Dr. K. Yuan was supported by an American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) and the Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Dr. V. de Jesus Perez was supported by a career development award from the Robert Wood Johnson Foundation, an NIH K08 HL105884-01 award, a Pulmonary Hypertension Association Award, a Biomedical Research Award from the American Lung Association and a Translational Research and Applied Medicine award from Stanford University.

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Stanford University School of Medicine zugelassen. HINWEIS: Die Tiere sind unter anesthetization mit 3% Verdampfer Isofluran und 3% Zufuhr von O 2 -Gas. Die Verwendung von Tierarzt Salbe auf die Augen kann helfen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern. 1. Zellpräparation <ol><li> Wachsen humanen Endothel- und Perizyten Zellkulturen in 100 mm-Platten mit 10 ml der geeigneten Medien. Ersetzen Sie 10 ml frisches Medium alle 2 - 3 Tage, bis die Zellen erreichen 80% Konfluenz. <ol><li> Kultur Endothelzellen (ECs) in kompletten endothelialen Zellmedien (ECM), ergänzt mit Firma geliefert 5% fötales Rinderserum (FBS), 10% Penicillin / Streptomycin und 10% endothelialen Zellwachstumsergänzung. </li><li> Kultur pericytes in komplette pericyte Medien (PM), ergänzt mit Unternehmen lieferte 2% FBS, 10% Penicillin / Streptomycin und 10% pericyte Wachstum zu ergänzen. </li&gt; </ol></li><li> Bereiten Zellgemischen <ol><li> Berechne die erforderliche Anzahl von Zellen für die Versuchs- und Kontrollgruppen. HINWEIS: Jeder Stecker in der experimentellen Gruppe enthält eine Million (1 × 10 6) menschlichen ECs und zweihunderttausend (2 x 10 5) pericytes. Für die Kontrollgruppe enthält jeder Stecker 1,2 Millionen menschliche ECs nur. Die negative Kontrollgruppe hat nur Matrix-Gel. Jede Gruppe sollte mindestens vier Stecker umfassen, die zwei Mäuse erfordern würde, als Stecker können in jeder Seite eine Maus unteren Rücken injiziert werden. Drei Stecker würde als dreifacher Ausfertigung für das Experiment dienen und das vierte im Fall verwendet werden könnte, ausfällt. Bereiten Sie 25% mehr Zellen das zusätzliche Volumen des Gels entsprechen. </li><li> Sammeln und Zählen Zellen aus Kulturplatten. <ol><li> Zum Abnehmen Zellen, entfernen Medien und waschen Sie einmal mit Raumtemperatur 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Entfernen PBS, 1 ml 0,25% Trypsin / 2,21 mM EDTA, und nach 1 min. Wash-Zellen von der Platte durch 2 Hinzufügenml Medium und sammeln sich in einem 15-ml-Tube. </li><li> Zählzelle einer Zählkammer nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. </li><li> Zentrifugieren Sie die entsprechende Anzahl von Zellen zu einem Pellet bei 400 xg für 5 min. Für die Versuchsgruppe, Zentrifuge sowohl ECs und Perizyten nach unten zusammen in einem Pellet. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Matrix Gelzubereitung <ol><li> Auftauen Matrix Gel vollständig bei 4 ° C für 4 Stunden oder über Nacht eine homogene Lösung zu erhalten. Kein Mischen erforderlich. </li><li> Aliquotieren Matrix Gel in 1,5-ml-Röhrchen und lagern bei 4 ° C. </li><li> Pre-Chill-sterile 1,5 ml-Röhrchen und 28 G 1 cc Insulinspritzen bei 4 ° C. Vorsicht: Halten Sie Matrix-Gel auf Eis zu allen Zeiten. </li><li> Mischen Sie kalt Matrix-Gel mit bFGF bei einem Volumenverhältnis von 1: 100 (Endkonzentration von bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF Stammlösung = 50 &amp; mgr; g / ml) Nach dem Mischen Matrix-Gel-Lösung durch Auf- und Abpipettieren mehrmals, Inkubation auf Eis für 30 - 60 min before Mischen mit den Zellen in Schritt 3.1. HINWEIS: auftauen Lager bFGF vor dem Mischen. Berechnen Sie die Anzahl der Stecker für die Injektion benötigt. Zum Beispiel erfordert jeder Stopfen 200 &amp; mgr; l Matrix Gel. Daher 25% Extra-Gel herzustellen. </li></ol> 3. Mix Matrix Gel mit Zellen <ol><li> Für jede Gruppe Zellpellet mit dem berechneten Volumen der Matrix-Gel mit bFGF (geeignete Zellzahl enthält). Vorsichtig mischen Schäumen zu vermeiden und in der 15-ml-Röhrchen auf Eis belassen, bis Mäuse zur Injektion hergestellt werden. </li></ol> 4. Maus-Vorbereitung <ol><li> Anesthetize 1 SCID - Mäuse für 5 min in 3% Isofluran plus 3% O 2 in einer Induktionskammer. Konzentrieren Sie sich auf eine experimentelle Gruppe oder 2-Mäuse, zu einer Zeit. </li><li> Entfernen Sie die Maus aus der Induktionskammer, auf ein nach unten Bauchseite Heizkissen und schnell eine Schnauze Düse mit der Maus Gesicht über eine nicht-Rückatmungssystem befestigen Anästhesie während des inje zu liefernction Verfahren. Schalten Sie den Gasstrom aus der Induktionskammer zu dem Nicht-Rückatmungssystem und senken den Gasdruck auf 1,5% Isofluran und 1,5% O 2. </li><li> Entfernen Sie Haare aus den beiden seitlichen Hinter Regionen (etwa 1 cm Durchmesser) mit einem Rasierapparat oder Enthaarungscreme. </li><li> Wischen Sie den Hautbereich mit einer 70% igen Alkohol-Pad. </li><li> Bringen Sie die Maus an die Induktionskammer und wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,4 mit der zweiten Maus. </li></ol> 5. Matrix-Gel-Injektion <ol><li> Bereiten Sie eine Maus für die Injektion von der Nichtrückatmungssystem befestigt und nach unten auf das Heizkissen Bauchseite platzieren. </li><li> Legen Sie das Matrix-Gel in eine vorgekühlte 28 G 1 cc-Insulinspritze eine Maus zu einem Zeitpunkt. <ol><li> Laden Sie die komplette 500 &amp; mgr; l Volumen der Matrix-Gel für zwei Stecker (200 ul pro Stecker plus 25% extra) in die Spritze. </li><li> Achten Sie darauf, die Matrix-Gel in die Mäuse innerhalb von 3 Minuten des Ladens der Zellen in die Spritze zu injizieren, um die ce zu verhindernlls aus zur Seite der Spritze Absetzen und Matrix Gel zu verhindern Innenseite der Spritze verfestigt. </li></ol></li><li> Heben Sie die Rückenhaut subkutanen Raum zu lokalisieren, zu injizieren dann 200 &amp; mgr; l der Matrix Gel langsam und gleichmäßig in den subkutanen Raum von der Rückseite hinteren Teil des Brustkorbs. </li><li> Entfernen Sie die Injektionsnadel langsam, wobei darauf geachtet, Matrix Gel zu verhindern, dass ein Auslaufen der Injektionsstelle. Eine Beule wird bei der Injektionsstelle bilden. Wischen Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte Injektion 5,2-5,5 auf der anderen Seite der Maus zurück, dann mit der Maus auf dem Rücken lässt 1 min Gelieren der Matrix-Gel auf dem Heizkissen zu ermöglichen. </li><li> Skizzieren Sie die beiden Höcker einen Permanent-Marker mit der Beule nach 14 Tagen zu identifizieren. Nachdem ich einige Haare wieder wächst, wird es leichter sein, die Beule zu finden. </li></ol> 6. Matrix Gelpfropfen Isolation: 14 Tage nach der Injektion <ol><li> Euthanize die Mäuse auf humane Weise durch das Tier ausgesetzts bis&gt; 5 min Kohlendioxid Inhalation durch zervikale Dislokation gefolgt Tod zu gewährleisten. </li><li> Entfernen Sie die Matrix Gelpfropfen auf der Rückseite der Maus. <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig nachgewachsenen Haare um Injektionsstelle, wo der Stecker durch Wiederholen von Schritt 4.3 befindet. Die Markierungslinie zeigt die Größe der ursprünglichen Beule unter der Haut. </li><li> Excise den Stecker zusammen mit den umgebenden Haut und Muskelschichten angebracht auf den oberen und unteren Seiten des Steckers sind. <ol><li> Mit feinen chirurgischen Schere, machen einen Einschnitt an der markierten Grenze des Steckers, die senkrecht zur Haut ist und geschnitten, um den Muskel unterhalb der Stecker durch. Dann sorgfältig entlang der markierten Rand um den Umfang des Stopfens geschnitten. </li><li> Ziehen Sie den Stecker, halten es zwischen der Haut und Muskelschichten eingebettet ist. sofort gründlich in einem kleinen Becher mit 1x PBS überschüssiges Blut abzuwaschen. Der Stecker ist nun bereit, festgelegt werden (nächster Schritt, 6.3). </li></ol></li></ol></li><li> Befestigen Sie die plug in 4% Paraformaldehyd. <ol><li> Platzieren Sie den gesamten Stecker, einschließlich der Haut und Muskelschichten, in einem 50-ml-Röhrchen mit 25 ml 4% Paraformaldehyd für 24 Stunden bei Raumtemperatur ohne zu schaukeln. Am nächsten Tag übertragen Sie den Stecker in 25 ml 70% Ethanol für weitere 24 Stunden vor der Paraffineinbettung. HINWEIS: Die beim Umgang Paraformaldehyd mit Vorsicht. Trag Handschuhe. </li></ol></li></ol> 7. Paraffin Prozess der Matrix Gelpfropfen <ol><li> Bereiten Sie den Stecker für die Paraffineinbettung. <ol><li> Richten Sie den Stecker wie in 1a gezeigt; Platzieren Sie den Stecker in eine Gewebekassette, so dass die Seite des Steckers nach oben zeigt und die beiden Haut und Muskelschichten sind über die Oberfläche des Gewebeblocks sichtbar, die zuerst während des Schneidens geschnitten wird. </li></ol></li><li> Paraffin einbetten den Stecker nach Standardparaffineinbettung Protokolle 13. </li><li> Schneiden Sie 8 - 10 &amp; mgr; m dicke Abschnitte aus der Gewebeblock und montieren auf Mikroskop accor gleitetding Standard Paraffin sectioning Protokolle 13. </li><li> Lagern Sie die Folien in einem kühlen, trockenen Ort bei Raumtemperatur, bis sie bereit für die Färbung. </li></ol> 8. Stain Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin - Färbung (H &amp; E) 13 <ol><li> De-Paraffin säubern die Gewebeschnitte durch die Folien über 100% Xylol Passieren zweimal, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und schließlich 1x PBS für jeweils 5 min bei Raumtemperatur. Verlassen Dias in 1x PBS, bis zum nächsten Schritt. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l H &amp; E-Lösung auf den Abschnitt und Inkubation für 1 bis 5 min, oder bis es klare Kontrast zwischen blauen Kernen und rosa Zytoplasma in einer Zelle, wie bei 10-facher Vergrößerung unter einem aufrechten Lichtmikroskop betrachtet. Achten Sie darauf, nicht zu lassen, jede H &amp; E-Lösung das Ziel berühren. </li><li> Wash H &amp; E-Lösung von Dunking die Folie in einen großen Becher Leitungswasser, dann legen Sie die Folie in einem Rack in den Becher und bündig mit fließendem Wasser für 2 Minuten von der Folie ab. </li><li> Move 9,8 Schritt die Folien zu montieren. </li></ol> 9. Stain Andere Folien für Menschen Kapillaren und Perizyten <ol><li> De-Paraffin säubern die Gewebeschnitte durch die Folien über 100% Xylol Passieren zweimal, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und schließlich 1x PBS für jeweils 5 min bei Raumtemperatur. Verlassen Dias in 1x PBS, bis zum nächsten Schritt. </li><li> Kochen Sie die Abschnitte in Antigen-Retrieval-Lösung. <ol><li> In einem 2-Liter-Becher, bereiten Antigen-Retrieval-Lösung unter Verwendung von 1x Citratpuffer (pH 7,0) bei 95 ° C auf einem Heizblock Sieden. </li><li> Nach dem Kochen legen Sie die Folien in einem Metallgestell und unterzutauchen für 20 Minuten in die siedende Antigen-Retrieval-Lösung. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Becher aus dem Heizblock mit den noch unter Wasser gleitet und die Lösung zu langsam für etwa 30 min auf Raumtemperatur zurück. </li><li> Legen Sie die Folien in 1x PBS bis zum nächsten Schritt. </li></ol></li><li> Blockieren Sie die Abschnitte in Blockierungspuffer (1x PBS, 5% Ziegenserum, 00,3% Triton X-100). <ol><li> Zeichnen Sie einen hydrophoben Kreis um die Ränder eines jeden Abschnitts mit einem PAP Stift. </li><li> Legen Sie die Folien in einer Luftfeuchtigkeit Schale mit destilliertem Wasser auf dem Boden des Fachs. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l Blockierungspuffer auf die Abschnitte dafür, dass das gesamte Gewebe von Flüssigkeit bedeckt ist (kann mehr als 100 &amp; mgr; l erfordern). </li><li> Inkubieren Abschnitte mit Puffer für 1 h blockiert. </li></ol></li><li> Inkubieren Abschnitte mit dem primären Antikörper. <ol><li> Vorbereitung einer Lösung mit zwei primären Antikörpern jeden Abschnitt Sonde für CD31 (ECs) und smooth muscle actin (Perizyten) verdünnt in Verdünnungspuffer (1 × PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100). HINWEIS: Hier, anti-CD31-Konzentration ist 01.50 und anti-Glattmuskelaktin Konzentration ist 1: 300. </li><li> Inkubieren der Abschnitte über Nacht bei 4 ° C mit 100 &amp; mgr; l primärer Antikörper in einer Feuchtigkeitsfach destilliertes Wasser enthält. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBST (1x PBS + 0,1% TweEN20) für jeweils 5 min waschen. </li><li> Inkubieren Abschnitte mit sekundären Antikörper. <ol><li> Vorbereitung einer Lösung mit einem Fluorophor konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen-Sekundär-Antikörper der Anti-CD31-Kaninchen-Antikörper in Verdünnungspuffer verdünnt, zu erkennen. <ol><li> HINWEIS: Die Glattmuskelaktin primären Antikörper bereits mit einem Cy3 Fluorophor konjugiert ist, so ist keine sekundäre Antikörper-Färbung benötigt. Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörperkonzentration beträgt 1: 250. </li></ol></li><li> Inkubieren Sie die Abschnitte 1 h mit 100 ul sekundären Antikörper in der Feuchtigkeit Fach destilliertes Wasser enthält. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBST für jeweils 5 min waschen. </li><li> Montieren Sie die Dias. <ol><li> Pipette 2 - 3 Tropfen (~ 40 - 60 &amp; mgr; l) von Antifade Montagelösung mit DAPI Kernfärbung auf jedem Abschnitt. </li><li> Sanft legen Sie eine Nr. 1.5 Deckglas über die Abschnitte und Montagelösung, so dass die Flüssigkeit über die Abschnitte, um sich auszubreiten und zu den Ränderndas Deckglas. Verwenden Sie vorsichtig mit einem Finger zu drücken aus Luftblasen, die über den Abschnitt befinden können. </li><li> Lassen Sie die Folien für mindestens 1 Stunde trocknen, bevor Handhabung. </li></ol></li></ol> 10. Quantify Kapillar - Dichte und Struktur 14 <ol><li> Zähle die Anzahl der Kapillaren in H &amp; E gefärbte Schnitte, ausgedrückt als # / mm 2. <ol><li> Erwerben Sie Fotos von vier verschiedenen Feldern an einem aufrechten Lichtmikroskop unter 40-facher Vergrößerung. HINWEIS: Die Kapillaren als Rohre mit roten Blutkörperchen gefüllt identifiziert. </li><li> Alternativ kann anstelle der manuellen Zählen Kapillaren verwenden Bildanalysesoftware (zB Wimasis Image Analysis) verschiedene Angiogenese Parameter wie Gefäßzahl, mittlere Fahrzeuglänge und Durchmesser und Verzweigungspunkte zu quantifizieren. </li></ol></li><li> Analysieren kapillare Struktur in Immunofluoreszenz-gefärbten Schnitten. <ol><li> Erwerben Sie Fotos von vier verschiedenen Feldern auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskopmit FITC und TxRed Filterwürfel. <ol><li> Verwenden Sie ein FITC Würfel Bild ECs durch Anregung bei 488 nm Wellenlänge und mit einem TxRed Würfel Bild pericytes durch Anregung bei 594 nm Wellenlänge. <style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
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			</style></li></ol></li></ol></li></ol>

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No competing financial interests enclosed.

Die Matrix Gelpfropfen Assay hat eine bequeme und leistungsfähige Methode zur Bewertung der Genregulation in Angiogenese, angiogene und antiangiogene Verbindungen in vivo erwiesen, und in vitro - Tests zu ergänzen. Hier beschreiben wir im Detail eine neuartige Matrix Gelpfropfen Test der menschlichen Angiogenese, die die Interaktion zwischen Endothelzellen und Perizyten während Gefäßbildung untersucht. Es gibt einige neuartige und wichtige Schritte in diesem Protokoll. Die Zellen in niedrigen Passage (Passage 1 - 4) sind zu bevorzugen, weil die jungen Zellen während der 14-tägigen Versuchs Einstellung mehr rentabel sein wird. Die Anzahl der Endothelzellen verwendet, ist mindestens einer Million und das Verhältnis von EC zu pericyte 5: 1; jedoch wird erhöht pericyte Zellzahl seiner Berichterstattung über Kapillaren erhöhen. Für die experimentelle Gruppe von Endothelzellen allein injiziert die Gesamtzahl der Zellen sollte die Summe von Endothelzellen und Perizyten sein, die 1,2 Millionen ist, dafüre, die Gesamtzellzahl pro Stecker konsistent ist. Es ist wichtig, die geeignete Mengen an Zellzahlen und Matrix Gelvolumen zu berechnen. Die Grundformel beträgt 1,2 Millionen Zellen in 200 &amp; mgr; l Matrix Gels. Darüber hinaus vor der Injektion zu halten Pipettenspitzen, Spritzen, matrix-Gel, und die Zellpellets auf Eis zu allen Zeiten. Da Matrix-Gel ist zähflüssig und um Luftblasen bilden, während der Zellsuspension, schneiden etwa 1 cm aus der Spitze von 1 ml Pipettenspitzen zu vermeiden, für eine bessere Strömung zu ermöglichen. Mix-Matrix-Gel nicht mit Zellen bis Mäuse bereit sind, injiziert werden. Jedes Plug-Injektion sollte weniger als eine Minute. Eine Maus kann zwei Stecker tragen, eine auf jeder Seite des Rückens. Beim Extrahieren der Stecker sicher, den Stecker zwischen den Muskel und Haut-Schichten angeordnet zu halten, dann wird die Matrix Gelpfropfen gut nach der Isolierung gesammelt werden. Die Nachteile der Matrix Gelpfropfen Assay sind, dass es zeitaufwendig, kostspielig und erfordert langwierige und heikle Schritte wie INJECtion und Stecker Isolation. Wenn diese Schritte ausfallen, würden die Ergebnisse ruiniert und würde der Prozess muss wieder mit neuen Mäusen und Materialien wiederholt werden. Jedoch ist die Daten reproduzierbar und bietet Flexibilität bei der Versuchsplanung. Zum Beispiel Wachstumsfaktoren oder Inhibitoren konnten mit dem Stecker in verschiedenen Stadien der vaskulären Entwicklung verabreicht werden, die für die Arzneimittel Validierung verwendet werden kann. Weiterhin Inkorporation von anderen Zelltypen, wie beispielsweise wachstums arretierten Zellen, transfizierten Zellinien oder Tumorzelllinien, in die Matrix Gelpfropfen ist eine weitere Möglichkeit, die endothelialen Zell-Phänotyp während der Angiogenese für die Manipulation. Unser Protokoll nutzt diese Flexibilität und führt Menschen stamm pericytes zusammen mit ECs Bildung zu ermöglichen voll funktionsfähiger, pericyte bedeckt, Hybridgefäße in vivo. Unser Protokoll beschreibt auch, wie die histologischen Schnitten von diesen Stecker für kritische Angiogenese-Endpunkte zu analysieren, einschließlich RohrAnzahl und Rohrlänge, mit diesen beiden Zelltypen.

Die Angiogenese ist der Prozess , durch den neue Blutgefäße aus einem bereits bestehenden Gefäßnetz gebildet werden 1 und steht im Mittelpunkt der laufenden Forschung in vielen Bereichen von der normalen Entwicklung von Krankheiten reichen. Dieser dynamische Prozess beinhaltet die Proliferation und Migration von endothelialen Zellen (ECs) und die Rekrutierung von Perizyten eines Gefäßrohr zu konstruieren , die in Richtung auf die Seite gerichtet ist , die zwei Sauerstoff- und Nährstoffzufuhr benötigt. Zur Untersuchung dieser Prozess einen ebenso dynamischen Test erfordert, vor allem eine, die die dreidimensionale Natur der Schlauchbildung rekapitulieren kann. In - vitro - 3D - Matrix - Assays wurden entwickelt , um diesen Bedarf zu adressieren und gearbeitet haben und Forscher zu ermöglichen , die einzelnen Schritte in Raum und Zeit zu definieren , in denen die Angiogenese Platz 3 nimmt, 4, 5, 6. Allerdings sind diese in vitro 3D - Matrix - Modelle beschränkt auf das Studium nicht-durchbluteten Gefäßen eined fehlt daher kritische Komponenten relevant für die Prozess der Angiogenese (zB Wachstum zirkulierenden und hemmenden Faktoren, unnatürliche Spannung / Kräfte über das Gefäßbett) und nicht die komplexe Umwelt in lebendem Gewebe zu simulieren. Um dieser Einschränkung, mehrere in - vivo - Angiogenese - Assays wurden 7 entwickelt, einschließlich der Matrix Gelpfropfen Assay, der im Mittelpunkt unseres Berichts wird 8, 9. Die Matrix Gelpfropfen Assay ist ein etabliertes in vivo - Angiogenese - Test, der den Forschern anspricht , wie es eine robuste Plattform bietet die Rollen von verschiedenen Zellen und Substanzen in die Angiogenese zu testen. Matrix-Gel ist ein kommerziell erhältlicher Basalmembran Lösung, die von dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkom-Zelllinie sekretiert wird, die bei 37 ° C in ein gelartiges Material erstarrt. Die Matrix-Gel kann mit Zellen und / oder Substanzen, wie Wachstumsfaktoren, gemischt werden und injesubkutan in die Maus cted. Der Host-ECs wird den Stecker über 14 Tage überfallen, ein Gefäßnetz bilden und mit dem Blut des Wirts durchblutet sind. Bislang Matrix Gelpfropfen Assays ausschließlich auf die Untersuchung der endothelialen Zellverhalten während der Angiogenese konzentriert sich jedoch auf bestem Wissen ist keine Anstrengung noch aus, um festzustellen, ob dieser Assay zur Kokultur Endothelzellen und Perizyten verwendet werden können, zu untersuchen, wie sich diese beiden Zelltypen während der Angiogenese zusammenwirken. Insbesondere ist wertvoll zwischen ECs und Perizyten die Beziehung Verständnis für Krankheiten zu studieren , wo Blutgefäßverlust pathologisch, einschließlich mikrovaskulären Ischämie und periphere Gefäßerkrankungen 10, 11, 12. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Perizyten Menschen stamm an die Matrix Gelmischung zusammen mit menschlichen ECs und Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) einführt. Diese Mischung kann dann i subkutan injiziert werdenn die dorsum von SCID-Mäusen die Bildung von voll funktionsfähig, pericyte beschichtet, Hybridgefäße zu ermöglichen. Unser Protokoll beschreibt, wie Matrix Gelpfropfen, die menschliches ECs vorzubereiten entweder mit oder ohne menschliches pericytes, Platzierung in SCID-Mäuse und wie die histologischen Schnitte für kritische Angiogenese-Endpunkte zu analysieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="806">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:115px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">0.25% Trypsin/0.53mM EDTA</td>
			<td style="width:115px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Endothelial Cell Media (ECM) kit</td>
			<td style="width:115px;">Sciencell</td>
			<td style="width:119px;">1001</td>
			<td>includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Pericyte Media (PM) kit</td>
			<td style="width:115px;">Sciencell</td>
			<td style="width:119px;">1201</td>
			<td>includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:405px;">primary human pulmonary microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:115px;">Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:405px;">primary human pulmonary pericytes</td>
			<td style="width:115px;">Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.&#160; Cells used at passage 1-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)</td>
			<td style="width:115px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>stock solution is 50ug/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 uL and stored at -20 degrees</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:115px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">28G 1cc Insluin Syringe</td>
			<td style="width:115px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice</td>
			<td style="width:115px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">1.5mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">15 mL screw top tubes, sterile</td>
			<td style="width:115px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">PAP pen</td>
			<td style="width:115px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">8899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">hemocytometer</td>
			<td style="width:115px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Nair hair removal cream</td>
			<td style="width:115px;">Walmart</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">anti-human CD31 primary antibody</td>
			<td style="width:115px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-B4737</td>
			<td>working solution is 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>working solution is 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green</td>
			<td style="width:115px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11008</td>
			<td>working solution is 1:250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Prolong Gold DAPI solution</td>
			<td style="width:115px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">8961S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">microscope slides</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48300-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">no. 1.5 cover slips</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">citrate buffer 10x</td>
			<td style="width:115px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">21545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">extra fine surgical scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">Formalin (paraformaldehyde)</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">245-685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Tissue cassettes</td>
			<td style="width:115px;">Simport</td>
			<td>M492-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">goat serum</td>
			<td style="width:115px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">X0907</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo study of human endothelial-pericyte interaction using the matrix gel plug assay in mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Repräsentative H &amp; E und Immunfluoreszenzanfärbung von Matrix Gelpfropfen Abschnitte sind in Abbildung 2 Abschnitte von EG nur Stecker einige Schiffe angezeigt werden gezeigt, die meist nicht durchblutet (Abbildung 2 oben links, schwarze Pfeile) , während Stecker , die sowohl ECs und Perizyten Anzeige mehrere perfundierter Schiffe mit größerem Durchmesser und vollständige pericyte Abdeckung, wie durch positive SMA Färbung unmittelbar angrenzend an CD31-positive ECs belegt. Diese Ergebnisse legen nahe , dass pericytes eine wesentliche Rolle spielen in im Entstehen begriffenen Blutgefäßbildung und dass dieser dynamische Prozess kann rekapituliert und leicht in einem in - vivo - Modell analysiert werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54617/54617fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Gewebe Ausrichtung Wenn die Kassette in einem Gewebe eingebettet. Nachdem die Matrix Gelpfropfen (gelb) isoliert ist, istzwischen den Muskel-Maus (lila) und die Haut (grün) Schichten. Der Stopfen wird in der Gewebekassette angeordnet, wie gezeigt, so daß alle drei Schichten über die Oberfläche zu sehen ist, die zuerst geschnitten werden während des Schneidens. A) Blick von der Spitze der Kassette, B) Blick von der Seite der Kassette. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54617/54617fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54617/54617fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54617/54617fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative H &amp; E (obere Reihe) und Immunfluoreszenz (untere Reihe) von Matrix - Gel. Bilder zeigen das Aussehen von ECs allein (linkes Bild) und ECs und gesund pericytes (PC) (rechte Bilder). Humanen und murinen ECs sind grün (unten Bilder) markiert und Perizyten (α Glattmuskelaktin (αSMA)) sind in rot (unten rechts) markiert und Kerneblau gefärbt mit DAPI-Färbung. Maßstab ist 25 um. Diese Zahl wurde 8 aus einer früheren Veröffentlichung geändert. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54617/54617fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54617/54617fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Wir stellen ein Protokoll menschlichen endothelial-pericyte Wechselwirkungen in Maus unter Verwendung einer Variation der Matrix Gelpfropfen Angiogenese-Assay zu untersuchen.

In - vivo - Studie der menschlichen Endothelial-pericyte Interaktion Mit dem Matrix - Gel - Plug - Assay in der Maus

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

in-vivo-study-human-endothelial-pericyte-interaction-using-matrix-gel

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

9.6K Aufrufe.  Stanford University.  Wir stellen ein Protokoll menschlichen endothelial-pericyte Wechselwirkungen in Maus unter Verwendung einer Variation der Matrix Gelpfropfen Angiogenese-Assay zu untersuchen. 

Serie: In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Optimierte Fibringel Bead Assay für das Studium der Angiogenese

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs are distinguished by a polyhedral lattice of clathrin that coats the vesicle membrane and serves as a mechanical scaffold. Clathrin coats are assembled during vesicle formation from individual clathrin triskelia , the soluble form of clathrin composed of three heavy and three light chain subunits7,8. Because the triskelion does not have the ability to bind to the membrane directly, clathrin-binding adaptors are critical to link the forming clathrin lattice to the membrane through association with lipids and/or membrane proteins9. Adaptors also package transmembrane protein cargo, such as receptors, and can interact with each other and with other components of the CCV formation machinery9.
Over twenty clathrin adaptors have been described, several are involved in clathrin mediated endocytosis and others localize to the trans Golgi network or endosomes9. With the exception of HIP1R (yeast Sla2p), all known clathrin adaptors bind to the N-terminal -propeller domain of the clathrin heavy chain9. Clathrin adaptors are modular proteins consisting of folded domains connected by unstructured flexible linkers. Within these linker regions, short binding motifs mediate interactions with the clathrin N-terminal domain or other components of the vesicle formation machinery9. Two distinct clathrin-binding motifs have been defined: the clathrin-box and the W-box9. The consensus clathrin-box sequence was originally defined as L[L/I][D/E/N][L/F][D/E]10 but variants have been subsequently discovered11. The W-box conforms to the sequence PWxxW (where x is any residue).
Sla1p (Synthetic Lethal with Actin binding protein-1) was originally identified as an actin associated protein and is necessary for normal actin cytoskeleton structure and dynamics at endocytic sites in yeast cells12. Sla1p also binds the NPFxD endocytic sorting signal and is critical for endocytosis of cargo bearing the NPFxD signal13,14. More recently, Sla1p was demonstrated to bind clathrin through a motif similar to the clathrin box, LLDLQ, termed a variant clathrin-box (vCB), and to function as an endocytic clathrin adaptor15. In addition, Sla1p has become a widely used marker for the endocytic coat in live cell fluorescence microscopy studies16. Here we use Sla1p as a model to describe approaches for adaptor-clathrin interaction studies. We focus on live cell fluorescence microscopy, GST-pull down, and co-immunoprecipitation methods.

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrin-mediated endocytosis depends on adaptor proteins that coordinate cargo selection and clathrin coat assembly. Here we describe procedures to study adaptor-clathrin physical interaction and live cell imaging approaches using as a model the yeast endocytic adaptor protein Sla1p.

In vivo und in vitro Studien zur Adapter-Clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Klonogene Test: adhärenter Zellen

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modellierung des Morbid Human Genome mit Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...