This work was supported by Karolinska Institutet, a project grant from the Swedish Research Council VR (Dnr 2014-2794) and a KID Doctoral Grant from Karolinska Institutet (All to A.G.R). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Hinweis: C67BL / 6-Mäuse für die Experimente in diesem Manuskript gezeigt verwendet wurden. Diese Tiere waren Haus unter bestimmten erregerfreien Bedingungen bei der MTC Tieranlage, Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden. Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien und den Richtlinien des schwedischen Landwirtschaftsdurchgeführt, die schwedische Tierschutzbehörde und Karolinska Institutet. Die Experimente wurden von der Stockholm Nord Tierethikrates genehmigt. 1. Herstellung von CFSE Stocks und Lagerung <ol><li> Bereiten Sie eine 5 mM Lager von 5- und 6-Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) in Dimethylsulfoxid. Wirbel. Dispense 100 ul Aliquots in sterile 0,5 ml Schraubdeckel Mikro-Röhrchen. Shop Aliquots bei -80 ° C. </li></ol> 2. Mäuse <ol><li> Verwenden Sie angeboren männliche oder weibliche Mäuse zwischen 8 und 12 Wochen alt sind. Sex- und altersangepassten Tiere werden bevorzugt. Achten Sie darauf, die erforderlichen Tier ethischen Genehmigungen are an Ort und Stelle vor Beginn der Experimente. </li></ol> 3. Immobilisierung von Tiere mit Isofluran Gas Anesthesia <ol><li> Legen Sie das Anästhesiegerät mit Isofluran. Füllen Sie das 10 ml gasdichten Glasspritze mit Isofluran. Vermeiden Sie Luftblasen einzuführen. Verbinden Sie die Spritze und Flüssigkeitseinlass mit dem mitgelieferten Schlauch und den Schieber nach vorne bewegen, bis die Flüssigkeit in das Verbindungsrohr sichtbar gerade dabei ist, den Verdampfer zu betreten. HINWEIS: Bewahren Sie keine Isofluran in der Spritze, wenn sie nicht in Gebrauch ist. </li><li> Anästhesieren Tiere mit Isofluran in der Induktionskammer, mit einem Luftstrom bei ca. 400 gehalten - 500 ml / min und die Konzentration von Isofluran bei 3,5%. HINWEIS: Das Gerät wird nicht ohne Luftstrom betrieben werden. </li><li> Sobald die Tiere schlafen, drehen Sie den Hahn auf dem Anästhesiegerät die Isofluran-Gas zu der Maske Stück Weg. Überprüfen Sie, ob das Maskenteil intakt ist ein Austreten von Gas zu vermeiden. Luftstrom kann auf 400 ml / min, aufrechterhalten werden alternativ verringerte sich auf 200 ml / min. Reduzieren Sie Isofluran-Konzentration auf 2,6%. HINWEIS: Die anästhetische Wirkung kann durch Einstellen der Durchflussrate erhöht und / oder verringert werden. </li></ol> 4. BCG Injections und Erholung <ol><li> Optisch bestätigen und Tests durchführen, wie der Zeh Prise Reflex-Test, dass Mäuse, um festzustellen, immobilisiert / schlafend auf dem Isofluran Maske Stück vor Injektionen durchgeführt wird. </li><li> Beimpfen in den hinteren Fußballen, 1 x 10 6 koloniebildenden Einheiten von Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) in 30 ul PBS eine Spritze mit einer 29 G x ½ inch Nadel angebracht werden. HINWEIS: Die Erzeugung von Mykobakterien - Aktien ist in der ursprünglichen Beschreibung dieses Verfahrens 3 und im wesentlichen an anderer Stelle ausführlich 6 kurz beschrieben. BCG ist auch aus kommerziellen Quellen leicht erhältlich. Die Autoren empfehlen, dass BCG Puls-Ultraschall behandelt werden oder durch eine Spritze geleitet Klumpen vor seiner inoculati zu störenon in Mäuse. BCG wird wiederholt hier als mikrobielle Stimuli 3 seine Beschäftigung in der ursprünglichen Beschreibung dieses Protokolls gegeben , aber die Autoren sicherlich die Prüfung von anderen mikrobiellen Stimuli fördern. </li><li> Führen die gleiche oben beschriebene Verfahren für die Injektion von PBS in Kontrollmäusen. </li><li> Überwachen Tiere nach den Injektionen, dass die Erholung zu bestätigen aus der Narkose erfolgreich ist und dass die Tiere können sich auf dem injizierten, hinteren Fußballen unterstützen. </li></ol> 5. CFSE Injections <ol><li> Herstellung von CFSE für Injektionszwecke: <ol><li> ein Fläschchen mit 5 mM CFSE Stammlösung von -80 ° C auftauen. Verdünnen Sie die CFSE 10-fach in PBS. Resuspendieren Sie die Lösung gründlich, bevor Sie die Spritze in der Vorbereitung für die Injektion zu füllen. </li></ol></li><li> CFSE Injection and Recovery: <ol><li> Wiederholen Sie den Vorgang für die Tiere in Abschnitt 3. Inject 20 ul 0,5 mM CFSE in der hinteren Fußballen, die zuvor erhielt BCG oder PBS betäuben. <br/&gt; Hinweis: Die Injektion von CFSE sollte am Tag vor der für das Opfer (24 h), um den geplanten Termin durchgeführt werden. </li></ol></li></ol> 6. Die chirurgische Entfernung von Popliteal Lymph Node (ZL) HINWEIS: Die Verwendung von sterilisierten chirurgischen Instrumenten und ihre wiederholten Dekontamination in 70% Ethanol werden in diesem Schritt gefördert werden. <ol><li> Euthanize die Mäuse. Sprühen Sie das Tier mit 70% Ethanol. Pin das Tier in Rückenlage auf einer Dissektion Bord. HINWEIS: Die Autoren Euthanasie durch Genickbruch empfehlen kann. </li><li> machen Sie vorsichtig einen vertikalen Schnitt in der Hinter Oberschenkel. Klare Muskeln und Fett Schere und Pinzette folglich zu entlarven und die pLN befindet sich tief in der Fettbeutel, in der Kniekehle auszuschneiden. </li><li> Übertragen Sie die pLN bis 0,5 ml sterile PBS, auf Eis. </li></ol> 7. Erzeugung von Einzelzellsuspension von pLN <ol><li> Homogenisieren pLN durch einen 70-Mikron-Sieb Zelle placed in einer 6-Well-Platte mit 5 ml PBS oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Puffer (PBS, enthaltend 2% fötales Kälberserum (FCS), 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1 mM Natriumazid). Homogenisieren durch das Sieb das hintere Ende einer 3 ml Spritze. HINWEIS: Natriumazid ist giftig und sollten mit Vorsicht behandelt werden. </li><li> Waschen Sie das Sieb mit weiteren 5 ml PBS oder FACS-Puffer, sammeln das Material in einem 15-ml-Röhrchen und Pellet die Zellen bei 277 × g (1200 rpm, R = 172 mm) für 5 min, 4 ° C. Alternativ homogenisieren PLNS direkt in Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen Homogenisatoren verwenden. </li><li> Bezogen auf die Pelletgröße, resuspendieren pLN Suspension in einem geeigneten Volumen von PBS oder FACS - Puffer, beispielsweise 200 - 1000 &amp; mgr; l. Verwenden Sie eine Zählkammer die Gesamtzellzahl aus jeder LN Suspension erhalten zu quantifizieren. Verwenden Sie Trypanblau tot / sterbende Zellen auszuschließen. </li></ol> 8. Zellfärbung und Durchflusszytometrie <ol><li> Transfer 1 - 10 x 10 6 Zellen bis 5 ml Rundboden - Polystyrolröhrchen. Waschen mit FACS-Puffer und Pellet durch Zentrifugation bei 277 xg (1.200 rpm, R = 172 mm) für 5 min, 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in 50 bis 100 &amp; mgr; l Antikörper - Cocktail (siehe Dendritische Zelle [DC] Marker für die Oberflächenfärbung verwendet, Werkstoff - Tabelle) , die 0,5 bis 1 ug anti-Maus - CD16 / CD32 (zu blockieren unspezifische Fc-vermittelte Wechselwirkungen) in FACS-Puffer für 30 - 45 min, auf Eis. Schützen Proben aus Licht. </li><li> Nach der Inkubation, Waschen Zellen mit FACS-Puffer und Pellet durch Zentrifugation bei 277 xg (1.200 rpm, R = 172 mm) für 5 min, 4 ° C. </li><li> Die Zellen in 50 bis 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer. Erwerben von Daten auf einem Durchflusszytometer 7-10. HINWEIS: Für hervorragende Bewertungen auf Durchflusszytometrie wir den Leser auf die folgenden Veröffentlichungen beziehen, die sowohl theoretische als auch praktische Informationen über diese Methode weiterzuleiten. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

noDCs sind spezialisierte Antigen-präsentierende Zellen, die auf mikrobielle Herausforderung an Körperoberflächen durch den Erwerb von mikrobiellen Antigen und die Migration auf DLN über Lymphgefäße reagieren zu können. Es stellen DCs dieses Antigens an T-Zellen in einer Weise, die primäre T-Zell-Reaktionen antreibt. Der Prozess der DC Migration von Gewebe zu DLN ist daher sehr wichtig für das Verständnis, wie ein produktives T-Zell-Antwort ausgelöst wird. Methoden DC Migration sind daher sehr nützlich, um zu messen, die oben in Entfaltung. nach Infektion mit BCG, einem Lebendimpfstoff wurde ein Mausmodell zu studieren Haut DC Migration zu DLN eingesetzt, die klinisch in die Haut injiziert wird. Entsprechend wird BCG im hinteren Fußballen diese kutanen Weg der Impfung zu imitieren. Ein einfacher Test wurde entwickelt und damit zu diesem Modell integriert, um die Migration der Haut DC-Subpopulationen von der BCG-Impfstelle in den Fußballen Haut zur Trockenlegung pLN zu untersuchen. Dieses Protokoll Relies auf den Fluorochrom CFSE in der gleichen Fußballen Injektion, die zuvor BCG empfangen und dann die Trockenlegung pLN 24 Stunden Isolierung später die Anwesenheit von CFSE-markierten Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Obwohl nicht in dem Protokoll beschrieben, LNs von dieser Einrichtung kann auch für die Analyse durch konfokale Mikroskopie vorbereitet werden, Migrationsprozesse wie beispielsweise die Positionierung von wandernd Zellen in der LN 3 zu studieren. Des Weiteren ähnliche Ergebnisse auf BCG ausgelöste Haut DC Migration wurden mit beiden BCG Pasteur 1173P2 3 und BCG SSI 1331 14 erhalten. CFSE wird üblicherweise zur Kennzeichnung Zellen in vitro und zu verfolgen , wie zum markierten Zellen in vivo nach dem Zelltransfer 15 verwendet. Obwohl im aktuellen Protokoll wurde verwendet , um direkt die Hautzellen in situ bezeichnen. Die molekulare Basis von CFSE Markierung ist ähnlich FITC, die auch eine aminreaktive Fluoreszenzfarbstoff ist. CFSE wird aber über FITC für die Konjugation bevorzugt, da es creAtes sehr stabile carboxamid Bindungen 16. Außerdem ist CFSE hoch permeable Membran und diffundiert passiv in die Zellen. Einmal drinnen, bildet sie intrazelluläre Amin (fluoreszierend) Konjugate , die 15 in der markierten Zelle zurückgehalten werden. Die CFSE-basierte Migrationstest von den Autoren entwickelte ermöglicht die Identifizierung von Zellen von der Haut zu DLN innerhalb einer 24-Stunden-Periode in Reaktion auf BCG verlagern. Er misst somit acute Migration während eines definierten Zeitrahmen und ermöglicht es, die Fähigkeit verschiedener, zu untersuchen, injiziert Stimuli Migration zu triggern. Dieser Test unterscheidet sich von der klassischen Technik der FITC Hautmalerei, die eine kumulative Migration Ereignis durch kutane topische Anwendung eines berührungsSensibilisierungsMittels ausgelöst misst. Somit kann der CFSE-basierte Migrationstest eingesetzt werden wandernde Haut DCs oder anderen Zellen zu identifizieren, die Heimat der pLN nach der Injektion von Mikroben, mikrobielle Produkte oder andere entzündliche Reize in der footpad. Tatsächlich beide Neutrophilen und γ: δ haben T - Zellen wurden von der Haut zu DLN als Reaktion auf BCG 17,18 zu verlagern gezeigt. In der Tat wurde der Test vor kurzem in einer Co-Infektion Einstellung , um zu zeigen , dass ein gut-lokalisierte Nematodeninfektion BCG ausgelöste Haut DC Migration auf DLN 14 stumm schalten können. DC Migration wird häufig zwischen 24 bis 72 h in FITC Hautauftragung da FITC-markiertem DCs sind schwer zu erkennen 4 bis 5 Tage nach dem Lackieren 19 beurteilt. Der Verlust des CFSE Signal an gekennzeichneten DCs ist nicht ein Problem in dem Test hier dargestellt, da Analyse der Migration auf 24 Stunden beschränkt wurde; der Grund dafür ist, dass die Autoren &quot;über Nacht&quot; Migrationen gezielt studieren wollte. Andere interessiert in diesem Test werden jedoch ermutigt, früher oder später Zeitpunkte für CFSE-basierten Tracking zu untersuchen. Da darüber hinaus CFSE durch Injektion eingeführt wird, kann es jeder definierten Zeit gegeben werden. Diese Flexibilität erlaubt, die eineuthors DC Migration zwischen Tag zu beurteilen 5 und 6 nach der BCG - Infektion (2C) 3. Injecting CFSE könnte möglicherweise die Zelltypen zugänglich in situ auf der Markierungsreaktion begrenzen. Beispielsweise Langerhans - Zellen (LCs), die DCs, die in der obersten Schicht der Haut befinden, wandern die Epidermis, schlecht in Reaktion auf BCG in der CFSE-basierte Migrationstest (Abbildung 3) 3. Doch während FITC Haut malen, positioniert DCs in der Dermis, die Schicht unter der Epidermis, sind leicht beschriftet und auf den DLN schneller als LCs 20,21 migrieren. Dies legt nahe, dass Zellen Fluorochrom-markierten ohne notwendigerweise benötigt werden, kann auf die Schicht der Haut zu lokalisieren, wo die Markierungslösung aufgebracht wird. Als Modell für BCG - Infektion bietet die Maus Ohr eine bona fide intradermal der Impfung , die mit der klinischen Anwendung von BCG als Tuberkulose - Impfstoff mehr im Einklang ist. foOtpad Einspritzung auf der anderen Seite, ist wahrscheinlich eine Kombination der intradermale und subkutane Wege. Das heißt, es erfordert Geschick und Training korrekt und reproduzierbar BCG in die Dermis liefern 22, so in der klinischen Praxis ist es nicht immer wirklich intradermal verabreicht werden kann , sondern subkutanen oder eine Kombination von beiden. Als Impfstelle hat die Fußballen zwei sehr deutliche Vorteile gegenüber dem Ohr haben, die zu erwähnen Verdienst. Zuerst wird die Immunantwort auf das Ablaufen pLN konzentriert nach einer Fußballeninjektion und dies erleichtert die Prüfung der Antworten. Die Autoren dieses Berichts die pLN die erste und wichtigste LN Ablassen der Fußballen 3 zu sein. Andere haben nach der Injektion von Evan-Blau 23 geteilte Drainage zwischen den Kniekehlen und subiliac LNs vorgeschlagen. Dennoch in Bezug auf das Ohr, gibt es mehr als ein Ohr DLN in Mäusen und diese möglicherweise nicht regelmäßig vorhanden oder einfach 24 zu lokalisieren. Letztere stellt eindeutig eine liability in Studien der Suche nach Antworten in DLN zu untersuchen. (- 50 &amp; mgr; l 10) gegenüber dem Ohr Zweitens können größere Mengen in den Fußballen inokuliert werden. Dies wiederum minimiert sowohl die Haftung der großen Veränderungen in den Lymphfluss der Einführung und des Habens mit sehr kleinen Injektionsvolumina zu arbeiten, die an sich ist ein Problem, wenn es um Impfen große Mengen von Mykobakterien kommt. Im Ohr, wo die Injektionsvolumina klein (1-10 ul) zu sein, auch 5 ul kann Lymphfluss verändern und möglicherweise eine größere Menge des injizierten Materials zwingen, direkt in den DLN in unkontrollierter Weise. Es ist daher wichtig für Injektionsvolumina zu berücksichtigen. Dies ist besonders wichtig bei Versuchen, den Beitrag der Zellen in Überführung Bakterien an der LN-Adressierung. Im BCG Fußballen Modell haben einige BCG kann die DLN in Abwesenheit von zellulären Transport erreicht. Dies basiert auf der Beobachtung, dass eine BCG noch erkennen kann, in der DLN von Mäusen, wo die Zellmigration vom FußKissen wurde durch lokale Injektion von Pertussis - Toxin 3 vollständig abgetragen. Ob dies ein Hinweis darauf, dass BCG direkt Lymphgefäße zugreifen können und die DLN in einer wirklich zellfreie Weise erreichen noch bestimmt werden, da sie nicht, dass Mykobakterien in diesem Fall ausgeschlossen werden kann, wo durch die Kraft des eingespritzten Volumens Zugang zu Lymphgefäße gegeben. Eine praktische Überlegung für Immunisierungen im Ohr oder Fußballen ist, dass die Tiere ausreichend immobilisiert werden müssen für Injektionszwecke korrekt und in einer reproduzierbaren Art und Weise durchgeführt werden. Isofluran Gas wird in dem aktuellen Protokoll als ein Verfahren zu beschränken Tiere in Vorbereitung für Injektionen Fußballen beschrieben. Die relativ schnelle Induktion und Wiederherstellungszeiten für Isofluran-vermittelte Anästhesie machen es eine beliebte Methode, aber ähnlich wie bei anderen Anästhetika, es wirkt sich die Physiologie, die 25 mit den experimentellen Ergebnissen stören können. Tatsächlich sowohl flüchtige als auch injizierbare Anästhetika verringern Lymphfluss durch die Abschaffungfreiwillige Muskelbewegungen, Muskeltonus zu reduzieren und abnehm Lymphangion Kontraktion 26. Weiterhin ist eine 5-fache Verringerung der Migration von DLN DCs adoptiv in den Fußballen übertragen hat in narkotisierten Tieren 27 berichtet. In Anbetracht der obigen, und da die Handhabung Verfahren vor der Anästhesie sind wahrscheinlich mehr Stress für die Tiere zu verursachen als die Injektion selbst, die sowohl schnell zu verwalten ist und keine Wiederherstellungsschritt erfordern, hemmen die Möglichkeit, ausreichend um das Tier ohne Betäubung sollten in Betracht gezogen werden. Eine Maus Verzögerer für Fußballen Injektionen besonders angefertigt, in dem das Tier schnell an eine immobilisierte Position und geimpft in den Fußballen innerhalb von 30 bis 40 sec gebracht werden Ideal wäre die Maus in die hinteren Fußballen zu injizieren, ohne andere Aspekte ihrer Physiologie in den Prozess zu verändern und wäre äußerst nützlich in Studien, in denen die Zellmigration durch Lymphgefäße sein. Abschließend dieser Berichthebt ein neuartiges Protokoll Haut DCs während ihrer Mobilisierung der DLN anhand eines Tests, die Migration während einer definierten 24-Stunden-Fenster überwacht für die Verfolgung. Diese CFSE-basierte Migrationstest ermöglicht die Erkennung und Analyse von Migrationszellen durch Durchflusszytometrie, wie hier detailliert, sowie durch konfokale Mikroskopie 3. Es bietet eine flexible Plattform für eine Vielzahl von injizierten Stimuli zu studieren und ihre Fähigkeit, DC Migration auslösen, und vor allem, können eingesetzt werden, nicht nur DCs zu verfolgen, sondern auch andere Populationen von der Haut zu DLN während der verschiedenen experimentellen Bedingungen zu bewegen.

DCs in Körperoberflächen lokalisiert spüren Mikroben oder ihre Produkte, und so mobilisieren über Lymphgefäße zur Trockenlegung LN (DLN) 1,2 dabei. Diese Verlagerung ist für den Transport von mikrobiellen Antigen zur DLN und die daraus folgende Priming von Immunantworten gegen den eindringenden Mikrobe benötigt. Tatsächlich Blockade oder des Versagens von DCs aus dem infizierten Gewebe wandern in die DLN die Antwort T-Zell stumm geschaltet 3-5. Dementsprechend entwickelt Assays Migration auf Einzelzellebene zu verfolgen sind nützlich zusprechen Migrationsfunktion zu einem gegebenen DC Teilmenge zu helfen. Es gibt eine große Menge an Daten über die Inanspruchnahme von Haut DCs zur DLN. Letztere Konten für einen Großteil des Wissens über DC Migration von entzündeten oder infizierten Websites 2. Dies ist nicht verwunderlich, da die Haut eine große Population von DCs beherbergt und ist eine gut zugängliche Fläche für Experimente im Labor Maus. Verschiedene Techniken so entwickelt worden, zu beurteilendie Migration von murinen DCs von der Haut zu der DLN 2. FITC Haut Malerei ist bei weitem die am häufigsten verwendete Ansatz. In diesem Assay das Fluorochrom Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC) wird in einer Mischung mit Aceton und einem Kontaktreiz hergestellt. Dieser Cocktail wird auf enthaarte oder rasierten Haut aufgetragen und die Anreicherung von FITC-markierten Zellen wird wiederum in der DLN analysiert. Migration kann auch durch Einspritzen der Haut mit Fluorochrom-markierten Nano- oder Mikropartikel untersucht werden, was die Verfolgung von phagozytischen Zellen ermöglicht, die die Leuchtstoffpartikel in die Haut internalisiert haben. Lymphgefäße können auch direkt eine Kanüle eingeführt werden, um die Migration DCs aus Lymphe extrahieren. Dies ist jedoch technisch anspruchsvoll, vor allem bei Mäusen. Die Anzahl der DCs für eine nachfolgende Analyse erhalten ist auch ein begrenzender Faktor. Trotz vieler früheren Studien über die Haut DC Migration besteht nach wie vor ein Mangel an Informationen bezüglich der Haut DC Mobilisierung DLN folgende vacciNation mit Bazillus Calmette-Guérin (BCG), die lebenden, abgeschwächten Stamm von Mycobacterium bovis verwendet , um gegen M. impfen Tuberkulose. BCG wird in der Haut inokuliert, eine begrenzte Infektion verursacht, die eine T-Helfer-Zellen-Typ-1-Antwort auslöst. Sowohl die DC-Unterpopulationen, die von dem BCG-infizierten Haut und die Faktoren, die zur DLN mobilisieren, die ihre Migration während dieses Prozesses regulieren, sind nicht vollständig verstanden. In Anbetracht der obigen, ein einfaches , aber neues Verfahren entwickelt wurde , in dem das Fluorochrom 5- und 6-Carboxyfluorescein - Diacetat Succinimidylester (CFSE) in situ eingespritzt wird , 3 die Migration von DCs in die DLN zu verfolgen. C57BL / 6-Mäuse in den hinteren Fußballen mit einem Inokulum von BCG und dem Tag vor der Tötung injiziert, die Tiere in der gleichen Fußballen mit einer hohen Konzentration an CFSE injiziert. Vierundzwanzig Stunden später die Tiere getötet, und die poplitealen Entwässern LN (PLN) entfernt und für die Durchflusszytometrie vorbereitet. Dieser Test ermöglicht die identification von Zellen , die über Nacht von den Fußballen Haut zur DLN (Abbildung 1) migrieren. Darüber hinaus Gen-Targeting-Mäuse verwendet werden Faktoren für Zellen erforderlich zu identifizieren, um die DLN zu mobilisieren. Unter Verwendung dieses Tests haben die Autoren dieses Berichts zuvor festgestellt , dass EpCAM niedrige CD11b hoher Migrations Haut DCs Transport BCG auf die DLN in einem Prozess geregelt durch Interleukin-1 - Rezeptor und dem intrazellulären Adaptermolekül MyD88 3. Das Protokoll für dieses CFSE-basierte Migrationstest, der durch Bollampalli et al aus dem oben genannten Bericht stammt. 3 , wo die Durchflusszytometrie verwendet wurde , um wandernde Haut DCs erkennen und zu analysieren, wird hier beschrieben. Die Vor- und Nachteile dieses Assays werden diskutiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1056">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:212px;">Baxter</td>
			<td style="width:140px;">1001936060</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:379px;">5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester 
			(CFSE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C1157</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:325px;">strain Pasteur, in house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:325px;">In house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:325px;">In house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Filtered water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:325px;">In house</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">BD Plastipak 3 ml syringe</td>
			<td>BD Medical Surgical Systems</td>
			<td>309658</td>
			<td style="width:325px;">alternative: 5 ml syringe&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">15 ml centrifuge tubes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>91015</td>
			<td style="width:325px;">Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">5 ml round bottom tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>3272948</td>
			<td style="width:325px;">Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Univentor&#160; 400 anaesthesia unit</td>
			<td>Univentor</td>
			<td>8323001</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Monojet 3/10ml syringe</td>
			<td>Medicarrier</td>
			<td>8881511144</td>
			<td style="width:325px;">29 G x 1/2 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Sterile filter unit</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99500</td>
			<td style="width:325px;">PES membrane&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">EPPI-Pistill homogenizer</td>
			<td>Schuett biotech</td>
			<td>3.200 512</td>
			<td style="width:325px;">Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Allegra X-30R centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B01145</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">B&#252;rker counting chamber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0920</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">0.5 ml screw cap microtube&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.730</td>
			<td style="width:325px;">Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">1.5 ml Eppendorf microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>700-5239</td>
			<td style="width:325px;">Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">70 micron cell strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0003</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:379px;">BD LSR-II flow cytometer, operated with FACSDiva software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:325px;">Discontinued. Other Flow cytometers available, minimum detection of 6 fluorochromes needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">FlowJo cell analysis software</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Antibody</td>
			<td style="width:212px;">Clone</td>
			<td style="width:140px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Antibodies</td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:140px;"></td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">MHC-II I-A/I-E&#160;</td>
			<td style="width:212px;">M5/114.15.2</td>
			<td style="width:140px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">CD11b</td>
			<td style="width:212px;">M1/70</td>
			<td style="width:140px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">CD11c</td>
			<td style="width:212px;">HL3</td>
			<td style="width:140px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">CD16/CD32 (Fc-block)</td>
			<td style="width:212px;">2.4G2</td>
			<td style="width:140px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">CD326/EpCAM</td>
			<td style="width:212px;">G8.8</td>
			<td style="width:140px;">Biolegend</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">CD103</td>
			<td style="width:212px;">2E7</td>
			<td style="width:140px;">Biolegend</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">CD80</td>
			<td style="width:212px;">16-10A1</td>
			<td style="width:140px;">Biolegend</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">CD86</td>
			<td style="width:212px;">GL-1</td>
			<td style="width:140px;">Biolegend</td>
			<td style="width:325px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cfse-based assay to study the migration of murine skin dendritic cells into draining lymph nodes during infection with mycobacterium bovis bacille calmette-gu&#233;rin

Dendritische Zellen (DCs) sind wichtig für die Immunantwort initiieren, teilweise durch ihre Fähigkeit und Shuttle-Antigen zu den drainierenden Lymphknoten (DLN) zu erwerben. Die Mobilisierung von DCs zur DLN ist komplex und bleibt vollständig während der Infektion aufgeklärt werden. Hierin beschrieben ist die Verwendung eines innovativen, einfachen Test, der 5- und 6-Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester auf dem Fluorochrom beruht (CFSE) während der Fußballen Infektion mit Mycobacterium bovis Bazillus Calmette-Guérin (BCG) in C57BL die Migration von DCs zu verfolgen / 6-Mäuse. Dieser Test ermöglicht die Charakterisierung von Haut DC-Subpopulationen, die auf die Trockenlegung, poplitea LN in Reaktion auf BCG aktiv verlagern. Dieses Protokoll stammt aus einer BCG-Modell, bei dem wandernden Haut DCs wurden mittels Durchflusszytometrie identifiziert. Der Test ist liebenswürdig dem Studium und der Identifizierung von DCs oder anderen Zellen, die Heimat der poplitealen LN nach der Inokulation von Mikroben, deren Metaboliten oder andere entzündlicheStimuli in den Fußballen und folglich Faktoren zu untersuchen, die die Migration dieser Zellen zu regulieren.

Die CFSE-basierte Migrationstest (Abbildung 1) wurde zusammen mit der Durchflusszytometrie verwendet , um die CFSE-markierten Zellen zu erkennen und zu charakterisieren , die in der pLN nach BCG - Infektion in den Fußballen erscheinen. Ein großer Teil des CFSE Kennzeichnung in der pLN auf MHC-II hoch und CD11c + / Low - Zellen (2A), im Einklang mit der Haut DCs gefunden, die auf die Haut DLN 11 gewandert sind. Sowohl die Häufigkeit und die Gesamtzahl der CFSE-markierten, MHC-II - Hoch CD11c + / low - Zellen werden in PLNS von BCG-infizierten Mäusen erhöhte sich im Vergleich zu PBS-injizierten Kontrollen (2B-C), was darauf hindeutet , dass BCG die Verlagerung von diesen verbessert Zellen zur DLN. Da dieser Test misst die Migration während einer 24-Stunden - Zeitraum, war es möglich , dass die Haut DCs zu etablieren noch Eingabe der DLN 5 Tage nach der Infektion (Abbildung 2C). Dies erweitert DC Migration im aktuellen Modell weit über den Zeitplan für die anfängliche activatiauf der Antigen-spezifischen CD4 + T - Zellen in der pLN 3. Ferner äußern wandernde Haut DCs erhöhte Werte von co-stimulierenden Molekülen CD80 und CD86 (2D). Dies steht im Einklang mit früheren Beobachtungen aus Hautexplantat Kulturen und FITC Haut Malerei 11, unterstützen das Konzept , dass die Migrations DCs sind aktivierten Zellen. Wichtig ist , dass beide LN-resident DCs (MHC-II + CD11c hoch Zellen) und plasmazytoiden DCs (MHC-II niedrige CD11c niedrig PDCA-1 + Zellen), die entzündeten LNs durch hohe Venolen betreten und nicht die zuführenden Lymphgefäße 12, wo negativ CFSE (Abbildung 2EF), was darauf hindeutet , dass in der Tat CFSE Kennzeichnung erfolgte vor allem in den Fußballen. Da die MHC-II - Hoch CD11c + / low Zellen repräsentieren nicht nur eine , sondern mehrere DC-Subpopulationen 13, die zusätzlichen Oberflächenmarker CD103, EpCAM (CD326) und CD11b wurden in der Antikörper - Färbung Panel enthalten für den durchflusszytometrischen Nachweis (Werkstoff - Tabelle) verwendet , um die Population der wandernden DCs (Abbildung 3) zu charakterisieren. Dabei wird eine Subpopulation von EpCAM niedrigen CD11b hoch Zellen wurde als Hauptmigrations Haut DC Teilmenge als Reaktion auf BCG - Infektion (Abbildung 3) identifiziert. Die durchflusszytometrischen Daten hier gezeigt wurde, auf einem Fluss erworben Zytometer mit 4 Lasern ausgestattet (488, 532, 640 und 405 nm). Die Daten wurden mit der Zellanalyse-Software analysiert. Andere Mehrfarben Durchflusszytometer als die spezifizierte einer in der Werkstoff - Tabelle kann für die erfolgreiche Erkennung der Markierungen in den obigen Studien oder der Nachweis von anderen Markern für diese Angelegenheit auf andere Zelltypen verwendet werden , erwähnt. Für das Protokoll hier beschrieben ist, ist ein Zytometer Lage 6 verschiedene Fluorochrome des Erfassens necessar. Wichtig ist , dass die Klone für jeden Antikörper verwendet angegeben (Werkstoff - Tabelle). Die Wahl des Fluorochrom-Konjugat muss berücksichtigt werden, da diese auf den Laser und Detektionskanäle auf dem Durchflusszytometer zur Verfügung abhängen kann. Ebenso müssen Antikörper die am besten geeigneten Verdünnungen für die Färbung zu bestimmen titriert werden. Bevölkerung Frequenzen in BCG und PBS-injizierten Proben wurden graphisch dargestellt und zusammen mit der Gesamtzellzahl verwendet, um absolute Zahlen von definierten, gated Teilmengen von DCs berechnen. Die Bedeutung der Unterschiede in der Datengruppe Mittel wurde durch den Student &#39;st-Test oder ANOVA gegebenenfalls mit einem Cut-off von p &lt;0,05 analysiert. Ausreißer wurden Ausreißer aus der Analyse folgende Grubbs &#39;s Test ausgeschlossen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54620/54620fig1.jpg" /> Abbildung 1. Outline: BCG Footpad InfektionModell und CFSE-Based Migration Assay. BCG ist im hinteren Fußballen von C57BL / 6 - Mäuse inokuliert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion und 24 Stunden vor der Tötung wird das Fluorochrom CFSE in der gleichen Fußballen injiziert, die zuvor BCG erhalten. Die Trockenlegung wird poplitea Lymphknoten isoliert und CFSE-markierten durch Strömungs gekennzeichnet Zellen Zytometrie. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54620/54620fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54620/54620fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54620/54620fig2.jpg" /> Abbildung 2. Migratory Haut DCs sind eine wichtige Bevölkerung Relocating zur DLN Nach BCG Footpad Infektion. C57BL / 6 - Mäuse wurden infiziert mit 1 × 10 6 KBE von BCG in den Fußballen. Vierundzwanzig Stunden vor der Tötung wurden die Tiere mit 0,5 mM CFSE in der gleichen Fußballen. Popliteal LNs wurden geerntet, homogenisiertin Einzelzell-Suspensionen und Zytometrie unterzogen zu fließen. Für 1 Tag durchgeführten Messungen nach BCG wurde CFSE 2hr nach BCG injiziert. (A und B) Zebra Plots zeigt vorherrschende Expression von CFSE auf MHCII hoch und CD11c + / low Zellen in pLN 3 Tage nach der Infektion BCG-Entleerung. (C) Frequenz und Gesamtzahl der CFSE-markierten MHCII hohe CD11c + / low Zellen in pLN von BCG und PBS-injizierten Mäuse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten grafisch dargestellt. (D) mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für CD80 und CD86 wurde auf CFSE bestimmt + und CFSE neg MHC-II - Hoch CD11c + / low Haut DCs in pLN 3 Tage nach der Infektion BCG. (E) CFSE Expression innerhalb Haut DCs (MHC-II hoch CD11c + / niedrig), LN-resident DCs (MHC-II + CD11c hoch) und (F) plasmazytoiden DCs (MHC-II niedrige CD11c niedrig PDCA-1 +)wurde mittels Durchflusszytometrie 3 Tage nach der BCG bestimmt. Für jedes Experiment wurden mindestens 5 Mäuse für BCG-infizierten Gruppen und 3 für PBS-injizierten Kontrollen verwendet. Die Balken zeigen Standardfehler des Mittelwerts. Gesamtzahl an CFSE-markierten Zellen innerhalb jeder Untergruppe sind in Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015 . 11: e1005206 3. * Kennzeichnet statistisch signifikanten Unterschiede zwischen BCG-infizierten und PBS Kontrollen. Eines von zwei unabhängigen Experimenten gezeigt. Abbildung von Bollampalli angepasst et al, PLoS Pathog 2015 11:... E1005206 3, mit freundlicher Genehmigung des Verlags <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54620/54620fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54620/54620fig3.jpg" /> Abbildung 3. EpCAM niedrig CD11b hoch DCs sind die Haupthaut DC Subset Traffickzur Geräte- DLN Nach BCG Footpad Infektion. C57BL / 6 - Mäuse wurden 2 mit BCG und CFSE wie in Abbildung injiziert. (A) Zebra Plots Gating Strategie (oberes Feld) und die Häufigkeit der CFSE + Zellen innerhalb jeder verwendet wird, zeigt, definierte Teilmenge an unterschiedlichen Zeitpunkten nach der BCG-Infektion (Bodenplatten). Frequenzen innerhalb jeder Untergruppe kann in Abhängigkeit von dem Zeitpunkt nach der Infektion variieren. Nach 3 Tagen BCG kann man etwa 0,2% MHC-II - Hoch CD11c + / Low - Zellen unter allen LN - Zellen zu finden erwarten. Von diesen sind etwa 6% CD103 + Zellen. Für die Untergruppen innerhalb des MHC-II - Hoch CD103 negative Gate gefunden, kann man etwa 42% CD11b hohe EpCAM niedrigen Zellen, 27% CD11b niedrigen EpCAM niedrigen Zellen und 7% LCs finden. (B) Gesamtzahl der CFSE + Zellen innerhalb jedes definierten Untergruppe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der BCG - Infektion gezeigt. Für jede Experiment, mindestens 5 Mäuse wurden für BCG-infizierten Gruppen und 3 für PBS Kontrollen verwendet. Die Balken zeigen Standardfehler des Mittelwerts. * Kennzeichnet statistisch signifikanten Unterschiede in Bezug auf PBS-injizierten Kontrollen. Eine von drei unabhängigen Experimenten gezeigt. Abbildung Wieder gedruckt von Bollampalli et al, PLoS Pathog 2015 11:.. E1005206 3, mit freundlicher Genehmigung des Verlags <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54620/54620fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bazillus Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

a-cfse-based-assay-to-study-migration-murine-skin-dendritic-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K Aufrufe.  Karolinska Institutet. An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Guérin.

Serie: A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

Analyse der Lungen-Reifung von dendritischen Zellen und Migration während der allergischen Atemwegsentzündung

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Überwachung dendritische Zellen mit Migration<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Generierung von Lymphknoten-Fett-Pad Chimären für die Studie der Lymphknoten Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

This article provides detailed methodology to identify and quantify functional T lymphocyte subsets present within murine kidney, aorta and lymph nodes by intracellular staining and flow cytometry. The model of angiotensin II induced hypertension was chosen to explain, step-by-step, the procedures and fundamental principles of flow cytometry and intracellular staining.

Intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie zu identifizieren Lymphozytensubpopulationen in Murine Aorta, Niere und Lymphknoten in einem Modell von Hypertonie

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for protection against children&#39;s severe TB meningitis and some forms of disseminated TB, but fails to protect against pulmonary TB, which is the most prevalent form of the disease. Promising strategies to improve BCG currently rely either on its transformation with genes encoding immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-specific antigens and/or complementation with genes encoding co-factors that would stimulate antigen presenting cells. Major limitations to these approaches include low efficiency, low stability, and the uncertain level of safety of expression vectors. In this study, we present an alternative approach to vaccine improvement, which consists of BCG complementation with exogenous proteins of interest on the surface of bacteria, rather than transformation with plasmids encoding corresponding genes. First, proteins of interest are expressed in fusion with monomeric avidin in standard E. coli expression systems and then used to decorate the surface of biotinylated BCG. Animal experiments using BCG surface decorated with surrogate ovalbumin antigen demonstrate that the modified bacterium is fully immunogenic and capable of inducing specific T cell responses. Altogether, the data presented here strongly support a novel and efficient method for reshaping the current BCG vaccine that replaces the laborious conventional approach of complementation with exogenous nucleic acids.

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

A novel technique for rapid antigen display on a bacterial surface is presented, which involves surface biotinylation followed by exposure to proteins of interest in fusion with monomeric avidin. Loading BCG with selected antigens successfully improves its immunogenicity, suggesting that surface decoration can replace traditional genetic approaches.

Ausdruck der exogene Antigene im Mycobacterium Bovis BCG Impfstoff über nicht-genetische Oberfläche Dekoration mit dem Avidin-Biotin-System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...