu werden. Die Tiere können für outgr überwacht werdenowth von Metastasen in der Leber , da die Bildung an anderen Standorten von Metastasen ist selten, und als Ergebnis, den allgemeinen Gesundheitszustand des Tieres 49,50 gehalten. Allerdings ist es wichtig , dass das intralienale Modell Splenektomie Milztumoren 49,50, ein Verfahren , die Auswirkungen auf die Immunfunktion zu vermeiden , erfordert zu beachten. So wird beispielsweise myokardiale Ischämie Reperfusionsverletzung durch Infiltration von Ly6C + Monocyten Teilmengen aus , die aus der Milz und sind verantwortlich für die phagozytische und proteolytischen Aktivität während der Wundheilung nach Ischämie 51,52 stammen. Mit Splenektomie, gibt es eine beobachtete Reduktion der Monozyten - Populationen, die in Wundheil 52 unterstützen. Ferner wurde Splenektomie Primärtumorwachstum und Lungenmetastasen in einem nicht-kleinzelligen Lungenkrebs - Modell, und zwar durch eine Verringerung der Anzahl von zirkulierenden und Intratumor CCR2 + CD11b + Ly6C + monozytären myelo zu reduzieren gezeigtid Zellen 53. Zusätzlich führte Splenektomie folgende intralienale Injektion von Kolonkarzinomzellen in reduzierten Mengen an Anti-Tumor - natürlichen Killerzellen in mesenterischen Lymphknoten und erhöhte Lebermetastasen 54. In Summe legen diese Ergebnisse nahe, dass Splenektomie das Immunsystem die Rolle mit weiteren Folgen für metastatischen Zellschicksal Kompromisse. Pfortader Injection Modell von Lebermetastasen Um Brustkrebs Metastasen in der Leber in einem vollständig immunkompetenten Wirt, unter Bedingungen, bei denen Mäuse nicht beeinträchtigt werden durch Multi-Organmetastasen, eine Pfortader Injektion Modell untersuchen entwickelt. Intraportale Injektion Modelle wurden zuvor zu studieren Lebermetastasen von kolorektalen 55,56 und Melanom 16 Zelllinien verwendet werden; wir hier Anwendung der intraportale Injektion beschreiben zu syngenen Brusttumorzelle Metastasen modellieren. Dieses Modell kann verwendet werden, um zu studierendie späteren Stadien der metastatischen Kaskade einschließlich Brustkrebs-Zell Extravasation und Säen, Tumorzellschicksal Entscheidungen in Bezug auf den Tod / Proliferation / dormancy und Auswuchs in offene Läsionen. In diesem Modell werden syngenen Brusttumorzelllinien über die Pfortader von immunkompetenten Balb / c weibliche Mäuse, ein Verfahren injiziert , die zunächst Tumorzellen liefert und direkt in die Leber ohne Entfernung der Milz. Um dieses Modell zu entwickeln, die Verwendung von vier Brusttumorzelllinien, die von niedrig bis hoch in ihre metastatische Fähigkeit reichen wurden eingesetzt: D2.OR, D2A1 und 4T1, und haben D2A1 getaggt mit grün fluoreszierende Protein (D2A1-GFP) eingesetzt untersuchen frühen Zeitpunkten nach der Injektion der Tumorzellen. 4T1 ist ein hochmetastatisch vom 410,4 Tumor abgeleitete Zelllinie , die in einem MMTV + weibliche Balb / c Maus 36,37 entstanden spontan und metastasiert auf Lunge, Leber, Gehirn und Knochen von Brust 39,57,58 Primärtumoren Fettpolster. D2A1 Tumorzellen WERe auch ursprünglich aus einem spontanen Mammatumor abgeleitet in einer Balb / c - Host nach der Transplantation von D2 hyperplastischen alveolaren Knötchen Zellen entstehen, und bestätigt aus dem Primärtumor in die Lunge 59,60 metastatic sein. D2.OR Tumorzellen sind eine nicht-metastasierten Schwester Linie auf die D2A1 Linie , und obwohl sie den Primärtumor zu entkommen und an sekundären Standorten kommen, aber nur selten Fernmetastasen 60,61 etablieren. Darüber hinaus ist es wichtig, die Verwendung von allgemein verwendeten Schmerz Arzneimittel, einschließlich nicht-steroidale entzündungshemmende Medikamente (NSAIDs) während oder nach dem chirurgischen Eingriff zu vermeiden. NSAIDs haben Antitumor-Aktivität in bestimmten Brustkrebs 62-65, und einige Klassen von NSAIDs erhöhen das Risiko für Hepatotoxizität 66,67, möglicherweise die Studie von Lebermetastasen zu beeinträchtigen und die Leber metastasiertem Nische. Ferner Studien deuten darauf hin, dass direkt das Gewebe Mikroumgebung beeinflussen NSAIDs, pro-metastatischen ext reduziertracellular Matrixproteine Tenascin-C 68 und fibrillärem Kollagen 62,65. Alternativ wurde wegen seiner Wirksamkeit in rodent Schmerzmanagement 69 und aufgrund des Mangels an Beweisen die Verwendung eines Opioid - Derivat, Buprenorphin, verwendet , dass Opioide 70 Antitumoraktivität aufweisen. Diese Injektion Modell Pfortader wurde für kleinere Injektionsvolumina von 5 optimiert - 10 &amp; mgr; l, um unnötige Schäden an der Leber zu vermeiden. Das Modell wurde auch Nadeln optimiert umfassen mit kleinerem Durchmesser (≥ 32 gauge) und die Verwendung von hämostatischen Gaze unmittelbar nach der Injektion der Blutverlust während des Verfahrens zu minimieren. Im Gegensatz zu diesen optimierten Einspritzparameter, die Zellzahlen sollte auf individueller Basis bestimmt werden, bezogen auf das tumorigene Potential der Zelllinie. Jedoch für Langzeitstudien bei ≤ 10.000 Zellen / Injektion beginnend empfohlen. Für kürzere Endpunkten (beispielsweise 24 h post-Injektion) erheblich mehr Tumorzellen (zB1 × 10 5 - 1x 10 6) kann , falls erforderlich auch verwendet werden. Zusammengefasst detailliert die Pfortader Injektion Modell stellt hier ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Brustkrebs Metastasen in der Leber und umgeht eine Reihe von Einschränkungen anderer Lebermetastasen Modelle. Dieses Modell ermöglicht Untersuchung der Tumorzelle Extravasation, Säen, frühe Schicksal Entscheidungen des Überlebens, Proliferation und Dormanz und metastatischen Auswuchs in immunkompetenten Maus-Hosts.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1001">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle</td>
			<td style="width:159px;">BD Syringe</td>
			<td style="width:152px;">309597</td>
			<td style="width:435px;">For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Alcohol Prep Pads</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">06-669-62</td>
			<td style="width:435px;">For cleaning of abdomen prior to surgical incision</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">All Purpose Sponges, Sterile</td>
			<td style="width:159px;">Kendall</td>
			<td style="width:152px;">8044</td>
			<td style="width:435px;">4&#34; x 4&#34;, use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Artificial Tears</td>
			<td style="width:159px;">Rugby</td>
			<td style="width:152px;">370114</td>
			<td style="width:435px;">Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml</td>
			<td style="width:159px;">Mfg. by Reckitt Benckiser</td>
			<td style="width:152px;">NDC-12496-0757-1</td>
			<td style="width:435px;">Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1-2x daily for 72 hours, injected subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)</td>
			<td style="width:159px;">Mfg. by Humira Inc</td>
			<td style="width:152px;">NDC-04091163-01</td>
			<td style="width:435px;">Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 ul injected subcutaneously at incision site&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">anti-CD45 antibody</td>
			<td style="width:159px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:152px;">550539</td>
			<td style="width:435px;">Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Celox&#8482; Rapid Hemostatic Gauze</td>
			<td style="width:159px;">Medtrade Products Ltd.</td>
			<td style="width:152px;">FG08839011</td>
			<td style="width:435px;">Cut into 5mm&#178; pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Chemical Depilatory</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Chlorhexidine, 2% Solution</td>
			<td style="width:159px;">Vet One</td>
			<td style="width:152px;">1CHL008</td>
			<td style="width:435px;">Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">anti-CK18 antibody</td>
			<td style="width:159px;">Abcam</td>
			<td style="width:152px;">ab53118</td>
			<td style="width:435px;">Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Cotton Tipped Applicators, Sterile</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">23-400-114</td>
			<td style="width:435px;">6&#34; Wooden Shaft 2 pc/envelope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">DMEM, High-Glucose</td>
			<td style="width:159px;">HyClone</td>
			<td style="width:152px;">SH30243.01</td>
			<td style="width:435px;">Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Dry Glass Bead Sterilizer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Ethanol, 70% solution</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:159px;">HyClone</td>
			<td style="width:152px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:435px;">Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Gauze, Sterile</td>
			<td style="width:159px;">Kendall</td>
			<td style="width:152px;">2146</td>
			<td style="width:435px;">2&#34; x 2&#34;, use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">anti-Green Fluorescent Protein antibody</td>
			<td style="width:159px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:152px;">BA0702</td>
			<td style="width:435px;">Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">L-Glutamine 200 mM (100X)</td>
			<td style="width:159px;">Gibco</td>
			<td style="width:152px;">25030-081</td>
			<td style="width:435px;">Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Heating Pad, x2-3</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:159px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:152px;">1483</td>
			<td style="width:435px;">For use in cell culture to count cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Hemostatic Forceps</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Stainless steel; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">anti-Heppar-1 antibody</td>
			<td style="width:159px;">Dako</td>
			<td style="width:152px;">M7158</td>
			<td style="width:435px;">Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge</td>
			<td style="width:159px;">BD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:152px;">324702</td>
			<td style="width:435px;">For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:159px;">Piramal</td>
			<td style="width:152px;">NDC-66794-017-25</td>
			<td style="width:435px;">Administered at 2.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Isoflurane Vaporizer</td>
			<td style="width:159px;">VetEquip</td>
			<td>911103</td>
			<td style="width:435px;">Use caution, vaporizes anesthetic gases</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Light Source</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td style="width:159px;">Anatech Ltd.</td>
			<td style="width:152px;">135</td>
			<td style="width:435px;">Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Opal&#8482; 4-color fIHC kit</td>
			<td style="width:159px;">PerkinElmer, Inc.</td>
			<td style="width:152px;">NEL794001KT</td>
			<td style="width:435px;">Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Operating Scissors</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Penicillin/Streptomycin, 100x</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:152px;">30-002-Cl</td>
			<td style="width:435px;">Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Phosphate-buffered Saline</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Removable Needle Syringe, 25 ul, Model 1702</td>
			<td style="width:159px;">Hamilton</td>
			<td style="width:152px;">7654-01</td>
			<td style="width:435px;">For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Stainless steel; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Scalpel blade, #15</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Small Hub Removable Needles, 32-gauge</td>
			<td style="width:159px;">Hamilton</td>
			<td style="width:152px;">7803-04</td>
			<td style="width:435px;">For portal vein injection, 1&#34; length, point style 4, 12&#176;angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Sodium Hypochlorite</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Sterile Saline</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">BP358-212</td>
			<td style="width:435px;">0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Surgical Gloves, Sterile</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Sutures, Sterile&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Ethicon</td>
			<td style="width:152px;">J310H</td>
			<td style="width:435px;">4-0 27&#34; coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Table Top Portable Anesthesia Machine</td>
			<td style="width:159px;">VetEquip</td>
			<td>901801</td>
			<td style="width:435px;">Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Thumb Dressing Forceps</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:435px;">Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Towel Drapes, Sterile&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Dynarex</td>
			<td style="width:152px;">4410</td>
			<td style="width:435px;">18&#34; x 26&#34;, to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:159px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:152px;">T10282</td>
			<td style="width:435px;">For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Trypsin/EDTA, 0.05% (1x)</td>
			<td style="width:159px;">Gibco</td>
			<td style="width:152px;">25300-054</td>
			<td style="width:435px;">Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a portal vein injection model to study liver metastasis of breast cancer

Brustkrebs ist die häufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle bei Frauen weltweit. 15 Monate - Lebermetastasen wird in nach oben von 30% der Fälle mit Brustkrebs-Metastasen und führt zu schlechten Ergebnissen mit einer medianen Überlebensrate von nur 4,8 beteiligt. Aktuelle Nagetiermodellen von Brustkrebs Metastasen, einschließlich der Primärtumorzelle Xenotransplantat und spontane Tumormodellen, selten in die Leber metastasieren. Intrakardialer und intralienale Injektion Modelle haben zur Folge Lebermetastasen, aber diese Modelle durch die gleichzeitige Sekundär Ort Metastasierung verwechselt werden kann, oder durch eines geschwächten Immunsystems aufgrund der Entfernung der Milz Tumorwachstum an der Injektionsstelle zu vermeiden. Um der Notwendigkeit einer verbesserten Lebermetastasen Modelle, eine murine Pfortader Injektionsverfahren, das zunächst Tumorzellen liefert und direkt in die Leber entwickelt wurde. Dieses Modell liefert Tumorzellen in die Leber ohne Komplikationen von gleichzeitigen Metastasen in anderen Organen oder Entfernung der Milz. Die Optimierte Pfortader Protokoll verwendet kleine Einspritzmengen von 5 bis 10 &amp; mgr; l, ≥ 32 Gauge-Nadeln und hämostatischen Gaze an der Injektionsstelle zu steuern, um den Blutverlust. Die Pfortader Injektions Ansatz in Balb / c weiblichen Mäusen unter Verwendung von drei syngenen Brusttumorlinien unterschiedlicher metastatischen Potential getestet wurde; Hoch metastasierendem 4T1 Zellen, moderate metastasiertem D2A1 Zellen und niedrigem metastatischen D2.OR Zellen. Die Konzentrationen von ≤ 10.000 Zellen / Injektion führt zu einer Latenzzeit von ~ 20 bis 40 Tage Entwicklung von Lebermetastasen mit den höheren metastasierendem 4T1 und D2A1 Linien und&gt; 55 Tage für die weniger aggressive D2.OR Linie. Dieses Modell stellt ein wichtiges Instrument Brustkrebs Metastasen in der Leber zu studieren, und kann auch auf andere Krebsarten anwendbar sein, die in die Leber darunter Dickdarm- und Bauchspeicheldrüsen Adenokarzinome häufig metastasieren.

Die Pfortader Injektionsmodell, bei dem Tumorzellen direkt in die Leber über ein chirurgisches Verfahren geliefert werden, ermöglicht die Injektion der Tumorzellen in die Pfortader. knapp über der Ebene des vierten inguinal Brustdrüse Zitze und endet knapp unterhalb der Rippen unter antiseptische Bedingungen in einer anästhesierten Maus, ein ~ 1 Zoll chirurgischen Einschnitt auf der linken Seite der Maus zwischen den mittleren und sagittalen Ebenen gemacht, ausgehend . Die Dick- und Dünndarm werden durch den Einschnitt sanft gezogen Visualisierung der Pfortader zu liefern (1A). Genaue anatomische Identifizierung der Pfortader und erfolgreiche intra Portal Injektion können durch Praktizieren der Injektionsprotokoll mit Tusche oder einem ähnlichen Farbstoff bestätigt werden. Korrekte Injektion über die Pfortader in der Tinte führen , dass sofort und gezielt auf die Leber geliefert und wird in Indien Tintenverteilung in der Lunge führen (Figure 1B). Des Weiteren ist mit D2A1 Maus - Brusttumorzellen markiert mit GFP, Ausbreitung von Tumorzellen in der gesamten Leber bei 90 Minuten nach einer Injektion auf , Pfortader Injektion Lieferung in die Leber (1C) bestätigt. Bei höherer Vergrößerung wird es bei 90 min nach der Injektion von Tumorzellen innerhalb von Sinusoiden gefunden sowie im Leberparenchym in unmittelbarer Nähe zum Portal Triaden, wo das Pfortaderblut tritt in die Leber (1C) ersichtlich , daß. Diese Daten legen nahe, dass eine aktive Tumorzelle Extravasation auftritt bei 90 min nach der Injektion der Tumorzellen. Zusammengenommen bestätigen diese Daten, dass die Pfortader Injektionsmodell das Injektionsvolumen direkt an die Leber, mit Tinte oder Tumorzellen in der gesamten Leber und ohne nennenswerte Transport von Injektionsvolumen der Lunge verteilt liefert. Zur Beurteilung der Robustheit der Pfortader Injektion Modell, drei separsyngenen Maus-Mammatumorzelllinien ate wurden in erwachsenen weiblichen Balb / c-Mäusen getestet. Diese Brusttumorlinien wurden auf ihre gekennzeichnet Verhalten in Brustfettpolster Modelle ausgewählt basieren und die hochaggressive und metastatischen 4T1 - Zelllinie, die weniger aggressiven metastasierenden D2A1 Linie, und die niedrig / nicht-metastasierten D2.OR Linie 37,61,73 , 74. 2.000 und 10.000 Zellen pro Injektion wurden keine nennenswerten Unterschiede in der Zeit für die Entwicklung einer manifesten Metastasen mit diesen niedrigen Zellkonzentrationen getestet. Für diese Untersuchungen von Metastasen Surrogatmarker wurden wie Mangel an Pflege verwendet, Blässe und Gewichtsverlust der Obduktion zu rechtfertigen, auf die das Vorhandensein oder Fehlen von Lebermetastasen durch visuelle Beurteilung der Leber und anderen Organen bestätigt wurden intra-Portal Lieferung zu bestätigen . Diese Daten bestätigen frühere Berichte, dass die 4T1 und D2A1 Zelllinien aggressiver Brusttumorlinien darstellen, wie kürzere Metastasierung freie Überlebensrate beobachtet werden, im Vergleich zu Mäusen injiziertmit dem weniger aggressiven D2.OR Linie (2A). Mäuse injiziert mit 4T1 oder D2A1 Tumorzellen entwickelt manifester Lebermetastasen von ~ 30 - 40 Tage nach der Injektion, und einige Metastasen entwickelt bereits 18 Tage nach der Injektion (2A), wohingegen nur eine Maus mit Zellen injiziert hatte D2.OR entwickelte offene Lebermetastasen durch Studienende, die 60 war - Injektion 65 Tage nach der Tumorzelle. Metastasen wurden anschließend durch Schneiden durch die Leber in 250 &amp; mgr; m Ebenen und Analyse Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) gefärbt Abschnitte (2B-D) bestätigt. Neben dem Nachweis einer manifesten metastatischen Läsionen in der Mausleber kann die Pfortader Modell auch frühere Ereignisse in der metastatischen Kaskade einschließlich der Erkennung von einzelnen Zellen / Zellclustern folgenden Extravasation und die Bildung von Mikro-Metastasen zu untersuchen genutzt werden. Multiplex-Immunfärbung wurde verwendet,4T1, D2A1 und D2.OR Brusttumorzellen in der Leber zu erkennen, wenn sie vorhanden sind, als einzelne Zellen oder Mikro metastatischen Läsionen, wie H &amp; E nicht ausreichend ist, um die Anwesenheit von kleinen Läsionen zu bestätigen. 3A zeigt eine repräsentative Balb / c Mausleber mit einem putative micrometastatic Herde D2A1 Tumorzellen, die für das Epithel - Keratin CK18 positiv, negativ für die pan-Immunmarker CD45 und negativ für den Hepatozyten - Marker Heppar-1. Hepatozyten Fleck auch positiv für CK18, die Verwendung von Heppar-1 in dieser Färbung Platte erforderlich macht. Ein wichtiger Hinweis ist , dass Gallengang Epithel und Lebervorläuferzellen für CK18 positive beflecken, erfordern eine sorgfältige Unterscheidung zwischen Tumorzellen und Gallenwege, vor allem bei der Beurteilung periportalen Regionen (3A). Eine Alternative zu multiplexen Immunofluoreszenz einzelne disseminierte Zellen und micrometastatic Brennpunkte zu identifizieren syngenen Brusttumorlinien markiert mit enhanced green fluorescent zu nutzenProtein (eGFP) und / oder die Luciferase und führen IHC für das Tag (Abbildung 1C). Durch die Immunogenität von eGFP, Luciferase und andere Proteine, ist es wichtig , Mausmodelle zu verwenden , die gegen diese Proteine, wie zum Beispiel die neue immunkompetenten &quot;glühenden Kopf&quot; Maus tolerisiert werden , die eGFP und Luciferase in der vorderen Hypophyse 75 zum Ausdruck bringt. Zur Identifizierung von macrometastatic Läsionen von unmarkiert syngenen Linien wie die D2A1 Tumorlinie, die CK18 / Heppar-1 / CD45 - Multiplex - Immunfluoreszenz ist ideal (3B). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig1.jpg" /> Abbildung 1: Portal Veneninjektion liefert Tumorzellen direkt in die Leber. A) Portal Veneninjektion; Der Schnitt wird zwischen dem Median und linken Sagittalebene, von oberhalb der Ebene der vierten inguinal Brustdrüse Zitze und endet knapp unterhalb der ri gemachtb Käfig. B) Balb / c Leber mit PBS - Injektion (links). Folgende Tusche Injektion über die Pfortader der Leber (Mitte), aber nicht der Lunge (rechts) nimmt Tinte. C) Repräsentative dünne Schnittbilder von D2A1 Mauszellen - Brusttumor markiert mit GFP in einer Balb / c - Maus Leber bei 90 min nach der Injektion von 1 × 10 6 Tumorzellen über die Pfortader. Lebern wurden mit Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Anti-GFP-Antikörper zur Tumorzelldetektion gefärbt. Top Panel zeigt dunkelbraun gefärbten Tumorzellen (Pfeile) in der gesamten Leber verteilt, Sternchen bezeichnet unspezifische Hepatozyten Färbung um den zentralen Venen; Maßstabsbalken = 300 &amp; mgr; m. Untere Platten zeigen repräsentative Bilder von Tumorzellen bei 90 min nach der Injektion noch eng mit Gefäßsystem verbunden ist; Maßstabsbalken = 50 &amp; mgr; m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54903/54903fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54903/54903fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig2.jpg" /> Abbildung 2: Auswuchs von Maus - Mammatumorzelllinien in der Leber über Portal Veneninjektion. A) Kaplan-Meier - Kurve metastasenfreie Überlebensrate bei Mäusen zeigen , injiziert mit 2.000-10.000 4T1, D2A1 oder D2.OR Maus - Brusttumorzellen. Die Mäuse wurden mit Tumorzellen injiziert und auf Anzeichen von Metastasen einschließlich des Mangels an Pflege, blassen Augen überwacht und Gewichtsveränderungen. Metastase wurde zum Zeitpunkt der Obduktion und von H &amp; E auf histologischen Schnitten von der Leber bestätigt. N = 2 4T1 2000 Zellen; 2 4T1 10.000 Zellen. N = 2 D2A1 2000 Zellen; 3 D2A1 10.000 Zellen. N = 3 D2.OR 2000 Zellen; 3 D2.OR 10.000 Zellen. Representative H &amp; E - Bilder von B) 4T1 Läsionen bei 21 Tage nach der Injektion von 10.000 Zellen, C) D2A1 Läsionen bei 26 Tage nach der Injektion von 10.000 Tumorzellen, und D) D2.OR Läsionen an59 Tage nach der Injektion von 10.000 Zellen; Maßstabsbalken = 75 &amp; mgr; m. Ähnliche Läsionen beobachtet, wenn 2,000 4T1 oder D2A1 Tumorzellen injiziert wurden. Keine Läsionen wurden mit 2000 D2.OR Zellen nachgewiesen. Kein Nachweis von Metastasen in anderen Organen oder an der chirurgischen Einschnittstelle war in jeder Maus auf diesen Studien deutlich. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54903/54903fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54903/54903fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig3.jpg" /> Abbildung 3: Nachweis von Einzelzellen und Metastasen in der Mausleber mit Multiplex Immunofluoreszenz. A) Repräsentative multiplex Immunofluoreszenz von D2A1 Tumorzellen in einer Balb / c Mausleber bei 90 min nach der Injektion der Pfortader Injektionsmodell. Die Färbung wurde unter Verwendung eines Multiplex-Kit durchgeführt. Von links nach rechts zeigt DAPI; CD45 Leukozyten zu markieren; Heppar-1 mark Hepatozyten; und CK18 Tumorzellen, Hepatozyten und Gallengang Epithel zu markieren. Zusammengeführt Bild zeigt ein mutmaßliches Cluster von CK18 + Heppar-1 - CD45 - D2A1 Tumorzellen eng mit einem Portal Triade verbunden. Pfeil = D2A1 Tumorzellen, Stern = Gallengang Epithel; Maßstabsbalken = 25 &amp; mgr; m. B) Ein Vertreter offenkundigen D2A1 metastasiertem Läsion die gleiche Färbung Tafel wie in A. Tumorzellen unter Verwendung sind CK18 + während benachbarte Hepatozyten sind CK18 + Heppar-1 +; Maßstabsbalken = 25 &amp; mgr; m. Bilder wurden mit 20 x 0,8 auf einem Mikroskop aufgenommenen, 40 x 1,3 und 60 x 1.4 Ziele und CCD-Kamera, die Mikroskop-Software. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54903/54903fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54903/54903fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Ein Portal Veneninjektion Modell zur Untersuchung der Leber Metastasierung von Brustkrebs

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

40.3K Aufrufe.  Oregon Health and Science University. A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver. 

Serie: A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Intra-Beckenarterie Injection für effiziente und selektive Modellierung von Mikroskopische Knochenmetastasen

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Forschung

Krebsforschung

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. However, little is known about the heterogeneity of liver metastases, and animal models capable of evaluating the development of individual metastatic colonies are needed. Here, we present an advanced model of hepatic metastases that provides the ability to quantitatively visualize the development of individual tumor clones in the liver and estimate their growth kinetics and colonization efficiency. We generated a panel of monoclonal derivatives of HCT116 human colorectal cancer cells stably labeled with luciferase and tdTomato and possessing different growth properties. With a splenic injection followed by a splenectomy, the majority of these clones are able to generate hepatic metastases, but with different frequencies of colonization and varying growth rates. Using the In Vivo&#160;Imaging System (IVIS), it is possible to visualize and quantify metastasis development with in vivo luminescent and ex vivo fluorescent imaging. In addition, Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) provides a 3D distribution of liver metastases in vivo. Ex vivo fluorescent imaging of harvested livers provides quantitative measurements of individual hepatic metastatic colonies, allowing for the evaluation of the frequency of liver colonization and the growth kinetics of metastases. Since the model is similar to clinically observed liver metastases, it can serve as a modality for detecting genes associated with liver metastasis and for testing potential ablative or adjuvant treatments for liver metastatic disease.

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Erweiterte Tiermodell für Colorectal Metastase in der Leber: Imaging-Techniken und Eigenschaften des metastasierten Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. Recently, impressive advances in novel therapies have dramatically prolonged survival and improved quality of life for many cancer patients. Sadly, incidence of brain metastatic recurrences is fast rising, and all current therapies are merely palliative. Hence, good experimental animal models are urgently needed to facilitate in-depth studies of the disease biology and to assess novel therapeutic regimens for preclinical evaluation. However, the standard in vivo metastasis assay via tail vein injection of cancer cells produces predominantly lung metastatic lesions; animals usually succumb to the lung tumor burden before any meaningful outgrowth of brain metastasis. Intracardiac injection of tumor cells produces metastatic lesions to multiple organ sites including the brain; however, the variability of tumor growth produced with this model is large, dampening its utility in evaluating therapeutic efficacy. To generate reliable and consistent animal models for brain metastasis study, here we describe a procedure for producing experimental brain metastasis in the house mouse (Mus musculus) via intracarotid injection of tumor cells. This approach allows one to produce large number of brain metastasis-bearing mice with similar growth and mortality characteristics, thus facilitating research efforts to study basic biological mechanisms and to assess novel therapeutic agents.

Brain metastasis has become an urgent unmet medical need as its incidence has increased while therapeutic options have remained palliative. Creating experimental animal models of brain metastasis via intracarotid arterial injection of cancer cells facilitates mechanistic studies of the disease biology and evaluation of novel intervention regimens.

Intracarotid Cancer Cell Injection zu produzieren Mausmodelle von Hirnmetastase

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

Azelluläre und zellulären Lunge Modell Tumor Metastasen zu studieren

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Pathologische Analyse der Lungenmetastasierung nach lateraler Schwanzveneninjektion von Tumorzellen

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Using Computer-based Image Analysis to Improve Quantification of Lung Metastasis in the 4T1 Breast Cancer Model

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. The leading cause of breast cancer related deaths is the metastatic burden. Therefore, preclinical models for breast cancer need to analyze metastatic burden to be clinically relevant. The 4T1 breast cancer model provides a spontaneously-metastasizing, quantifiable mouse model for stage IV human breast cancer. However, most 4T1 protocols quantify the metastatic burden by manually counting stained colonies on tissue culture plates. While this is sufficient for tissues with lower metastatic burden, human error in manual counting causes inconsistent and variable results when plates are confluent and difficult to count. This method offers a computer-based solution to human counting error. Here, we evaluate the protocol using the lung, a highly metastatic tissue in the 4T1 model. Images of methylene blue-stained plates are acquired and uploaded for analysis in Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ then determines the percentage of the selected area of the image that is blue, representing the percentage of the plate with metastatic burden. This computer-based approach offers more consistent and expeditious results than manual counting or histopathological evaluation for highly metastatic tissues. The consistency of Fiji-ImageJ results depends on the quality of the image. Slight variations in results between images can occur, thus it is recommended that multiple images are taken and results averaged. Despite its minimal limitations, this method is an improvement to quantifying metastatic burden in the lung by offering consistent and rapid results.

We describe a more consistent and expeditious method to quantify lung metastasis in the 4T1 breast cancer model by using Fiji-ImageJ.

Verwendung computerbasierter Bildanalyse zur Verbesserung der Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell

Breast cancer is a devastating malignancy, accounting for 40,000 female deaths and 30% of new female cancer diagnoses in the United States in 2019 alone. ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers that cause LMD are breast and lung cancers and melanoma. Patients diagnosed with LMD have a very poor prognosis and generally survive for only a few weeks or months. One possible reason for the lack of efficacy of systemic therapy against LMD is the failure to achieve therapeutically effective concentrations of drug in the CSF because of an intact and relatively impermeable blood-brain barrier (BBB) or blood-CSF barrier across the choroid plexus. Therefore, directly administering drugs intrathecally or intraventricularly may overcome these barriers. This group has developed a model that allows for the effective delivery of therapeutics (i.e., drugs, antibodies, and cellular therapies) chronically and the repeated sampling of CSF to determine drug concentrations and target modulation in the CSF (when the tumor microenvironment is targeted in mice). The model is the murine equivalent of a magnetic resonance imaging-compatible Ommaya reservoir, which is used clinically. This model, which is affixed to the skull, has been designated as the &#34;Murine Ommaya.&#34; As a therapeutic proof of concept, human epidermal growth factor receptor 2 antibodies (clone 7.16.4) were delivered into the CSF via the Murine Ommaya to treat mice with LMD from human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. The Murine Ommaya increases the efficiency of drug delivery using a miniature access port and prevents the wastage of excess drug; it does not interfere with CSF sampling for molecular and immunological studies. The Murine Ommaya is useful for testing novel therapeutics in experimental models of LMD.

Here, we describe a murine xenograft model that functionally resembles an Ommaya reservoir in patients. We developed the Murine Ommaya to study novel therapeutics for the universally fatal leptomeningeal disease.

Ein murines Ommaya Xenograft-Modell zur Untersuchung der direkten zielgerichteten Therapie von Leptomeningealerkrankungen

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are diagnosed with brain metastases each year. Significant progress has been made in improving survival outcomes for patients with primary breast cancer and systemic malignancies; however, the dismal prognosis for patients with clinical brain metastases highlights the urgent need to develop novel therapeutic agents and strategies against this deadly disease. The lack of suitable experimental models has been one of the major hurdles impeding advancement of our understanding of brain metastasis biology and treatment. Herein, we describe a xenograft mouse model of brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified cell line derived from inflammatory breast cancer (IBC), a rare and aggressive form of breast cancer. Cells were labeled with firefly luciferase and green fluorescence protein to monitor brain metastasis, and quantified metastatic burden by bioluminescence imaging, fluorescent stereomicroscopy, and histologic evaluation. Mice robustly and consistently develop brain metastases, allowing investigation of key mediators in the metastatic process and the development of preclinical testing of new treatment strategies.

We describe a xenograft mouse model of breast cancer brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified inflammatory breast cancer cell line.

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...