Wir danken M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet und A. Devin für ihre Hilfe und Kommentare zum Manuskript. Wir sind dankbar, dass die elektronische Abbildungs ​​Pol Bordeaux Imaging Center, wo die Bilder aufgenommen wurden. Diese Arbeit wurde von Centre National de la Recherche Scientifique unterstützt.

1. Herstellung von Formvar Grid Film HINWEIS: Führen Sie Chloroform Manipulation unter einer Abzugshaube persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Kittel, Brille). Verwenden Sie 400 mesh Elektronenmikroskopie Kupfergitter. Mit anderen Netztypen (andere Maschengrößen, Gold und Nickel Grids), ist die Qualität des Einfrierens schlechter. <ol><li> Vorbereiten einer 100 ml-Lösung von 0,3% Formvar in Chloroform. Lassen Sie es über Nacht ohne Rühren auflösen. </li><li> Setzen 400 Mesh (Anzahl der Löcher pro Quadratzoll) Elektronen microscopycopper Gitter (Durchmesser 3,05 mm) in einem Glasfläschchen (Höhe und 3 cm Durchmesser 2 cm) mit Aceton. Rührt das Glasfläschchen mit einer kreisförmigen Bewegung der Hand. Entfernen des Acetons mit einer Kunststoff-Transferpipette. Das Lösungsmittel für 5 min zu verdampfen. Übertragen, die Gitter, indem sie auf ein Filterpapier gegossen, und es ihnen ermöglichen, für 5 Minuten zu trocknen. </li><li> Polier ein 76 x 26 mm 2 Glasträger indem sie mit einem fusselfreien Tuch , bis glänzend / rutschigem Abwischen.</li><li> Nimm einen Kristallisator (Durchmesser 15 cm, Höhe: 7 cm und Kapazität 1200 ml) und fülle mit destilliertem Wasser bis zum Rande. Reinigen der Wasseroberfläche durch einen Glasstab über die Oberfläche verläuft zweimal Staub zu entfernen. </li><li> Halten Sie die Glasobjektträger zwischen zwei Fingern und tauchen sie in die Formvar-Lösung für einige Sekunden. Halten Sie es aufrecht unter einem Upside-Down-Becher für 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Wenn der Film trocken ist, mit einer scharfen Rasierklinge, die Ränder der Glasträger punkten die Grenzen des Films zu definieren, von der Folie abgelöst werden. </li><li> Atmen Sie tief ein und ausatmen stark auf die Folie eine Schicht aus Wasserdampf erhalten auf und unter dem Film den Film leicht opak und verbessern die Sichtbarkeit zu machen. <ol><li> Unmittelbar schwebt die Folie auf die Kristallisator Wasseroberfläche durch den unteren Rand der Folie mit einem Winkel von etwa 30 ° zu berühren. Lassen Sie den Film Freigabe von der Rutsche und schälen sie auf den Kristallisator Wasseroberfläche ab. Ziehen Sie den Film mit der ausPinzette, falls erforderlich. </li></ol></li><li> Sanft lag die Gitter auf dem Film in den Bereichen auf der Wasseroberfläche schwimmenden Seite nach unten, die von der richtigen Dicke (etwa 10 nm) und ohne Falten sind. </li><li> Nimm den Film durch Abdecken der Gitter mit Joseph Papier , wie sie auf der Kristallisator Wasseroberfläche schwimmen. <ol><li> das Joseph-Papier mit einer Hand zu halten, ist ein Ende des Joseph Papier zu einem Ende des Films berühren. Warten Sie, bis das Joseph Papier vollständig nass ist. Entfernen Sie die Joseph-Papier mit den Gittern aufgeklebt. </li></ol></li><li> Platzieren Sie die Gitter für 24 h in einer bedeckten Petrischale für die endgültige Trocknung und Lagerung vor bei Raumtemperatur verwenden. </li></ol> 2. Herstellung von Gefriersubstitution Medium HINWEIS: Osmiumtetroxid (OsO 4) und Uranylacetat sind gefährliche Chemikalien. Behandeln Sie sie im Abzug, während geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen (PSA) mit einem Laborkittel und Handschuhe. Follow Sicherheitswarnungen für die Handhabung (OsO 4) und Uranylacetat. Verwendung von O-Ring - Kryoröhrchen die Leckage von OsO 4 zu vermeiden. <ol><li> Elektronenmikroskopische Untersuchungen <ol><li> Setzen Glas OsO 4 Ampulle in einem Glaskolben. </li><li> Brechen Sie die Ampulle durch Schütteln des Kolbens. </li><li> Hinzufügen einer geeigneten Volumen Aceton 100% 4% Endkonzentration zu erhalten. </li><li> Umrühren und verteilen 1,5 ml Aliquots in 1,8 ml Kryoröhrchen. </li></ol></li><li> Protein Immunmarkierung <ol><li> Platzieren 0,05 g Uranylacetat in einem Glaskolben. </li><li> In 50 ml 100% Aceton. </li><li> Man rührt die Lösung mit einem Magnetrührer gerührt. Wenn die Lösung klar wird, filtern sie einen 0,2 um-Filter. </li><li> Dispense 1,5 ml Aliquots in 1,8 ml Kryoröhrchen. HINWEIS: Bereiten Sie die Kryoröhrchen Gefriersubstitution enthaltenden Medium vor dem Tauchgefrierverfahren und halten sie in -84 ° C Gefrierschrank. Kehren Sie die Glaskolben wegzuwerfen dieOsO 4 Ampulle in den Sondermüll. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Zellen HINWEIS: Dieser Schritt ist für den Erfolg des Verfahrens kritisch ist. Für alle Zelltypen, wachsen Zellen, die die angegebene Anzahl von Zellen zu erhalten. Zentrifuge in dem angegebenen Rohr zu der angegebenen Zeit und Geschwindigkeit. <ol><li> Um die geeignete Konsistenz der Pellets aus verschiedenen Zelltypen zu erhalten, wachsen Zellen wie folgt: <ol><li> Für Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe, Beimpfung von Hefe in 5 ml Minimal oder vollständigen flüssigen Mediums. über Nacht bei 28 ° C inkubieren, Drehen (180 Upm). Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) der Übernachtkultur. Verdünnte Hefezellen bis zu einer OD 600 von 0,2 in 50 ml frischem selektivem Medium. Weiter zu Zellen bei 28 ° C inkubieren, Drehen , um 1 x 10 9 7 Hefezellen. </li><li> Für Leishmania flagellum, inoculate Parasiten in 5 ml AM-Medium mit 7,5% FCS (fötales Kälberserum). über Nacht bei 24 ° C inkubieren, Drehen (180 Upm). Messen Sie die OD 600 der Kultur über Nacht. Verdünnte Parasitenzellen bis zu einer OD 600 von 0,2 in 50 ml frischem selektivem Medium. Weiter zu Zellen bei 24 ° C inkubieren, Drehen , um 5 x 10 8 Parasitenzellen 12. </li><li> Für Trypanosoma brucei, Beimpfung von Parasiten in 5 ml SDM-79 - Medium mit 10% FCS und 30 &amp; mgr; g / ml Hygromycin. über Nacht bei 27 ° C inkubieren, Drehen (180 Upm). Messen Sie die OD 600 der Kultur über Nacht. Verdünnte Parasitenzellen bis zu einer OD 600 von 0,2 in 50 ml frischem Selektivmedium. Weiterhin Zellen bei 27 ° C inkubieren, Drehen , um 5 × 10 8 Zellen 13 Parasiten. </li><li> Für Escherichia coli, Beimpfung von Bakterien in 5 ml DYT - Medium mit 100 ug / ml Ampicillin enthält. über Nacht bei 37 ° C inkubieren, Drehen (180rpm). Messen Sie die OD 600 der Kultur über Nacht. Verdünnte Bakterienzellen auf einen OD 600 von 0,2 in 50 ml frischem selektivem Medium. Weiter zu Zellen bei 37 ° C inkubieren, Drehen , um 5 × 10 10 Bakterienzellen 14. HINWEIS: Nach Inkubation über Nacht wurden Zellen in Kultur können in entweder logarithmisch oder stationären Wachstumsphase sein. Sehr langsam wachsende Zellstämme können Inkubationszeiten länger als eine Nacht oder Impfung von einer größeren Anzahl von Zellen erfordern, wie empirisch ermittelt. </li></ol></li><li> Für alle Zelltypen, übertragen das Kulturmedium, die Zellen zu 50 ml Polypropylen-Röhrchen und zentrifugiert für 3 min bei 1.500 x g enthält. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und das Pellet aller Zelltypen in 1 ml der jeweiligen Zellkulturmedium. </li><li> Zentrifuge alle Zelltypen in einem Mikrozentrifugenröhrchen für 1 min bei 3.900 x g. vollständig entfernen Sie den Überstand. </li><li> Halten Sie die Zellen auf Eis. </li></ol> Hinweis: Die beim Umgang mit flüssigem Stickstoff mit Vorsicht. Persönliche Schutzausrüstung einschließlich cryogloves und Brillen. Propan ist potentiell explosiv, so führt die Verflüssigung in einem gut belüfteten Raum oder unter einer Abzugshaube. Kein offenes Feuer ist nicht erlaubt. <ol><li> Setzen etwa 150 ml flüssiger Stickstoff in einer Polystyrolschale. Legen Sie eine Messingbecher (Höhe 3,6 cm, Durchmesser 2 cm und Dicke 1,5 mm) in flüssigem Stickstoff sie einzufrieren. Nicht der flüssige Stickstoff in die Messingbecher eindringen lassen. </li><li> Warten Sie, bis die Blasen sicher sein abklingen, dass die Messingbecher eingefroren. </li><li> Setzen Sie den Schlauch an die Propangasflasche in Kontakt mit der Messing Topfwandung verbunden. </li><li> öffnen sanft das Propan Flaschenventil. HINWEIS: Bei diesem Schritt verflüssigt das Propan in den Messingbecher. </li><li> Stoppen Sie die Verflüssigung des Propan Flaschenventil schließen und schnell den Gasschlauch zu entfernen. </li><li> Füllen Sie das Polystyrolschale mit flüssigem nitrogen bis zu 5 mm von der Oberseite der Messingbecher. Nicht der flüssige Stickstoff in Messingbecher eindringen lassen. </li></ol> 5. Plunge Einfrieren der Probe <ol><li> Setzen etwa 200 ml flüssiger Stickstoff in Polystyrolschale. Gefriert kleine Messingbecher (Höhe 1,5 cm Durchmesser 2,5 cm und Dicke 1 mm), indem sie in flüssigem Stickstoff setzen. Legen Sie eine Tasse für eine Suspensionszellprobe. Achten Sie darauf, Proben zu mischen. Zu diesem Zweck setzte die Probe 1 in der Tasse 1, Probe 2 in Becher 2 usw. </li><li> Frieren der Pinzette durch ihre Spitze in flüssigem Stickstoff eintauchen. </li><li> Tauchen einer Doppelkante Präpariernadel im Pellet in 3,5 erhalten. </li><li> Mit einer Pinzette ergreifen ein 400 mesh Kupfergitter Mikroskopie mit Formvar in Abschnitt 1 hergestellt, beschichtet. </li><li> Unter Verwendung des Präpariernadel, einen Tropfen des Pellets in 3,5 auf dem Gitter erhalten wird. Probieren Sie verschiedene Tropfengrößen (zB 2, 5 und 10 &amp; mgr; l). </li><li> Sehr schnell das Gitter durch die Pinzette in flüssiges Propan Gene gehalten stürzenin Abschnitt 4 und rühren das Gitter mit kreisförmiger Bewegung für einige Sekunden bewertet. </li><li> Schnell überträgt das gefrorene Gitter mit der Pinzette in die kleinen Messingbecher in Abschnitt 5.1 eingefroren. HINWEIS: Für jede Probe macht mindestens 3 Gitter. Immer die Pinzette einfrieren, bevor ein Kupfernetz nehmen. </li></ol> 6. Gefriersubstitution HINWEIS: Osmiumtetroxid ist möglicherweise volatil, so mit Dampf Patronen ein Luftfiltergerät verwenden. das Fixiermittel in flüssigem Stickstoff vor dem Eintauchen Einfrieren Einfrieren ist ebenfalls eine Lösung. <ol><li> Für Ultra Studien, öffnet die 1,8 ml Kryoröhrchen Röhren gefrierSubstitutionsMedium in Abschnitt 2.1 enthalten, hergestellt. Für Immunolokalisation Studien, öffnet die 1,8 ml Kryoröhrchen Röhren gefrierSubstitutionsMedium in Abschnitt 2.2 enthalten, hergestellt. Setzen Sie die Kappe auf dem Kryovials. </li><li> Frieren der Pinzette durch ihre Spitze in flüssigem Stickstoff eintauchen. </li><li> Schnell die Kappe entfernen und die gefrorenen Gitter i übertragennde Kryovials mit der Pinzette. </li><li> Setzen Sie die Kappe wieder auf dem Kryovials. </li><li> Wiederholen Sie die Operation für jedes Raster von jeder Probe. </li><li> Schließen Sie alle Kappen und rühren Sie die Kryoröhrchen mit einer kreisförmigen Bewegung der Hand der Proben, um sicherzustellen, in dem Gefriertsubstitutionsmedium sind. </li><li> Platzieren Sie die Kryoröhrchen in einem luftdichten Kasten 3 Tage lang in einem -84 ° C-Gefrierschrank während des Gefriertsubstitutionsprozesses. </li></ol> 7. Proben Warming <ol><li> Ultra Studien <ol><li> Trägt die Kryoröhrchen in einer Polystyrol-Schale (ein plötzliches Ansteigen der Temperatur zu vermeiden) auf eine -30 ° C Gefrierschrank. Legen Sie sie in der -30 ° C Gefrierschrank für 1 h. </li><li> Platzieren Sie die Kryoröhrchen in einen -15 ° C Gefrierschrank für 2 h. Platzieren Sie die Proben bei 4 ° C für 2 h und dann 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen des Einfrierens Substitutionsmedium mit einer Kunststoff-Transferpipette. In etwa 500 &amp; mgr; l 100% Aceton. </li><li> Rühre das 1,8 ml Kryoröhrchenmit einer kreisförmigen Bewegung der Hand und gießt das schnell Aceton (1,5 ml), die Gitter in einem Glasfläschchen (Höhe und 3 cm Durchmesser 2 cm) enthält. </li><li> Spülen Sie die gleiche Cryovial mit 1 ml 100% Aceton sicher sein, alle Netze zu übertragen haben. Rühren Sie die Kryoröhrchen mit einer kreisförmigen Bewegung der Hand und schütten den Inhalt der Kryoröhrchen in einen Glaskolben. </li><li> Spülen jedes Glasfläschchen mit 3 ml 100% igem Aceton 3 Mal für 10 min. </li><li> Folgen der Einbettung und Inklusion Verfahren wie in Referenz 15 beschrieben. Imprägnieren, um die Probe mit Konzentrationen von Epoxidharz in Aceton (25%, 50% und 75%) und Einbetten die Probe mit 100% Epoxidharz in Gelatinekapseln zu erhöhen. </li></ol></li><li> Immunmarkierung Studien <ol><li> Tragen die 1,8 ml Kryoröhrchen in einer Polystyrolschale mit dem -30 ° C Gefrierschrank (ein plötzliches Ansteigen der Temperatur zu vermeiden). </li><li> Platzieren Sie die Kryoröhrchen für 2 h in einem -30 ° C-Gefrierschrank. </li><li> In einem -30 °<html> C Gefrierschrank, rührt die Kryoröhrchen mit einer kreisförmigen Bewegung der Hand und schnell das Gefriertsubstitutionsmedium in einer Polypropylenampulle (Höhe 5 cm und Durchmesser 1,5 cm) gießen. </li><li> Ersetzen des Einfrierens Substitutions Medium mit 2 ml frischem gefrierSubstitutionsMedium. </li><li> Platzieren Sie die Polypropylenfläschchen für 2 h in einem -30 ° C-Gefrierschrank. </li><li> Spülen Sie das Polypropylenfläschchen für 1 h mit 2 ml 100% igem Aceton und dreimal für 1 h mit 2 ml 100% igem Ethanol. </li><li> Folgen der Einbettung und Inklusion Verfahren wie in Referenz 15 beschrieben. Imprägnieren, um die Probe mit steigenden Konzentrationen von Acrylharz (25%, 50% und 75% in Aceton) und Einbetten die Probe mit 100% Acrylharz in Gelatinekapseln. </li></ol></li></ol> 8. Visualization of Samples <ol><li> Nach dem Einbetten, stellt 80 nm ultra-dünne Schnitte der Proben mit einem Ultramikrotom. Kontrast, um die Abschnitte mit 2% Bleicitrat bei Raumtemperatur für 1 minass = &quot;xref&quot;&gt; 15. </li><li> Verwenden , um ein 80 kV oder 120 kV Elektronenmikroskops die Abschnitte 15 zu beobachten. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

TEM ist eine leistungsfähige Methode für die ultrastrukturelle Beobachtung von Organellen, Zellen und Geweben. Kryofixierung / Gefrier-Substitution ist derzeit die beste Methode zur Erhaltung der Ultrastruktur- und Protein-Antigenität. Chemische Fixiermittel durchdringen und wirken sehr langsam, wodurch strukturelle Umlagerungen vor der vollständigen Stabilisierung der Ultrastruktur 2 möglich sind . Umgekehrt stabilisiert die Kryofixierung / Gefrier-Substitution sofort die Zellstrukturen 4 . Jedoch umfassen Kryofixierungs- / Gefrier-Substitutionstechniken eine Anzahl von Beschränkungen und Schwierigkeiten, wodurch ihr Anwendungsbereich eingeschränkt wird. Hierbei handelt es sich um Probe, Einfrieren von Artefakten, Realisierung der Technik, Kosten und Ausrüstung. Die Hochdruck-Gefrier- / Gefrier-Substitutionstechnik ermöglichte ein hohes Maß an Konservierung der Zelldetails 6 , 7 . Im Gegensatz dazu wird PF bereits für obs verwendeterving kleine Objekte auf dünne Filme aus amorphem Eis suspendiert 9. Hier PF / Gefriersubstitutionsmethode für ultrastrukturelle und Immunmarkierung Studien liefert qualitativ hochwertige Bilder von Hefen, Parasiten und Bakterien-Ultra vergleichbar mit Hochdruck Einfrieren Bildern. Fixation Qualität hängt von Abkühlraten 18. Bei hohen Kühlraten, ist Wasser im Glaszustand und zeigt keine sichtbare Kristallstruktur an der Elektronenmikroskopie Ebene. Die Vitrifikation findet nur in einer sehr dünnen Oberflächenschicht (200 &amp; mgr; m im Allgemeinen) und damit gutes Dickes Einfrieren allmählich von der Oberfläche der Probe zu den inneren Schichten 4 abnimmt. In Pflanzenzellen, Wachsbeschichtung oder mit Gas gefüllten Räume kann die Kühlraten verlangsamen. Mit PF überraschenderweise wurde keine Abnahme der Qualität des Einfrierens Leistung beobachtet. In allen Experimenten ist der Anteil von gut gefrorenen Zellen g<html> rößere als 50%. Dieser Anteil variiert zwischen 50% bis mehr als 90% und ist abhängig von verschiedenen Parametern (Kulturmedium, physiologischer Zustand der Zellen, Außentemperatur und Feuchtigkeit). Wie oben erwähnt, zerstört die Bildung von Eiskristallen, die Zellstruktur und Eiskristalle sind besonders sichtbar in Vakuolen. Im PF / Gefriersubstitutionsprozess muss besonderes Augenmerk auf die Gefriertemperatur bezahlt werden. Das gefrierSubstitutionsSchritt darf nicht über -82 ° C, sonst durchgeführt werden, das glasig Wasser in kristallines Wasser umgewandelt werden. Um die Bildung von Eiskristallen Schäden zu vermeiden, wird derzeit Gefrierschutzmittel verwendet, aber das führt zu Veränderungen in der Ultrastruktur der Zellen 19. Hefe, Bakterien und Parasiten Nährböden könnte eine Komponente enthalten, die Gefrierschutzmittel ist. In diesem Zusammenhang wurde beschlossen, keine zusätzlichen Gefrierschutzmittel zu verwenden, um so nah wie möglich an den eigentlichen zellulären Zustand zu sein. ve_content &quot;&gt; Der Erfolg der PF / Gefriersubstitution, hängt von vielen kritischen Schritten während der Entwicklungsphase des Verfahrens. Zunächst wird ein kritischer Punkt ist die geeignete Konsistenz der Pellets zu erhalten. Das Pellet nach Zentrifugation erhalten muß kompakt genug sein gerollt werden out auf einem Elektronenmikroskopie Raster. wenn das Pellet zu kompakt ist, kann die Gefriertsubstitutionslösung nicht den Tropfen eindringen, und die Ultra nicht werden gut erhalten. Umgekehrt, wenn das Pellet nicht kompakt genug ist, kann die übrig gebliebenen Kulturmedium entwickeln Eiskristalle und die Ultrastruktur der Zelle beeinträchtigen. um die geeignete Konsistenz der Pellets aus den verschiedenen Zelltypen zu erhalten, ist es notwendig, die Kulturbedingungen zu respektieren die angegebene Anzahl von Zellen und Zentrifugation Parameter im Protokoll angegeben zu erhalten (siehe oben) für alle Zelltypen. Allerdings ist die Menge des Materials auf dem Kupfernetz setzt nicht kritisch. Verschiedene Tröpfchengrößen getestet werden können. Zweitens tha der Gittertypt verwendet wird, als Träger von Bedeutung ist. Mehrere Gold, Nickel und Kupfergitter mit unterschiedlichen Maschenweiten wurden getestet. Die besten Ergebnisse wurden mit einem 400 Mesh-Kupfergitter mit dünnen Stangen erhalten. Drittens, im Hinblick auf die Gefrierstufe wird ein Messingbecher bevorzugt, die Propan zu verflüssigen. Flüssiges Propan in Kupferbecher neigt zum Einfrieren und damit das Experiment verkompliziert. Schließlich muss der Manipulator arbeitet schnell und unter kalten Bedingungen versehentliche Probe Warm-up zu vermeiden. Wenn es geschieht, muss die Probe verworfen werden. Zum Beispiel Probe Erwärmung zu verhindern, muß die Pinzette vorgekühlt werden, bevor sie und die Gefriersubstitution Medium muss gut voran vor dem Verfahren hergestellt werden. Gekühlte Pinzette muss auch während des Tauchgefrierprozess becauseif den Sprung Einfrieren verwendet werden, wird realisiert, ohne die Pinzette Einfrieren, viel Rauch Formen wie die Pinzette in der Propan (aufgrund der Wärme / Kälte-Austausch) getaucht werden. Dies hat zwangsläufig Auswirkungen auf die Kühlraten. Tests mit samplEs gefroren mit ungefrorenen Pinzetten scheinen nicht richtig eingefroren zu sein. Darüber hinaus erfordert die Verwendung von gefährlichen Chemikalien wie O S O 4 und Uranylacetat im Gefriersubstitutionsmedium bei der Herstellung von Lösungen und Gefriersubstitutionsprozess unter der Dunstabzugshaube mit ausreichendem PPE. Um das Auslaufen von OsO 4 und das Einatmen von Dämpfen zu verhindern, müssen die Kryovials einen harten O-Ring haben, um sicherzustellen, dass die Röhrchen während des Gefrierersatzes versiegelt bleiben. Um eine unnötige Exposition gegenüber Osmiumdampf während der Herstellung des Gefriersubstitutionsmediums zu verhindern, kann die OsO 4 Ampulle in einem Glaskolben gebrochen werden. Das Vorhandensein von Glasscherben in dem Harzblock nach dem Einschluss kann vermieden werden, indem feindrähtige Transferpipetten während der Acetonspülung und die Einbettungsschritte verwendet werden. Durchführen des Einschlussschritts unter einer Binokularschleife und die Realisierung von halbdünnen Abschnitten ermöglicht auch die Überprüfung, dass es keine Glasscherben gibt.Wenn die Versuche nicht unter einer Abzugshaube (insbesondere in der ersten Stufe des Gefriertsubstitutionsprozesses) durchgeführt werden, ein Luftfiltergerät mit Dampf Patronen verwenden. Der Manipulator muss auch vorsichtig sein, wenn sie in kalten Bedingungen mit flüssigem Stickstoff oder während des Gefrierens Schritten arbeiten. Die Verwendung von Handschuhen und Brille empfohlen. Weiterhin Propan ist potentiell explosiv, so dass die Verflüssigung in einem gut belüfteten Raum oder unter einer Abzugshaube und keine offenen Flammen dürfen ausgeführt werden müssen. Mehrere Artikel zeigten, dass mit der HPF - Technik auf einer Vielzahl von Proben , wie zum Beispiel Hirngewebe, Efeublatt oder Wurzelspitzen von A. thaliana und N. benthamiana, ist die Erhaltung der Ultrastruktur verbessert im Vergleich zur chemischen Fixierung 20, 21. Mit PF wurden die Experimente an Zellen in Suspension durchgeführt. Daher gibt es keine Anzeichen für den Erfolg dieser Technik auf larger Proben wie Gewebe. Weitere Experimente müssen durchgeführt werden, diesen Punkt anzusprechen. Allerdings wurde das Verfahren erfolgreich mit Fadenpilz Podospora anserina getestet , die nicht isolierter Zellen sind , sondern eher von Myzel Form 22. Das Verfahren in diesem Artikel vorgestellten stellt eine signifikante Verbesserung gegenüber den derzeitigen Methoden der chemischen Fixierung oder HPF. Zum Beispiel nicht PF 23 teure Geräte oder Verbrauchsmaterialien im Gegensatz zu HPF erfordern. Es ist auch darauf genommen werden, da die HPF-Technik eine große Menge an flüssigem Stickstoff (ca. 80 l pro Experiment) verwendet. Mit der Technik vorgeschlagen, ist ein großer Vorteil , dass keine wichtige Ausrüstung 23 notwendig ist. Somit sind die Kosten eines Experiments deutlich niedriger (etwa hundertmal billiger). Ein weiterer Vorteil ist, dass kein besonderes Know-how erforderlich ist, weil die Technik ist einfach zu bedienen. Außerdem o der Probenverarbeitungf PF / Gefriersubstitution ist viel kürzer als HPF / Gefriersubstitution aufgrund des Erwärmungsprozesses, der 24 weniger als 6 h statt 24 h dauert. Es ist nicht mehr Zeit in Anspruch als die herkömmliche chemische Fixierung. Der Vorteil besteht darin, dass die zelluläre Ultra perfekt mit minimalen Artefakten und ist viel näher an die Zellen ursprünglichen Zustand erhalten wird. Die Anwendung dieser Technologie wird sicherlich von Nutzen sein , verschiedene schnelle biologische Ereignisse zu untersuchen oder Proteine , die für Zellen mit hoher Auflösung zu lokalisieren 22 in Suspension und für Proben von wenigen Mikrometern Dicke, wie Pilzhyphen wachsen gelassen.

Die Probenvorbereitung ist für den Erfolg eines jeden Elektronenmikroskopie Studie kritisch. Herkömmliche EM Fixierung war die primäre Methode für Gewebe oder Zellen für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 1 fixiert. Erstens, Aldehyde und Osmiumtetroxid verwendet werden, um chemisch das Material bei Raumtemperatur fest. Dann wird das Material mit organischen Lösemitteln dehydratisiert, infiltriert und in Epoxyharz eingebettet. Dieses Verfahren ist auf die Penetrationsrate von Fixierungsmittel in die Zelle abhängig. Folglich werden die Artefakte und Extraktion von Zellinhalt in der Regel 2 beobachtet. Kryofixation ist eindeutig eine bessere Alternative für die Erhaltung der Zellstrukturen 3, sie intakt zu halten. Die höchste Qualität der TEM - Aufnahmen 4 in dünnen Harzabschnitte können mit Hilfe der Kryofixation / Gefriersubstitution Verfahren erhalten werden. Das Ziel dieser Technik ist verglast bi zu erhaltengischen Proben ohne Eiskristalle Bildung oder Eiskristalle enthalten klein genug, um nicht die Ultrastruktur der Zellen zu beschädigen. Hochdruck-Gefrieren (HPF) und ultra-schnelle Kryofixation, die auch plunge Gefrieren (PF) genannt wird, sind zwei Methoden Proben cryofix. HPF bewegungsunfähig Moleküle in der Zelle augenblicklich und vermeidet die durch herkömmliche EM Fixierung verursacht wird. Verschiedene Arten von Gefriermaschinen und automatische Substitution Geräte wurden 5 entwickelt. Die Gefriermaschinen und Verbrauchsmaterialien (flüssiger Stickstoff, Probenträger, etc.) sind teuer, aber sie ermöglichen die Herstellung qualitativ hochwertige elektronenmikroskopische Aufnahmen 6, 7. PF ist eine Technik , die in den frühen 1950er Jahren verwendet wurde und wird in der Literatur als einfach und billig 8 .Während die PF Verfahren, die vorbereitete Probe mit einer schnellen Rate eingefroren wird beschrieben Eiskristalle Größe von weniger als 3 bis 5 nm zu erhalten. Zu diesem Zweck wird die ProbeIn ein flüssiges Kryogen, wie Ethan, Propan oder ein Ethan-Propan-Gemisch eingetaucht. Seit den 1950er Jahren wurden Verbesserungen von PF durchgeführt, um diese Technik einer größeren Anzahl von Benutzern zur Verfügung zu stellen. Hochdruckgefrieren ist derzeit der einzige lebensfähige Weg, um eine große Vielfalt von Proben dicker als 50 μm (bis zu einer Dicke von 200 μm für scheibenförmige Proben) 5 , während PF weit verbreitet ist, um kleine Objekte (&lt;100 nm ), Wie makromolekulare Komplexe, die in einem dünnen Film aus amorphem Eis 9 suspendiert sind. Größere Proben, beispielsweise eukaryotische Zellen, können durch PF kryofixiert werden, benötigen aber Probenhalter, wie Kapillarkupferrohre oder Sandwich-Systeme 8 , 10 , 11 . Hier wird eine schnelle, einfach zu bedienende und kostengünstige Einfrier- / Gefrier-Substitutionstechnologie vorgestellt, die für verschiedene Suspensionszellkulturen verwendbar ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="849">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Grids</td>
			<td style="width:213px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:171px;">T400-Cu</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Formvar</td>
			<td style="width:213px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:171px;">15800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Propane N35</td>
			<td style="width:213px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:213px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Double edge dissecting needle</td>
			<td style="width:213px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:171px;">72947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cryovials</td>
			<td style="width:213px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:171px;">61802-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Osmium tetroxide</td>
			<td style="width:213px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:171px;">19130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glass vial 8,5 ml</td>
			<td style="width:213px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:171px;">64252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:213px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:171px;">48851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:213px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:171px;">32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol 100%</td>
			<td style="width:213px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:171px;">32221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Glass slides</td>
			<td style="width:213px;">VWR international</td>
			<td style="width:171px;">631-9439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Tweezers</td>
			<td style="width:213px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acrylic resin</td>
			<td style="width:213px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:171px;">104371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Epoxy resin M</td>
			<td style="width:213px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:171px;">10951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Epoxy resin M hardener</td>
			<td style="width:213px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:171px;">10953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dibutyl phtalate&#160;</td>
			<td style="width:213px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:171px;">80102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Epoxy resin M accelerateur</td>
			<td style="width:213px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:171px;">10952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Crystallizer</td>
			<td style="width:213px;">Fischer scientific</td>
			<td style="width:171px;">08-762-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Joseph paper</td>
			<td style="width:213px;">VWR international</td>
			<td style="width:171px;">111-5009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Brass cups</td>
			<td style="width:213px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td>do it yourself shop or made by yourself</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Saccharomyces cerevisiae</td>
			<td style="width:213px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Shizosacharomyces cerevisiae</td>
			<td style="width:213px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Trypanosoma brucei</td>
			<td style="width:213px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Leishmania amazonensis</td>
			<td style="width:213px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Escherichia Coli&#160;</td>
			<td style="width:213px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Airtight box</td>
			<td style="width:213px;">Fischer scientific</td>
			<td style="width:171px;">7135-0001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Air purifying respirator</td>
			<td style="width:213px;">Fischer scientific</td>
			<td style="width:171px;">3M 7502&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Cartridge for respirator</td>
			<td>Fischer scientific</td>
			<td style="width:171px;">3M 6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Particulate filter</td>
			<td style="width:213px;">Fischer scientific</td>
			<td style="width:171px;">3M 5N11&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plunge freezing: a tool for the ultrastructural and immunolocalization studies of suspension cells in transmission electron microscopy

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist ein außergewöhnliches Werkzeug für die Ultrastruktur der Zelle zu studieren, um die Proteine ​​zu lokalisieren und makromolekularen Komplexe mit sehr hohen Auflösung sichtbar zu machen. Doch so nah wie möglich an den nativen Zustand, perfekte Probenkonservierung zu bekommen ist nicht erforderlich. Herkömmliche Elektronenmikroskopie (EM) Fixierung mit Aldehyden, zum Beispiel, bietet keine gute ultra Erhaltung. Die langsame Eindringen von Fixateure induziert Zell-Reorganisation und Verlust verschiedener Zellkomponenten. Daher tritt herkömmliche EM Fixierung nicht für eine sofortige Stabilisierung und Konservierung von Strukturen und Antigenität ermöglichen. Die beste Wahl intrazelluläre Ereignisse für die Prüfung ist Kryofixation durch das Verfahren gefrier Substitution Fixierung gefolgt zu verwenden, die Zellen in ihrem nativen Zustand hält. Hochdruck-Gefrier / Gefriersubstitution, die die Integrität der zellulären Ultrastruktur bewahrt, ist die am häufigsten verwendete Methode, erfordert aber expensive Ausrüstung. Hier eine einfach zu bedienende und kostengünstige Gefriertfixationsmethode gefolgt von Gefriersubstitution für Suspensionszellkulturen vorgestellt.

In diesem Artikel wird eine einfach zu bedienende und kostengünstige Tauchgefrierverfahren für ultrastrukturelle (Abbildungen 1 und 2) und Immunmarkierung (Abbildung 3) Studien vorgestellt. Wir zeigen, dass es nicht notwendig ist, spezielle Ausrüstung für die Gefriert Auswechselbestimmungen zu haben und dass die Erwärmung Vorgang dauert weniger als 6 h statt der 24 h ein dediziertes System. Pf / Gefriertsubstitutionsverfahren führten zur verbesserten Erhaltung der intrazellulären Strukturen von Saccharomyces cerevisiae (1A und 1D-H), Schizosaccharomyces pombe (1B und C), Leishmania flagellum (Abbildung 2 A und B), Trypanosoma brucei (Abbildung 2 C und D) und Escherichia coli (Figur 2E). Die Strukturen sind nicht geschrumpft und das Zytoplasma erscheint dicht. Darüber hinaus sind die Membranen glatt, was Beweis für eine gute Konservierung ist. Alle von den Organellen wie Nukleus (1A, B und D 2A -D), Mitochondrien (1A -C, E und H), und Vakuolen (1A, C, F und H), kann perfekt identifizierte . Im Kern, Kernhülle, Kernpore, Spindel- Polkörper und Ribosomen angebracht auf der äußeren Membran der Kernhülle sind deutlich sichtbar (Figur 1 bildet eine DoppelmembranD und 2B, 2D). In den Mitochondrien, die innere Membran Einstülpungen, genannt Cristae (Figur 1E), sind deutlich sichtbar. Die Vakuolen sind kritische Organellen, weil große Eiskristalle in ihnen leicht entwickeln kann. Wie in Figur 1 dargestellt ist , ist perfekt ohne Vakuolen Eiskristall - Schaden (1A, C, F und H) erhalten. Schließlich wird , wie die Ultra gut erhalten ist, können verschiedene biologische Ereignisse mitochondrialen Morphologie (Figur 1E), sekretorischen Vesikeln (1G) und Kernteilung (1A beobachtet und analysiert, wie autophagy (1C, F und H), werden Abbildung 2 B, and 2C). In-situ-Lokalisierung von Proteinen mit spezifischen Antikörpern ist eine der mächtigsten und beliebtesten Techniken in der Zellbiologie. PF kann auch als ein Verfahren verwendet werden, um Protein Immunolokalisation auszuführen. Dieses Verfahren bewahrt Proteinantigenität und wird, wie oben, Organell Identität erwähnt. Verschiedene Antikörper - Targeting verschiedene Hefeproteine, wie anti-ATP - Synthase 7, 15 (3A, 3C und 3D), Anti-GFP (3B), anti-porine 16 (Figur 3 E) und anti-FOX2 17 (Fig 3F), wurden bereits getestet. Es ist auch möglich , diese Versuche an verschiedenen Organismen, wie Leishmania 12 auszuführen. Abbildung 1: TEM - Bilder von ultrastrukturellen Untersuchungen der Hefen Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe. (A) Übersicht von S. cerevisiae. (B) Überblick von S. pombe. (C) Teil des S. pombe Zytoplasma. (D) Hohe Vergrößerung eines Kerns. (E) Detail eines Mitochondrium mit cristae deutlich sichtbar. (F) Vacuolar Morphologie während autophagy. (G) Yeast bud mit Sekret Vesikeln innen. (H) Beispiel intimen Kontakt zwischen Vakuolen und Mitochondrien während des autophagy Prozesses. N, Kern; V, Vakuole; m, Mitochondrium; SV, Sekretion vesizeuge; r, Ribosomen. Maßstabsbalken = 200 nm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54874/54874fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54874/54874fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54874/54874fig2.jpg" /> Abbildung 2: TEM - Bilder von ultrastrukturellen Untersuchungen der Leishmania amazonesis, Trypanosoma brucei und E. coli. (A) Übersicht von Leishmania. (B) Detail der Leishmania Zytoplasma mit Kernpore und endoplasmatischen Retikulum. (C) Überblick über T. brucei. (D) hohe Vergrößerung von T. brucei Kern. (E) Übersicht von E. coli - Zelle. N: Kern; V, Vakuole; m, Mitochondrion; NP, Kernpore; F, flagellum; FP, Flagella Tasche; K, Kinetoplast; r, Ribosomen. Maßstabsbalken = 200 nm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54874/54874fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54874/54874fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54874/54874fig3.jpg" /> Abbildung 3: Beispiele für Proteinmarkierung unter Verwendung monoklonaler und polyklonaler Antikörper. (A) Übersicht von S. cerevisiae. (B) Immunmarkierung von Amyloid-β mit Anti-GFP - Antikörper. (CD) Beispiel der Mitochondrien Markierung mit anti-ATP - Synthase - Antikörper. (E) Porin Lokalisation im äußeren Membran eines Mitochondriums. (F) Fox2 Protein wird in Mitochondrium detektiert durch Immunmarkierung. (G) Lokalisierung von Ld Flabarin inein Längsschnitt eines Flagellum von Leishmania amazonesis. Alle Antikörper werden erkannt, unter Verwendung von 10-nm-Gold polyklonalen Antikörper. N, Kern; V, Vakuole; m, Mitochondrium. Maßstabsbalken = 200 nm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54874/54874fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54874/54874fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Diese Handschrift beschreibt eine einfach zu bedienende und kostengünstige Methode zum Kryofixation Suspensionszellen durch Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar zu machen.

Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

plunge-freezing-tool-for-ultrastructural-immunolocalization-studies

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Aufrufe.  Université de Bordeaux.  Diese Handschrift beschreibt eine einfach zu bedienende und kostengünstige Methode zum Kryofixation Suspensionszellen durch Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar zu machen. 

Serie: Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

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Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

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We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Tracking Morphogenetic Tissue Verformungen in der frühen Hühnerembryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Miniaturisierte Probenvorbereitung für Transmissions-Elektronenmikroskopie

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Kryo-elektronenmikroskopische Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Studien mit einem neuartigen Robotersystem, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Strategien zur Optimierung der Datenerfassung in der Kryoelektronentomographie

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.