Wir danken Sophie Gournet um Hilfe mit Abbildungen, Julie Chaumeil für das Manuskript zu lesen, um das Tier Gehäuse Anlage und die Imaging-Plattform des Gerätes. Diese Arbeit hat die Unterstützung im Rahmen des Programms «Investissements d&#39;Avenir» erhielt von der Französisch Regierung ins Leben gerufen und umgesetzt von ANR mit den Referenzen ANR-10-LABX-0044 und ANR-10-IDEX-0001-02 PSL, die EpiGeneSys FP7-Nr. 257082 Network of Excellence zu EH ein ERC Advanced Investigator Award Nr. 250367 und EU FP7 SYBOSS gewähren Nr. 242.129 EH Die Autoren möchten die Zell- und Gewebe Imaging Platform der Genetik und Entwicklungsbiologie Abteilung (UMR3215 / U934) des Institut Curie, Mitglied des Frankreich-Bioimaging (ANR-10-InSb-04) zu erkennen, für die Hilfe bei Licht Mikroskopie.

Tierverfahren wurden in Übereinstimmung mit dem genehmigten institutionellen Tierpflege und verwenden Ausschusses des Instituts Curie (CEEA-IC) Protokolle (C 75-05-18) durchgeführt. Die Arbeit wurde auch im Rahmen der Genehmigung aus dem Französisch Ministerium für Höhere Bildung und Forschung für die Nutzung von gentechnisch veränderten Organismen (Vertragsnummer 5549CA-I) durchgeführt worden. 1. Herstellung von Kryostasisschnitte <ol><li> Sammeln Embryonen aus natürlich F1 C57BL / 6 x DBA / 2J - Mäuse ovulating wie in Shea et al., 12. Am 7. Tag der Trächtigkeit (E7), opfern 8-12 Wochen alten Maus durch Genickbruch. Sammeln Sie die gesamte conceptus dh decidua 12. </li><li> Isolieren E7 Konzepti, wie in Shea et al., 12. Legen Sie sie in einer 60 mm Petrischale mit PBS. </li><li> Frieren Sie das E7 Maus conceptus für Cryostatschnitten. <ol><li> Bereiten angepasst Aluminiumfolie Brunnen 1cm in der Höhe ( &#39;hausgemachten&#39; mit einem Glas Pasteur pipet). Abzuscheiden einen Tropfen Gewebe Einfriermedium auf dem Boden des kleinen Behälters. Hinterlegung der conceptus in der richtigen Ausrichtung (dh für Längsschnitte der conceptus sollte in seiner horizontalen Ausrichtung gehalten). </li><li> Füllen Sie das gut mit dem conceptus mit Gewebe Einfriermedium. Suspend es mit einer Pinzette in Dampf über flüssigem N 2, um es zu ermöglichen , langsam zu frieren - dann den Block in der flüssigen N 2 für ein paar Sekunden tauchen , bis es weiß wird. Anschließend übertragen Sie den Block in ein Einfrieren Fläschchen und bei -80 ° C (für mehrere Monate zu speichern). </li></ol></li><li> Vor dem Kryo-Schnitte, legen Sie den gefrorenen Block die conceptus bei -20 ° C in den Kryostaten 30 min enthält. Führen Sie Kryoabschnitte von 8 &amp; mgr; m Dicke. Kaution 4 Abschnitte auf einer Folie effiziente Befestigung zu ermöglichen. Platz Abschnitte schließen genug , um unter einem 18 x 18 mm 2 Deckglas zu passen. </li><li> Prüfen Sie die Qualität derAbschnitte (intakt und ohne Kratzer) und die Orientierung des Embryos (Längsschnitt) mit einem Stereomikroskop und die Sektionen für eine weitere Analyse auszuwählen. So schnell wie möglich, sie in einer Glasküvette ablagern und RNA FISH (siehe 3.3.2) durchführen. </li></ol> 2. Herstellung von Secondary TGCs <ol><li> Isolieren Sie die Conceptus (siehe 1.1 und 1.2). </li><li> Präparieren Sie die E7 Ectoplacental Cone (EPC) <ol><li> Verwenden Sie ein Stereomikroskop und Petrischalen mit sterilem PBS. Präparieren Sie die Decidua mit einer Pinzette. Pierce die Probe und offene Zange die beiden Seiten der Decidua auseinander zu reißen. </li><li> Shell den Embryo. Verwenden Spitzen geschlossenen feinen Pinzette (Dumont No. 5) in einer scherenartigen eigentliche Handlung des EPC aus dem Embryo zu trennen. Verwenden Sie spezielle Pflege eine perfekt saubere Probe zu erhalten, aus dem mütterlichen Gewebe trennen sowie von Chorion und Dottersack. Waschen Sie den EPC Explantate in PBS. </li><li> Mit ein wenig Löffel, übertragen einzelnen seziert EPC auf eine 4-well Platte ein steriles Deckglas in Medium enthält. </li></ol></li><li> Man leite TGCs von EPCs Kurzfristige Kulturen. <ol><li> Bereiten Sie 4-Well-Platten, die Deckgläser. Sterilisieren 12 mm Durchmesser runden Glasplättchen durch in Ethanol eingetaucht, gefolgt von flamm Trocknen. </li><li> 0,5 ml EPC Medium zu jeder Vertiefung (EPC-Medium: RPMI 1640 mit 15% FCS ergänzt, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol und Antibiotika). </li><li> Kaution Einzel-, seziert-EPCs in der Mitte des Deckglases in den Brunnen zusammen mit Kulturmedium. Verwenden feinen Pinzette den EPC auf dem Deckglas anzuwenden. Culturefor 3-5 Tage bei 37 ° C, 5% CO 2. Einzelnen Explantat bildet einen Auswuchs , die als eine Monoschicht von abgeflachten TGCs (2A) erstreckt. </li></ol></li></ol> 3. RNA-FISH HINWEIS: Die Protokolle werden auf solche auf Basis für embryonale Stammzellen ( ES- Zellen) in Chaumeil et al, 8 und Pollex und Heard 13.. <ol><li> Erweiterte PrepaRation von Stammlösungen <ol><li> Bereiten Sie eine 3 M Natriumacetat-Puffer pH 5.2. </li><li> Bereiten 2x Hybridisierungspuffer, enthaltend 40% (w / v) Natrium-Dextransulfat, 20x BSA, 400 mM Vanadyl Ribonukleosid Komplex (VRC) in 4x Saline Sodium Citrate (SSC). </li><li> Bereiten Befestigungsmedium, enthaltend 90% (v / v) Glycerol, 0,1% (w / v) p-Phenylendiamin, pH 9 in PBS. </li></ol></li><li> Frisch zubereitete Lösungen <ol><li> Bereiten Sie Fixierungslösung, bestehend aus 3% frisch zubereitet Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Bereiten Permeabilisierung Lösung 0,5% Triton-X-100 in PBS, ergänzt mit 2 mM VRC enthält. Bereiten Waschpuffer durch Mischen von 50% Formamid (FA) und 2x SSC und den pH-Wert auf 7,2 bis 7,4. </li><li> Bereiten DNA Gegenfärbungslösung, bestehend aus 1 &amp; mgr; g / ml DAPI (4 &#39;, 6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid) in 2x SSC. </li></ol></li><li> Die Fixierung und Permeabilisierung in Vorbereitung für die FISH <ol><li> Für Zellen auf Deckgläsern, waschen Sie die Zellen in 1x PBS für 5 min. Fix-Zellen auf Deckgläsern oder embryonalen Abschnitte auf Objektträger für 10 min in Fixierungsmittel (3% PFA) Lösung bei RT. </li><li> Spülen Zellen dreimal mit 1x PBS. Permeabilisierung Zellen für 5 min in eiskaltem Permeabilisierung Lösung auf Eis. Wasche die Zellen dreimal mit 70% Ethanol. Shop Deckgläser in 4-Well-Platten und Folien in 4-Dia-Transportbox in 70% Ethanol bei -20 ° C. HINWEIS: Die Deckgläser und Folien können mehrere Monate bei -20 ° C gelagert werden. Platten und Kartons mit ihnen mit Parafilm abgedichtet werden müssen, um Ethanol Verdampfung zu vermeiden. </li></ol></li><li> DNA-Sondenmarkierung <ol><li> Beschriften DNA-Sonden durch Nick-Translation unter Verwendung von fluoreszierenden Nukleotiden. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle 1) 8. </li><li> Für eine 50 ul-Reaktionsgemisch, fügen Sie 1-2 ug Plasmid, bakterielle künstliche Chromosomen (BAC) oder mehrere Displacement Amplification (MDA) (für die DNA-Amplifikation, siehe 3.4.4) DNA zu 17,5 ul Wasser, 2,5 ul 0,2 mMSR-, SG-, Cy5-dUTP, 10 &amp; mgr; l 10 mM jedes dNTP-Mix (dGTP, dATP, dCTP), 5 ul 10 mM dTTP, 5 ul 10x Nick-Translation-Puffer und 8 ul Nick-Translation-Enzym. </li><li> im Dunkeln bei 15 ° C für 16 Stunden inkubieren. Inaktivieren die Reaktion bei -20 ° C gefroren. Store Sonden für Monate bei -20 ° C. </li><li> MDA HINWEIS: Für BAC-DNA, die Menge der nach der klassischen Zubereitung erhaltene DNA ist gering, deshalb kann man vor der Markierung einen Schritt der DNA-Amplifikation verwenden, indem MDA. Verwenden Sie einen im Handel erhältlichen Kits und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle 1). </li><li> Mischen Sie 0,5 ul BAC-DNA mit 9,5 &amp; mgr; l Probenpuffer. Erhitzen Sie 3 min bei 95 ° C. Quench sofort auf Eis; lassen auf Eis 10 min. Bereiten Sie Reaktionspuffer / Enzymmischung: (9,5 &amp; mgr; l + 0,5 ul Enzym-Mix) und halten Sie auf dem Eis. </li><li> Mischen Sie 10 ul DNA-Gemisch + 10 &amp; mgr; l Reaktionspuffer / Enzymmischung. Inkubieren bei 30 ° C mindestens 20 Std. Inaktivieren Enzym durch Erhitzen Probe 10 min bei 65 &amp; #176; C. Kühlen Probe auf 4 ° C, bevor auf -20 ° C lagern. </li><li> Prüfen MDA durch die Verdauung. 1 ul MDA, 2 ul 10x - Puffer, 2 ul Hind III und 15 &amp; mgr; l H 2 O. über Nacht bei 37 ° C inkubieren. Führen Sie langsam auf einem 0,8-1% Agarose-Gel, um eine genaue DNA-Amplifikation zu bestätigen. Klare DNA-Fragmente mit hohem Molekulargewicht sollte auf dem Gel beobachtet werden. </li></ol></li><li> Probe Vorbereitung <ol><li> Verwenden Sie 0,1 oder 1 ug Sonde pro Deckglas oder Folie. HINWEIS: In 2-5 ug Cot-1 - DNA , wenn der Wettbewerb erforderlich ist , zum Beispiel die meisten Sonden , wie sie Wiederholungssequenzen , die sonst Quer hybridisieren und erhöhen Hintergrund enthalten. <ol><li> Zur Fällung, fügen 5 ug Lachssperma-DNA, 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2 und 3 Volumina Ethanol. Spin bei 16.000 xg und 4 ° C für 25 min. Waschen Sie Pellets mit 70% Ethanol und Spin-down erneut für 5 min. </li></ol></li><li> Trockene Pellet für 2 Minuten in einem Konzentrator / Geschwindigkeit vac. Resuspendieren in 100% iger FormAmid in der Hälfte des Volumens für die Hybridisierung erforderlich (zB 2,5 ul für Deckglas oder 7 ul für die embryonale Abschnitte auf Folie). Legen Sie 30 min bei 37 ° C mit in einem Thermomixer schütteln. Denaturieren für 7 min bei 75 ° C. </li><li> Quench auf Eis, oder wenn der Wettbewerb für 30-60 min direkt bei 37 ° C setzen erforderlich ist. Mischen Sie die Sondenlösung mit einem gleichen Volumen von 2x Hybridisierungslösung. </li></ol></li><li> Die Hybridisierung und Wäscht <ol><li> Entwässern; Deckgläser in Brunnen, und gleitet in einer Glasküvette, durch aufeinanderfolgende Waschen in 1x 80%, 1x 95% und 2 x 100% Ethanol für jeweils 5 Minuten. Dry Deck und Dias vollständig. </li><li> Für die Hybridisierung, gelten die 5 ul Sonde Hybridisierungsmischung (siehe 3.5) auf einen Objektträger und das Deckglas senken, mit Zellen in die Hybridisierungsmischung gegenüber. Für Abschnitte auf dem Objektträger gelten 14 ul Sonde Hybridisierungsmischung (siehe 3.5) und Deckel mit einem 18 x 18 mm 2 Deckglas. </li><li> Die Objektträger in einer feuchten Kammer (Seidenpapier getränkt50% FA / 2 × SSC) und über Nacht bei 37 ° C inkubieren, im Dunkeln. </li><li> Post-Hybridisierung Wäscht: <ol><li> 1 ml 50% FA / 2 × SSC auf das Deckglas auf der Folie um sie zu lösen; das Deckglas vorsichtig von der Folie entfernen (dabei nicht um die Zellen zu kratzen) und legen es die Zellseite nach oben in ein 4-Well-Platte 50% FA / 2 × SSC enthält. Für Abschnitte auf dem Objektträger, das Deckglas in ähnlicher Weise zu entfernen und die Folie in einer Glasküvette legen 50% FA / 2 × SSC enthält. </li><li> Führen 3 Waschungen, jeweils für 7 min mit vorgewärmtem 50% FA / 2 × SSC bei 42 ° C oder 44 ° C für Deckglas bzw. Objektträger, respectively. </li><li> Führen 3 Waschungen mit vorgewärmten 2x SSC für jeweils 5 Minuten bei 42 ° C oder 44 ° C für Deckglas bzw. Objektträger, respectively. </li></ol></li><li> Gegenfärbung Kerne durch Waschen in 2x SSC mit 1 &amp; mgr; g / ml DAPI für 3 min bei RT. Spülen Sie zweimal mit 2 × SSC. </li></ol></li><li> Montage von Deckgläser und Slides <ol><li> Für kleine Deckglas aus kultivierten TGCs gelten 5 &amp; #181; l Eindeckmedium auf einer Folie. Legen Sie die Deckzellseite nach unten auf der Oberseite des Tropfens. </li><li> Für Dia mit Abschnitten gelten 15 ul Montagemedium auf dem Objektträger. Legen Sie ein 22 x 22 mm 2 Deckglas auf der Oberseite des Tropfens. </li><li> Vermeiden Sie Blasen. Wischen Sie überschüssiges Montagelösung. Deckglasränder mit einer kleinen Menge von Nagellack. Wenn möglich, Bild gleitet sofort oder Speicher für bis zu mehrere Monate bei -20 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Mikroskopie und Analyse <ol><li> Erwerben 3D sequentielle z - Achse Bilder in 0,3 um einem Fluoreszenzmikroskop (63X - Objektiv) mit und führen Sie 14 , um die Analyse von 3D - Bildstapel die imagej Software. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Nascent RNA FISH stellt eine einfache und empfindliche Methode zur Einzelzellanalyse von Transkriptionsaktivität in embryonalem Gewebe in verschiedenen Entwicklungsstadien. Die Kraft dieses Ansatzes ist die Fähigkeit, unterschiedliche embryonale Linien zu einem bestimmten Stadium zu identifizieren nach morphologischen Kriterien. Allerdings erfordert dies auch, dass minimale Hintergrundfluoreszenz vorhanden ist. Ein solcher Hintergrund macht die Identifizierung verschiedener embryonaler Regionen und Zelltypen herausfordernd. Um sicherzustellen, minimal Hintergrund gibt es zwei kritische Schritte in diesem Protokoll. Die erste ist die Qualität der Kryoschnitt und die zweite ist die Effizienz (Signal-Rausch-Verhältnis) des RNA FISH, die auf der Ebene der Genexpression und der Qualität der Sonde abhängt. Für letztere sind Sonden daher immer auf kultivierten Zellen auf Deckgläsern getestet (embryonale Stammzellen oder somatischen Zellen), bevor auf Abschnitten zu verwenden. In diesem Protokoll stellen wir the Techniken erforderlich, um RNA FISH-Analyse auf TGCs aus zwei unterschiedlichen Typen von Probenvorbereitung (Kryostatschnitten und Primärkulturen von embryonalen Explantate) durchführen. Solche Einzelzellanalyse ermöglicht die dynamische Veränderungen in der Genexpression bei verschiedenen Postimplantationsstufen bewertet werden. Die Methoden, die wir beschreiben sekundäre TGCs zu erzeugen (bei E7-7.5 nach der Implantation Stufen) wurden in unserem Labor zur Untersuchung der X-Chromosom Inaktivierung Muster einer extra embryonale Linie verwendet, die von TGCs bei Postimplantationsstufen gebildet ist. Extra-Embryonalentwicklung in Nagetieren, hängt von der Differenzierung von TGCs. Tatsächlich sind TGCs essentiell für Plazenta und damit die embryonale Entwicklung. Defekte in TGC Differenzierung führen embryonale Letalität (zur Übersicht siehe Referenz 15). Transkriptions - Aktivität von TGCs RNA FISH erlaubt uns eine ungewöhnliche X - Chromosom Inaktivierung Status dieser Zelltyp während der Mausentwicklung 3 zu demonstrieren. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Die hier vorgestellten Methoden zu erhalten und sekundäre TGCs studieren molekularen Wege zu studieren in der Entwicklung der wichtigen extra embryonalem Gewebe sind sie Teil sowohl in normalen und mutierten Mäusen angewendet werden. Diese Ansätze könnten angepasst werden TGC Entwicklung in anderen Säugetieren zu untersuchen. Unsere Analyse umfasste die Verwendung von Wildtyp - Maus - Embryonen ermöglicht es uns , die Transkriptionsaktivität verschiedener Gene in vivo in TGCs und in in vitro TGCs von EPC Explantation abgeleitet zu beurteilen. Dieses Verfahren könnte zur Analyse von transgenen Mäusen verlängert werden und / oder durch die Zugabe von Inhibitor-Moleküle in das Kulturmedium. Wir haben erfolgreich diese Methode der RNA FISH auf einer anderen Art von TGCs, wie primäre TGCs, die in einem früheren Stadium der Entwicklung der Maus, E3.0 blastocyts, die sein können einzeln kultiviert für 4-5 Tage, in denen entwickelte Auswuchs erscheinen verwendet, die ICM werden 16,17 von großen primären TGCs umgeben. Nascent Transkripte für verschiedeneGene sowie Xist visualisiert und quantifiziert werden konnte 3 die gleiche RNA - FISH - Ansatz. Kombinierte Immunofluoreszenz und RNA FISH können auch als auch in vitro kultiviert TGCs 3 auf Kryostatschnitten durchgeführt werden. Dies zeigt, daß das Verfahren ziemlich robust ist, als primäre Transkripte sehr anfällig gegenüber Abbau sind, und es ist eine absolute Voraussetzung für RNase freien Verbindungen. IF / RNA-FISH bietet weitere Informationen zur Transkription Ebenen, zelluläre Lokalisation und Proteinexpression, gleichzeitig in einer bestimmten Zelle. Obwohl die Abschnitte von in Paraffin eingebetteten Gewebe wurden bisher verwendet worden , im Entstehen begriffenen RNA in menschlichen Tumoren zu erfassen , während Gewebemorphologie Aufrechterhaltung 18, in unseren Händen, sind Cryostatschnitten besser geeignet für die Erhaltung sowohl der im Entstehen begriffenen RNA und die für den Nachweis erforderlich Epitope , die durch Antikörper bei Immun . Zusätzlich zu den RNA-FISH, folgende imFluoreszenz, chromosomale DNA FISH kann auch auf TGCs sekundären Sonden durchgeführt werden mit Fluorochromen markiert verwenden, ähnlich denen für die RNA - FISH 3 verwendet. Fluoreszenzsonden können entweder Plasmide / Fosmide oder BACs sein, mit fluoreszierend markiertem dUTPs wie hier verwendet und beschrieben in Chaumeil et al., 8. Alternativ können fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide 19 verwendet werden. Da FISH DNA Oligonukleotidsonden einem der beiden komplementären Stränge in der Zielregion zum Ziel können nicht strang Spezifität erfordern ausgebildet sein. Verzweigte DNA - Sonden, wobei die Signalverstärkung durch zwei sequenzielle Runden von spezifischen und Verstärkersonden erreicht wird , kann auch das Signal-Rausch - Verhältnis von FISH - Signale 20 verstärkt werden. Alternativ können RNA-Sonden wie Ribosonden verwendet werden, obwohl in unserer DNA-basierten Sonden ein besseres Kompromiss zwischen Signalqualität garantieren, Spezifität und Einfachheit der Verwendung. Schließlich 3D-Bild acquisition ist wesentlich, um die gewünschte räumliche Information in diesen großen Zellen zu erhalten, und kann unter Verwendung einer Vielzahl von Fluoreszenzmikroskopen, wie dem Apotome Mikroskop oder Epifluoreszenz-Mikroskop mit Dekonvolution durchgeführt werden, wie der Deltavision (GEH) oder andere Mikroskope geeignet zur Bebilderung Gewebeschnitte und große (&gt; 20 um) TGCs. Es sollte für einzelne Kopie DNA-Loci, erfasst das punktierte Signal von im Entstehen begriffenen RNA FISH oder DNA-FISH kann nicht ohne weiteres durch konfokale Mikroskopie festgestellt werden, dass nachgewiesen werden. Abschließend sollten die Methoden, die wir hier beschreiben, nützlich sowohl für die detaillierte Analyse von TGS in einem Entwicklungskontext, sondern auch in anderen Krankheitssituationen. Viele Gene , die in TGC Entwicklung und Funktion in Nagetieren beteiligt sind , zwischen Nagern und Menschen konserviert, wie Transkriptionsfaktoren, Proteasen und Zelladhäsionsmoleküle 21. Maus TGCs sind ein Zellmodell zur Untersuchung von Genen, die Entwicklung der Plazenta eine regulierend deshalb geben Einblicke in die menschliche Plazenta-Erkrankungen. Außerdem ist es aufgrund der Tatsache, dass diese Zellen endoreplicating und da einige Krebszellen endocycle Programme greifen, zusätzlich zur Genamplifikation Verfahren werden die Methoden, die wir beschreiben, sollten auch in Einzelzell Untersuchungen hilfreich sein erforderlich Mechanismen zu erforschen führende Instabilität in Krebszellen zu genom .

Mammalian trophoblast Riesenzellen (TGCs) eine Barriere zwischen mütterlichen und embryonalen Geweben bilden. Sie vermitteln die Implantation und die Invasion des conceptus in die Gebärmutter und spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung für die Bildung der Plazenta. Sie produzieren verschiedene Wachstumsfaktoren (Zytokine) und Hormone der Prolactin / Placentalactogen Familie und Steroide, die für embryonale Wachstum und Überleben. TGCs sind groß, einkernigen und polyploiden Zellen mit einem Zellzyklus, der endocycle, dass S und G Phasen im Wechsel besteht. Tatsächlich TGCs sind endoreplicating Zellen, in der Lage 2 ohne Teilung mehrere Runden der DNA - Synthese zu unterziehen. Um die Transkriptionsstatus von Genen in vivo, in TGCs Vergleich zu anderen embryonalen und extraembryonale Zelltypen, naszierende RNA FISH zu untersuchen , können in vivo auf Kryostatschnitten 3 an bestimmten Postimplantationsschritte durchgeführt werden. TGCs sind leicht erkennbar auf Abschnitte aufgrund their Größe und ihre Transkriptions Genaktivität kann aufgezeichnet werden, aber ihre Zahl in frühen Stadien nach der Implantation ist gering. Mangel an TGCs auf E7 embryonalen Abschnitte, führte uns kurzfristige Kulturen von embryonalen trophectodermal Gewebe auszuführen differenzierte TGCs zu erhalten, um die Regulation der Genexpression während der Trophektoderm Entwicklung zu studieren. Darüber hinaus, um möglichst physiologischen bleiben, etablierte Zelllinien, dh Trophektoderm Stammzellen (TS) sind nicht immer geeignet Entwicklungsmechanismen Generation zu untersuchen sekundärer TGCs ein wertvolles Hilfsmittel für pathologische Schwangerschaften mit Defekten in TGCs durch abnorme Gen assoziiert zu studieren Regulierung bei Mäusen. Trophoblastzellen des ectoplacental Kegel (EPC) sind Vorläufer von sekundären TGCs 4. Spontane Differenzierung von kultivierten EPCs zur sekundären TGCs zuvor 5 berichtet. Jedoch im Gegensatz zu primären TGCs, Studien über Sekundär TGC differenhandlungen haben begrenzt geblieben, presumablydue auf die Schwierigkeiten der frei von mütterlichen oder embryonalem Gewebe EPC Explantate zu isolieren. Wir passten diese Methoden, um RNA-FISH auf Sekundär TGCs aus einzelnen Embryo in E7, eine Entwicklungs nach der Implantation Stadium, in dem TGCs sind nur sehr wenige abgeleitet ausführen konnte aber von EPC-Vorstufen erzeugt werden. RNA-FISH Kern Primärtranskripte zu analysieren hat nie auf der Ebene der Einzelzellebene auf Sekundär TGCs geschehen. Dies ermöglicht eine genaue Analyse der Transkription und wurde 3 verwendet die epigenetische Instabilität von TGCs bei Postimplantationsstadien zu zeigen. Ein klassisches Beispiel für die Epigenetik bei Säugetieren, das X-Chromosom - Inaktivierung (XCI) im Heard Labor 6 untersucht. Bei diesem Verfahren eine der zwei X-Chromosomen in weiblichen inaktiviert. Die nicht codierende Transkript Xist beschichtet das X - Chromosom , von dem sie in weiblichen Zellen exprimiert und löst silencing der meisten Gene. Mit RNA-FISH,Entstehen begriffenen Transkripte von X-chromosomale Gene können wie auch die Anhäufung von Xist - RNA auf dem inaktiven X - Chromosom (Xi) untersucht werden. Wir beschreiben hier ein Verfahren zur RNA-FISH auf Abschnitten nach der Implantation Embryonen und auf Kurzzeitkulturen von EPC durchführen. Dieses Protokoll von denjenigen , die angepasst XCI verwendet wurden 7-11 in differenzierenden weiblichen embryonalen Stammzellen und Präimplantationsembryonen zu studieren. Wir stellen Beispiele von XCI in weiblichen Embryonen in vivo sowie in vitro TGCs.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Pascheff-Wolff</td><td>Moria</td><td>MC19</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Roth</td><td>PK78.1</td><td></td></tr><tr><td>4-well tissue culture dishes&amp;nbsp;</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dishes Falcon</td><td>Dutsher, France</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dishes Falcon</td><td>Dutsher, France</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 18 mm x 18 mm&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>631-1331</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 22 mm x 22 mm</td><td>VWR</td><td>631-0125</td><td></td></tr><tr><td>12 mm glass round coverslips&amp;nbsp;</td><td>Harvard apparatus</td><td>64-0712</td><td></td></tr><tr><td>Slides Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>4-slide Transport&amp;nbsp; box&amp;nbsp; Lockmailer</td><td>Dutsher, France</td><td>40684</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes 1.8 ml Corning&amp;nbsp;</td><td>Fisher Science</td><td>10418571</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coplin staining jars</td><td>Fischer Scientific</td><td>W1561L</td><td></td></tr><tr><td>TissueTek O.C.T compound</td><td>VWR</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Invitrogen</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>10x&amp;nbsp; is used</td></tr><tr><td>Water&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Panreac Quimica, Spain</td><td>141451</td><td>3% in PBS</td></tr><tr><td>Triton-X-100&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>&amp;nbsp;2000-A</td><td>0.5% final</td></tr><tr><td>Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs, USA</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dextran sulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin&amp;nbsp; (BSA)</td><td>New England Biolabs, USA</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671-1L-F</td><td>&amp;nbsp;aliquots kept at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Illustra TempliPhi&amp;nbsp; Kit Construct (Kit MDA)</td><td>Dutsher, France</td><td>25-6400-80</td><td></td></tr><tr><td>Nick translation kit</td><td>Abbott, USA</td><td>07J00-001</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC buffer concentrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;S6639</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum green dUTP&amp;nbsp;</td><td>Abbott, USA</td><td>02N32-050</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum red dUTP&amp;nbsp;</td><td>Abbott, USA</td><td>02N34-050</td><td></td></tr><tr><td>Cy-5 dUTP&amp;nbsp;</td><td>Dutsher, France</td><td>PA55022</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Cot-1 DNA&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18440016</td><td></td></tr><tr><td>DNA, MB grade</td><td>Invitrogen</td><td>Roche</td><td>DNA from fish sperm</td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>p-phenylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695106</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5417R</td><td>Eppendorf, Germany</td><td></td><td>molecular biology grade</td></tr><tr><td>Eppendorf concentrator plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquiport Liquid pump</td><td>KNF Neuberger, Trenton, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shake&#039;N&#039;Bake Hybridization oven</td><td>Boekel Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryostat&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>CM3050</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptional analysis by nascent rna fish of in vivo trophoblast giant cells or in vitro short-term cultures of ectoplacental cone explants

Die Plazenta leitet sich von einer extraembryonalen Linie, die Trophektoderm. In der peri-Implantation murine Blastozysten, unterscheiden Wand Trophektoderm Zellen in primäre trophoblast Riesenzellen (TGCs), während die polare Trophektoderm der inneren Zellmasse liegt, später zu wuchern weiter in sekundäre TGCs unterscheiden. TGCs spielen eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung der Plazenta und sind essentiell für eine erfolgreiche Schwangerschaft. Untersuchung der Transkriptionsregulation bestimmter Gene während nach der Implantation Entwicklung kann Einblicke in TGCs geben Entwicklung. Zellen des ectoplacental Kegels (EPC) von Embryonen bei 7-7,5 Tagen der Trächtigkeit (E7-7.5), von dem polaren Trophektoderm abgeleitet, differenzieren sich in Sekundär TGCs 1. TGCs kann in situ auf Kryostatschnitten von Embryonen bei E7 untersucht werden , obwohl die Anzahl von TGCs in diesem Stadium sehr niedrig ist. Ein alternatives Mittel sekundären TGCs der Analyse ist kurzfristige Kulturen einzelner EPCs von E7 Embryo zu verwenden,s. Wir schlagen vor , eine Technik , die Transkriptionsstatus von Genen von Interesse in vivo sowohl und auf der Ebene einzelner Zellen in vitro zu untersuchen , unter Verwendung von Fluoreszenz in situ Hybridisierung (RNA FISH) im Entstehen begriffenen Transkripte zu visualisieren. Diese Technik liefert eine direkte Auslesung der Genexpression und erlaubt die Beurteilung der chromosomalen Status TGCs, die große endoreplicating Zellen sind. Tatsächlich ist ein wesentliches Merkmal der terminalen Differenzierung von TGCs, dass sie den Zellzyklus zu verlassen und durchlaufen mehrere Runden von endoreplication.This Ansatz kann angewendet werden, um Expression eines beliebigen Gens von Autosomen und / oder Geschlechtschromosomen exprimiert zu erkennen und wichtige Informationen in Entwicklungs liefern Mechanismen sowie Plazentakrankheiten.

TGCs in der conceptus und ihre Größe, ihre Lokalisation durch auf E7 Abschnitte auf DAPI-Färbung identifiziert werden. Dies ist in Figur 1A auf einem Längsschnitt veranschaulicht. RNA-FISH wurde auf solche embryonalen Abschnitte durchgeführt, um X-Chromosom-Inaktivierung in dieser extra embryonale Linie studieren. Mehrere Folien oder Deckgläser können gleichzeitig verarbeitet werden. Durch die Verwendung von verschiedenen Farbstoffen RNA unterschiedlicher Gene zu kennzeichnen, kann man verschiedene primäre Transkripte in demselben Kern detektieren. Mindestens zwei Sonden können miteinander vermischt werden, zum Beispiel Xist gekoppelt SG (grünes Signal) und ATRX gekoppelt SR (rotes Signal). Ein Beispiel eines weiblichen TGC ist in 1B gezeigt , wo zwei anderen Linien dargestellt sind, den Embryo richtige (E) und dem viszeralen Endoderm (VE). Ein TGC Kern ist mit Xist - RNA für den X chrom gezeigtOsome, die inaktiviert (Xi), während das andere X-Chromosom, die aktiv (Xa), ist ein paar Pünktchen zeigt. X-chromosomal - Gen ATRX primäre Transkripte aus dem aktiven X - Chromosom exprimiert (nicht von Xist dekoriert) in mehreren Kopien aufgrund Endoreplikation. Dies zeigt monoallelic Ausdruck zB Inaktivierung von ATRX auf ein X - Chromosom. Da TGCs in Größe heterogen sind , wie in 2B dargestellt, werden nur die größten aufgezeichnet. Drei Sonden kann auch , wie dargestellt in 2C für die Sekundär TGCs verwendet. In diesem Fall Xist -SG (grün), zwei X-chromosomale Gene: G6PD -SR (rot) und Huwe1 -Cy (Magenta) wurden in der gleichen Zeit in dem gleichen Kern analysiert. Während G6PD monoallelically wie hier gezeigt ausgedrückt wird (und zuvor in sekundären TGCs 3 dargestellt) Huwe1 ist biallelically ausgedrückt seine pr demonstrierenoperty zu entkommen XCI. Endoreplikation, mit mehreren pinpoints dh, im Entstehen begriffenen Transkripte Kopien, ist auch offensichtlich. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig1.jpg" /> Abbildung 1. Primäre Transkriptexpression in TGCs von E7 weibliche embryonale Abschnitt. (A) Längsschnitt des conceptus E7 mit DAPI gefärbt. Der Embryo und extraembryonale Gewebe werden durch die Mutter Gewebe, die Decidua umgeben. Die Lokalisierung der verschiedenen Linien wird auf DAPI-Färbung mit 5X Ziel gemacht. TGCs sind aufgrund ihrer Größe identifiziert. Ch, Chorion, E, Embryo, EPC, ectoplacental Kegel, VE, viszeralen Endoderm, TGC, trophoblast Riesenzellen. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. (B) Eine stärkere Vergrößerung der boxed-in - Bereich in A (63X - Objektiv) RNA FISH. ATRX primären Transkripts in rot und Xist - RNA in grün auf der 3 Abstammungslinien = E sichtbar gemacht werden, VE, TGC. scale bar = 10 &amp; mgr; m. Beispiel für eine in vivo TGC wo ATRX wird monoallelically ausgedrückt (Xa, Pfeilspitze) und leise auf der Xist -beschichteten X - Chromosom (Xi); mehrere ATRX Signale auf dem Xa gesehen sind aufgrund Endoreplikation. ATRX = BAC - Klon RP23-260I15. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54386/54386fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54386/54386fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig2.jpg" /> Abbildung 2. Primäre Transkriptexpression in sekundären TGCs von EPC abgeleitet. (A) Gesamtansicht der wachsenden Sekundär TGCs (x5 Ziel). Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m. (B) Asterisk zeigen Beispiel von TGCs nach ihrer Größe (10X - Objektiv). Maßstabsbalken = 60 &amp; mgr; m. (C) Beispiel eines sekundären weiblichen TGC RNA FISH mit der Verwendung von drei Sonden (Xist domain in grün, das inaktivierte X - Chromosom abdeckt: Xi) Endoreplikation von G6PD und Huwe1 Primärtranskripte (mehrere pinpoints, in Rot und Magenta zeigt). Während G6PD monoallelically ausgedrückt wird, ist Huwe1 Ausdruck biallelic in diesem Kern Huwe1 = BAC - Klon RP24-157H12;. G6PD = BAC - Klon RP23-13D21. Xi = Pfeil; Xa = Pfeilspitze (63X-Objektiv). Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54386/54386fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54386/54386fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

Transkriptions-Analyse von RNA Nascent FISH<em&gt; In Vivo</em&gt; Trophoblast-Riesenzellen oder<em&gt; In Vitro</em&gt; Kurzfristige Kulturen von Ectoplacental Cone Explantate

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

transcriptional-analysis-nascent-rna-fish-vivo-trophoblast-giant

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

7.8K Aufrufe.  Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3215, INSERM U934. Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones. 

Serie: Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

Forschung

Genetik

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

Menschliche Primär Trophoblast Zellkulturmodell die schützende Wirkung von Melatonin gegen Hypoxie / Reoxygenierung induzierte Störung zu studieren

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Entwicklungsbiologie

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients and waste between the mother and fetus and the production and delivery of growth factors and hormones. Placental genetic manipulations in mice are critical for understanding the placenta's specific role in prenatal development. Placental-specific Cre-expressing transgenic mice have varying effectiveness, and other methods for placental gene manipulation can be useful alternatives. This paper describes a technique to directly alter placental gene expression using CRISPR gene manipulation, which can be used to modify the expression of targeted genes. Using a relatively advanced surgical approach, pregnant dams undergo a laparotomy on embryonic day 12.5 (E12.5), and a CRISPR plasmid is delivered by a glass micropipette into the individual placentas. The plasmid is immediately electroporated after each injection. After dam recovery, the placentas and embryos can continue development until assessment at a later time point. The evaluation of the placenta and offspring after the use of this technique can determine the role of time-specific placental function in development. This type of manipulation will allow for a better understanding of how placental genetics and function impact fetal growth and development in multiple disease contexts.

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

Here we describe a time-specific method to effectively manipulate critical developmental pathways in the mouse placenta in vivo. This is performed through the injection and electroporation of CRISPR plasmids into the placentas of pregnant dams on embryonic day 12.5.

Maus-In-vivo-Plazenta-gezielte CRISPR-Manipulation

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Biochemie

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Biologie

Analyzing Angiogenesis: In Vitro Assay for Tube Formation on BM Matrix

Trophoblast Cell Recovery from Angiogenesis-Tube Formation Assay for Differentiation Marker Expression Analysis

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of mesenchymal to endothelial-like transition. Traditionally, this process is evaluated by an in vitro tube-formation assay, where the cells organize themselves into tube-like structures when seeded over a polymerized basement membrane preparation. Although several structural features can be measured in photomicrographs of the structures, to assess the real commitment of EVT to the endothelial-type phenotype, biochemical analysis of cell extracts is required. Scraping the cells from the culture dish to obtain RNA and/or protein extracts is not an alternative since the tube-like structures are severely contaminated by the bulk of proteins from the polymerized basement membrane. Thus, a strategy to separate the cells from the basement membrane proteins prior to the preparation of cell extracts is needed. Here, a simple, fast, and cost-effective method to recover the tube-like structures from the in vitro tube-formation assay and the subsequent analysis by biochemical techniques is presented. Tube-like structures formed by HTR8/SVneo cells, an EVT cell line, were liberated from the polymerized basement membrane by a short incubation with PBS supplemented with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). After serial washes, a ready-to-use pellet of purified tube-like structures can be obtained. This pellet can be subsequently processed to obtain RNA and protein extracts. qPCR analysis evidenced the induced expression of VE-cadherin and alphav-integrin, two endothelial cell markers, in EVT-derived tube-like structures compared to control cells, which was consistent with the induction of the endothelial cell marker, CD31, evaluated by immunofluorescence. Western blot analysis of the tube-like structures' protein extracts revealed the overexpression of RECK in transfected HTR8/SVneo cells. Thus, this simple method allows to obtain cell extracts from the in vitro tube-formation assay for the subsequent analysis of RNAs and protein expression.

The present protocol allows the recovery of tube-like structures formed in the classical in vitro angiogenesis-tube formation assay where cells, such as trophoblast cells, organize in capillary-like structures over a layer of extracellular basement membrane matrix. The recovered structures are used for RNA and protein isolation for various biochemical analyses.

During placenta development, extravillous trophoblast (EVT) cells invade the maternal decidua to remodel the uterine spiral arteries by a process of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Transkriptions-Analyse von RNA Nascent FISH

Zusammenfassung

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