We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.

HINWEIS: Die Patienten sollten informierte Zustimmung geben in den pluripotenten Institutional Review Board und Menschliche Zelle Ausschuss Stem Studie genehmigt teilzunehmen. 1. Isolierung und Kultur von TIL <ol><li> Erhalten Tumormaterial, das für die histopathologische Diagnose aus der Pathologie Service / Gewebebeschaffung Kern nicht erforderlich ist. Platzieren 20-100 g Tumorproben in einer 50-ml - Röhrchen mit 30 ml Tumorsammelmedium (Tabelle 1). </li><li> Präparieren Sie fest, fest, normales Gewebe der Tumorprobe von zerbrechlichen und / oder blutiger Nekrosen mit einer Schere. Nach dem nekrotischen Gewebes zu entfernen, verwenden Sie die Schere, um die Probe so klein wie möglich zu Hackfleisch. </li><li> Dissoziieren Das zerkleinerte Probe in eine Einzelzellsuspension ein Dissociator und Tumor Dissoziation Kit (human) nach den Anweisungen des Herstellers. Filtern Sie die Suspension mit einer 70 &amp; mgr; m Zellsieb, die auf einem 50-ml-Röhrchen gesetzt und waschen Sie das Sieb 2 mal mit2 ml RPMI 1640. </li><li> Zentrifuge bei 200 × g bei Raumtemperatur für 5 min. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in 10 ml T - Zell - Medium (Tabelle 1). </li><li> Vorbereiten eines zweistufigen Gradienten Lösung wie Ficoll (Gradient Lösung) in einem 50-ml-Röhrchen, mit einer unteren Stufe von 10 ml 100% -Gradienten-Lösung und einer mittleren Stufe aus 30 ml 75% Gradienten-Lösung mit Dulbeccos phosphatgepufferter verdünnt gepufferte Salzlösung, kein Kalzium, kein Magnesium (D-PBS (-)). </li><li> Schicht, die die Zellsuspension (aus Schritt 1.4) auf dem Gradienten-Lösung (aus Schritt 1.5). Zentrifuge bei 400 × g bei 20 ° C für 45 min. </li><li> Sammeln Sie die Schicht der angereicherten TILs an der Grenzfläche zwischen dem 100% Gradienten-Lösung und 75% Gradienten-Lösung in einem 50 ml Röhrchen mit. Verdünne die Schicht der Lösung mit den angereicherten TILs durch Zugabe von 20-30 ml D-PBS (-). </li><li> Zentrifuge bei 200 × g bei Raumtemperatur für 5 min. Überstand verwerfen und resuspendieren TIL angereicherte Fraktion in 10 mlder T-Zellmedium. </li><li> Kultur die Fraktion (aus Schritt 1.8) mit 2 ml der T - Zellmedien und 6000 IU / ml rekombinantes menschliches (rh) IL-2 in einer 6-Well - Platte bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Ändern Sie die Hälfte der Medien am Tag 5 nach Kulturbeginn und alle 2-3 Tage danach. </li><li> Aufgeteilt, die Zellen in einem Verhältnis von 1: 2 ohne Trypsinisierung nach sanft Suspendieren Verdoppelung der Anzahl der Vertiefungen, wenn 80-90% Konfluenz erreichen. Fügen Sie eine halbe Volumen (1 ml) von frischen T-Zell-Medien und rhIL-2 bei 6.000 IU / ml. </li></ol> 2. Herstellung von Mitomycin-C-behandelten SNL Feeder Zellen-Platte <ol><li> Kultur SNL feeder - Zellen in 10 ml von SNL feeder Zellmedien (Tabelle 1) auf einem 0,1% Gelatine beschichteten 10 - cm - Schale , bis 80-90% Konfluenz (3-4 x 10 6 Zellen) erreicht ist . </li><li> In 310 ul von 0,4 mg / ml Mitomycin C - Lösung direkt in die SNL Feeder - Zellkulturschale und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2 für 2 Stunden und 15 Minuten. Saugen Sie das Medium einnd die Zellen werden zweimal mit 5 ml D-PBS (-). </li><li> 0,5 ml von 0,25% Trypsin / 1 mM EDTA und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur, um die Zellen dissoziiert. In 4,5 ml SNL Feeder-Zellmedien zu neutralisieren und resuspendieren die Zellen in einer einzigen Suspension. </li><li> Übertragen Sie die Zellen in eine 15-ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 200 g für 5 min. Aspirieren die Medien und Zählen der Zellen mit einem Hämozytometer nach Resuspendieren in 10 ml SNL Feeder-Zellmedien. </li><li> Platte 1,5 x 10 6 Zellen pro Vertiefung der SNL - Feeder - Zellen auf einer 10 cm Schüssel und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2. Verwenden Sie die SNL-Feeder-Zellen innerhalb von 3 Tagen. </li></ol> 3. Erzeugung von iPS-Zellen Verwendung des Sendai-Virus (SeV) Vector <ol><li> Ernten Sie die TIL (aus Schritt 1.11) und aktivieren 5 x 10 5 Zellen von TIL mit plattengebundenen Maus anti-human CD3 (1 ug / ml) und löslichen Maus - Anti-Human - CD28 (5 ug / ml), mit rhIL-2 (6000 IU / ml) in 2 ml T-Zell-Medium in einer Platte mit 6 Vertiefungen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 5 Tage. </li><li> Ernten Sie die TIL (aus Schritt 3.1) in einem 15-ml-Röhrchen mit einer Pipette und die Zellzahl mit einem Hämozytometer zählen. </li><li> Reaktivieren 1 x 10 5 Zellen von TILs mit Platte-gebundenen Maus - anti-human CD3 (1 &amp; mgr; g / ml) und löslichem Maus anti-human CD28 (5 &amp; mgr; g / ml), mit rhIL-2 (60 IU / ml) in 500 ul der Reprogrammierung Medien (Tabelle 1) pro Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24 Std. Bereiten Sie 3 Brunnen für SeV Infektion: OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC (1 gut); SeV-Infektion (GFP: grün fluoreszierendes Protein) (1 gut); und Zellzahl (1 gut). </li><li> Nach 24 Stunden (aus Schritt 3.3), die Zellzahl mit einem Hämozytometer zählen und das Volumen jedes Virus für verschiedene (3-20) Multiplizitäten der Infektion (MOI) bestimmen. Entfernen Sie eine Reihe von Vektor-Rohre Sendai-Virus von -80 ° C-Lagerung. Auftauen SeV Vektoren schnell in einem Wasserbad (37 ° C) und legen Sie sie auf Eis. Volumen-Virus (ul)= MOI (CIU / Zelle) x Anzahl der Zellen / Titer des Virus (CIU / ml) × 10-3 (ul / ml) </li><li> Die berechnete Volumina jeder der vier Sendai-Virus-Vektor Rohre, die einzeln durch OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC, indem eine Mischung von SeV Vektoren bei 10-20 MOI in die Medien Zugabe einschließlich aktivierten TILs. </li><li> Um die Transduktionseffizienz zu bestimmen müssen die berechneten Volumina von SeV-GFP in eine Vertiefung aktiviert TIL. </li><li> Die Schale (aus Schritt 3.5 und Schritt 3.6) im Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24 Stunden. Nach 24 Stunden Schätzung mit TIL infiziert mit SeV-GFP unter Fluoreszenzmikroskopie die Infektionseffizienz. </li><li> Sammeln Sie die Zellen (aus Schritt 3.5) in einem 15-ml-Tube. Zentrifuge bei 200 × g bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Überstand verwerfen und das Pellet in 0,5 ml hESC Medien mit Primas ES Zellmedium und basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 4 ng / ml). </li><li> Übertragen Sie die Suspension in eine 10 cm-Schale, die ContaIns SNL feeder-Zellen in 10 ml HES Medien Mitomycin-C-behandelten. Ändern Sie die hESC Medien jeden zweiten Tag, bis die Kolonien angebaut werden. </li><li> Um Tag 18 bis 21, entfernen Sie die Feeder-Zellen SNL um die Kolonien unter dem Mikroskop eine 10-ul Spitze in der Sterilbank verwenden. </li><li> Schaben die Kolonien eine 10-ul Spitze mit und übertragen sie mit Hilfe eines 200-ul Spitze in 100 ul iPSCs Medien pro Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte. Pipettieren nach oben und unten auf 2-3 mal mit einer durchschnittlichen Größe von 50 bis 100 &amp; mgr; m, die Kolonien in kleine Klumpen zu brechen. </li><li> Übertragen, um die kleinen Klumpen in 6-Well-Gewebekulturplatten mit Mitomycin-C-behandelten SNL feeder-Zellen (aus Schritt 2) in 2 ml pro Vertiefung iPSCs Medium mit basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 4 ng / ml). Ändern Sie jeden Tag iPSCs Medien. </li><li> Übertragen Sie die iPS-Zellen zu 6-Well-Gewebekulturplatten mit frischem Mitomycin-C-behandelten SNL-Feeder-Zellen mit 1 mg / ml Kollagenase IV alle 5-6 Tage. Bereiten Sie zwei Vertiefungen pro Platten jeder Klon für Immunostaining. </li><li> Bestimmen Sie die vollständige Neuprogrammierung jedes Klons durch immunhistochemische Färbung von Pluripotenz Marker (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 und OCT3 / 4) 1. HINWEIS: Für die weitere Auswertung der Pluripotenz Potenzial, bestätigen , dass komplett neu programmiert iPSC Linien in drei Keimblätter durch eine Embryoidkörperbildung Bildung 16 und Differenzierungstest oder ein Teratom Bildungstest unterscheiden kann. </li><li> Bestätigen Sie, dass komplett neu programmiert iPSC Linien einen normalen Karyotyp durch zytogenetische Analyse zeigen. </li><li> Für Teratom Bildung eine undifferenzierte TIL stamm iPSC (1 x 10 6) Suspension in 100 ul DMEM , enthaltend 10% FCS in das subkutane Gewebe von 6-8 Wochen alten weiblichen NOD / SCID - Mäuse injiziert. Stain teratoma Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin. </li></ol> 4. Immunfluoreszenzanfärbung von iPS-Zellen für SSEA3, SSEA4, TRA1-60 und TRA1-81 <ol><li> Wash iPSCs mit 1 ml PBS und fixieren die iPS-Zellen mit 1 ml von 4% paraformaldehyde Lösung für 10 min. Entfernen Sie die 4% Paraformaldehydlösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml 3 mal PBS. HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Paraformaldehyd zu verwenden, da es giftig ist. </li><li> Vorzubehandeln die iPSCs mit Blocking - Puffer (Tabelle 1) für 30 min. Inzwischen verdünnen die primären Antikörper (Ratte anti-human SSEA3, Maus anti-human SSEA4, Maus anti-human TRA1-60 und Maus anti-human TRA1-81) 01.50 in 1,5% Ziegenserum-Lösung verdünnt mit PBS und Triton X -100 (Gesamtvolumen: 1 ml). </li><li> Entfernen des Blockierungspuffers (Tabelle 1). Fügen Sie den verdünnten primären Antikörperlösung und Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Inzwischen verdünnen dem sekundären Antikörper (anti-Maus IgG und IgM oder anti-Ratte-IgM) 01.50 in 1,5% Ziegenserum-Lösung. </li><li> Entfernen Sie die verdünnten primären Antikörperlösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml PBS 3 mal für je 5 min. In der verdünnten sekundären Antikörper-Lösung und Inkubation für 45 Minuten bei Raumtemperatur in einem dunklen Raum. </li&gt; <li> Entfernen Sie die verdünnten sekundären Antikörper-Lösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml PBS 3 mal für je 5 min. Beachten Sie die iPS-Zellen mit Immunfluoreszenzmikroskopie. </li></ol> 5. Immunfluoreszenzanfärbung von iPS-Zellen für Oct3 / 4 <ol><li> Wash iPSCs mit 1 ml PBS und fixieren die iPS-Zellen mit 1 ml 4% Paraformaldehydlösung für 10 min. Entfernen Sie die 4% Paraformaldehydlösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit PBS 3 mal. </li><li> Hinzufügen Permeabilisierung Puffer (Tabelle 1) und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Permeabilisierung Puffer und fügen Blocking - Puffer (Tabelle 1). </li><li> für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Inzwischen verdünnen den primären Antikörper (Maus anti-human Oct3 / 4) 01.50 in Blocking-Puffer. </li><li> Fügen Sie den verdünnten primären Antikörperlösung und Inkubation über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie die verdünnten primären Antikörperlösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml PBS 3 mal für je 5 min. Inzwischen diLaute der sekundäre Antikörper (Ziege-anti-Maus-IgG / IgM) 1: 100 in Blockierungspuffer. </li><li> In der verdünnten sekundären Antikörper-Lösung und Inkubation bei Raumtemperatur in einem dunklen Raum für 45 min. </li><li> Entfernen Sie die verdünnten sekundären Lösung und waschen Sie die iPS-Zellen mit 1 ml PBS 3 mal für je 5 min. Beachten Sie die iPS-Zellen unter Immunfluoreszenzmikroskopie. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Hier haben wir gezeigt, ein Protokoll für die Umprogrammierung Melanom TIL zu iPS-Zellen von SeV-vermittelte Transduktion der vier Transkriptionsfaktoren OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC. Dieser Ansatz, der eine SeV - System unter Verwendung von T - Zellen umprogrammieren, bietet den Vorteil einer nicht-integrierenden Verfahren 7. Eine frühere Studie zeigte , dass ein SeV Umprogrammierung System war sehr effizient und zuverlässig nicht nur Fibroblasten neu zu programmieren , sondern auch dem peripheren Blut - T - Zellen 7,17. Darüber hinaus haben wir das Melanom TILs kürzlich gezeigt , dass differenzierteres und exprimieren höhere inhibitorische Rezeptoren wie PD-1 als periphere Blut - T - Zellen SeV 16 Vektoren können auch neu programmiert werden. Zeitpunkt der Stimulation mit anti-CD3 / CD28 und Infektion mit SeV-Vektor war kritisch in Umprogrammierung TIL. Periphere Blut - T - Zellen mit anti-CD3 und IL-2 zur Umprogrammierung unmittelbar nach der Ernte aus dem Subjekt 7, stimuliert werden while TIL müssen für 3-4 Wochen mit IL-2 vor der Stimulation kultiviert werden. Obwohl mehr als 99% der TIL CD8 - T - Zellen wurden nach 3-4 Wochen der Kultur mit IL-2 und Aktivierung mit anti-CD3 / 16 CD28, wir empfehlen Analyse der TCR - Umlagerung in iPS - Zellen zu bestätigen , dass erzeugte iPSCs von TIL sind (Abbildung 5). Zu beachten ist , angegeben unsere früheren Studien einschließlich , dass alle iPSCs erzeugt SeV aus einkernigen peripheren Blutzellen unter Verwendung oder TIL hatte TCR Umlagerung 7,16. Obwohl Erzeugung iPSCs von Melanomen TILs machbar war, fanden wir , dass die Umprogrammierung Effizienz von Melanomen TILs niedriger war (0,01-0,05%) 16 als die peripheren Blut - T - Zellen (0,1%) 7. Der Grund dafür ist unklar, aber es könnte mit der höheren Expression der inhibitorischen Rezeptoren oder die größere Anzahl von differenzierten T-Zell - Untergruppen in TILs 13,16 zugeordnet sein. Neue bedeutende Fortschrittefür eine Neuprogrammierung Technologie kann die Neuprogrammierung Effizienz zur Erzeugung von TIL-iPS-Zellen zu verbessern. Die zweite Generation des SeV - Vektor wurde TS12KOS, fand eine höhere Effizienz der iPS - Generation zu haben , als die herkömmliche SeV - Vektor in der früheren Studie 18,19 verwendet. Obwohl die Gewinnung menschlicher iPSCs mit SeV Umprogrammierung System möglich ist, gibt es mehrere Einschränkungen in diesem Protokoll in Betracht gezogen werden. Wir verwenden fötalen Rinderserum bei SeV-Infektion in diesem Protokoll. Wir fanden heraus, dass die Umprogrammierung Effizienz von Melanomen TIL deutlich geringer war, wenn Medien mit menschlichem Serum bei SeV-Infektion im Vergleich zu einem mit fötalen Rinderserum, trotz ähnlicher Verbreitung von TIL verwenden. Wir verwenden auch eine Maus-Feeder-Schicht für iPSC Erzeugung und Wartung, sondern eine definierte Feeder frei und Xeno-freies System alternative Methoden in zukünftigen Studien sein kann. Es dauert etwa zwei Monate ab dem Zeitpunkt der Tumor Ernte zu erzeugen iPSCsvon Melanom TIL. Darüber hinaus würde es weitere 1-2 Monate dauern, gentechnikfreien iPSCs zu erhalten. Dies könnte durch die Verwendung des neuen Typs von SeV Vektor verkürzt werden, TS12KOS, die eine effizientere Viruseliminationsrate 19 gezeigt hat. Im Ergebnis ist die Erzeugung von menschlichen iPSCs von Melanomen TILs machbar. Das aktuelle Protokoll kann ein wichtiger Schritt zum Erzeugen einer unendlichen Zahl von tumorspezifischen T-Zellen für die adoptive T-Zell-Therapie sein.

Reprogrammierung Technologie , die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS - Zellen) über die Überexpression eines definierten Satz von Transkriptionsfaktoren erlaubt ist sehr vielversprechend im Bereich der zellbasierten Therapien 1,2. Diese iPS - Zellen zeigen Transkriptions und epigenetische Merkmale und haben die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Pluripotenz, ähnlich wie embryonale Stammzellen ( ES- Zellen) 3-5. Bemerkenswerte Fortschritte bei der Reprogrammierung Technologie im letzten Jahrzehnt gemacht hat uns menschliche iPS - Zellen auch aus ausdifferenzierten Zellen, wie T - Zellen 6-8 zu erzeugen , erlaubt. T - Zellen abgeleiteten iPSCs (TiPSCs) die gleiche Konfiguration neu angeordnet T - Zell - Rezeptor (TCR) Kettengene wie die ursprünglichen T - Zellen behalten, die Regeneration von antigen-spezifischen T - Zellen aus TiPSCs 9-11 ermöglicht. Fast 80% der Melanom-infiltrierenden Lymphozyten (TILs), erhalten von einem Patienten Tumor speziell tumorassoziierten Antigenen erkennen and halten Zytotoxizität gegen den ursprünglichen Krebszellen 12. Bemerkenswerterweise wurde die Expression des programmierten Zelltods protein-1 (PD-1) auf TILs fand die autologe Tumor-reaktiven Repertoire, einschließlich mutierter Neoantigen-spezifischen CD8 + Lymphozyten identifiziert 13. Der adoptive Transfer von Ex-vivo expandierte autologe TIL in Kombination mit präparativen lymphodepleting Regimen und systemische Verabreichung von Interleukin-2 (IL-2) kann in Untergruppen von Patienten 14 erhebliche Regression von metastatischem Melanom verursachen. Trotz Ergebnisse in präklinischen Modellen zu fördern und bei Patienten, schlechte Überleben infundiert T-Zellen und die Existenz von immunsuppressiven Wege erscheinen, das volle Potenzial von Adoptiv T-Zell-Therapie nicht zu gefährden. Aktuelle klinische Protokolle erfordern umfangreiche ex vivo Manipulation von autologe T - Zellen, um eine große Zahl zu erhalten. Dies resultiert in der Erzeugung von terminal differenzierten T-Zellen, die eine schlechte Überleben haben, reduziert proliferative Kapazität und ein hohes Maß an PD-1 15. Diese Beschränkung der adoptiven T-Zelltherapie kann theoretisch durch Verwendung von iPS-Zellen überwunden werden, die eine unbegrenzte Quelle autologer T-Zellen für die Immuntherapie zur Verfügung stellen kann. Wir haben vor kurzem berichtet , die Umprogrammierung von Melanomen TIL, die hohe Niveaus von PD-1 von Sendai - Virus (SeV) vermittelter Transduktion der vier Transkriptionsfaktoren, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC 16. Während Retrovirusvektoren Integration in Wirtschromosomen erfordern Umprogrammierung Gene, SeV Vektoren sind zum Ausdruck bringen nicht-integrierenden und werden schließlich aus dem Zytoplasma eliminiert. Umprogrammieren Effizienz ist viel höher mit einem SeV - System im Vergleich mit Lentiviren oder Retrovirusvektoren 6-8. Weiterhin kann SeV spezifisch T - Zellen in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) umprogrammieren, während einige iPSC Klone durch Lentivirus oder Retrovirus - Vektoren erzeugt aus nichtlymphoiden Linien 6-8 sein kann. Hier stellen wir Detaildie Verfahren zur Isolierung und Aktivierung von menschlichen Melanom TILs und zur Erzeugung von TIL stamm iPSCs unter Verwendung eines SeV Umprogrammierung System implementiert.

<table><tbody><tr><td>gentle MACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentle MACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Tumor Dissociation Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 um Cell Strainer</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>human AB serum</td><td>Life technologies</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200mM)</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Life technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human (rh) IL-2</td><td>Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Cumberland Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 66220-207-30</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates (6-well)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates (24-well)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Sendai virus vector</td><td>DNAVEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SNL feeder cells</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>CBA-316</td><td></td></tr><tr><td>mitomycin C</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>soluble in water (0.5 mg/ml)</td></tr><tr><td>gelatin</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>basic fibroblast growth factor (bFGF)</td><td>Life technologies</td><td>PHG0264</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of induced pluripotent stem cells from human melanoma tumor-infiltrating lymphocytes

Der adoptive Transfer von ex vivo expandierte autologe Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) können dauerhafte und vollständige Antworten in signifikanten Untergruppen von Patienten mit metastasierendem Melanom vermitteln. Haupthindernisse dieses Ansatzes sind die reduzierte Lebensfähigkeit der übertragenen T-Zellen, durch Verkürzung der Telomere verursacht wird, und die begrenzte Anzahl von TILs von Patienten erhalten. Weniger differenzierte T-Zellen mit langen Telomeren wäre eine ideale T-Zell-Untergruppe für Adoptiv T-Zell-Therapie sein, aber die Erzeugung einer großen Anzahl von diesen weniger differenzierten T-Zellen problematisch ist. Diese Beschränkung der adoptiven T-Zelltherapie kann theoretisch durch Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), die selbst zu erneuern, halten Pluripotenz, haben verlängert die Telomere, und bieten eine unbegrenzte Quelle autologer T-Zellen für die Immuntherapie überwunden werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll iPSCs zu erzeugen unter Verwendung von Sendai-Virus-Vektoren für die Transduktion von Reprogrammierungsfaktoren in TIL. Dieses Protokoll generierens vollständig neu programmiert, vektorfreie Klone. Diese TIL stamm iPSCs könnte in der Lage sein, zu erzeugen weniger differenzierten Patienten- und tumorspezifische T-Zellen für die adoptive T-Zell-Therapie.

Abbildung 1 zeigt die Übersicht über das Verfahren , das die anfängliche Expansion des Melanoms TILs mit rhIL-2, die durch Aktivierung mit anti-CD3 / CD28 und Gentransfer OCT3 / 4, KLF4, SOX2, und c-MYC zu TILs folgt beinhaltet zur Erzeugung von iPSCs. Normalerweise TIL auf Kultur mit rhIL-2 Start zu bilden Kugeln 21-28 Tage nach Beginn der Kultur. An diesem Punkt TIL bereit sind , mit anti-CD3 aktiviert werden / CD28. 2A zeigt TIL, auf Kultur mit rhIL-2 am Tag 21, die bereit sind , mit zu aktivierenden anti-CD3 / CD28. 2B zeigt GFP Einführung von Sendai - Virus (SeV) bei 20 transfiziert MOI. 2C zeigt einen typischen pluripotenten Klon auf Nährzellen SNL , die 18 bis 21 Tage nach der Infektion SeV erscheint. 2D zeigt , dass die erzeugten TIL-derived iPSCs haben einen normalen Karyotyp. Abbildung 3 zeigt Immunfluoreszenzanfärbung bestätigen pluripotency Marker - Expression auf iPSCs (SSEA3, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60 und OCT3 / 4). Abbildung 4 zeigt , dass iPS - Zellen abgeleitet von Melanomen TIL können teratoma zu bilden , die eine Vielzahl von Zellen , die aus drei Keimblätter enthalten (neuronale Gewebe, respiratorischen Epithel und Knorpel). 5 zeigt Abbildung , die erzeugt TIL-derived iPSCs TCR Umlagerungen behalten. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54375/54375fig1.jpg" /> Abb . 1: Schematische Darstellung der Erzeugung von iPS - Zellen von Melanomen TIL Das Protokoll umfasst drei Stufen: Isolierung und Kultivierung von TIL mit IL-2, T - Zell - Aktivierung mit anti-CD3 / CD28 und Reprogrammierung mit dem Sendai - Virus (SeV) Vektor - Codierung OCT3 / 4, SOX2, KLF4 und c-MYC. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <p<html> class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54375/54375fig2.jpg" /> Fig . 2: Erzeugung von iPSCs von Melanomen TILs (A) Ein Bild , die die Morphologie der TILs in rhIL-2 , wenn sie gestartet 2-3 Wochen nach Beginn der Kultur zu erweitern. (B) Bilder , die Morphologie und die GFP - Expression von TIL einen Tag nach der SeV - Infektion. (C) Ein typischer ESC-like iPSC Kolonie am Tag 21 nach der SeV - Infektion. Die Maßstabsbalken = 200 &amp; mgr; m. (D) zytogenetische Analyse auf zwanzig G-gebändert Metaphase - Zellen aus einer der von Melanomen TIL abgeleitet iPSCs. Abbildung (D) von Saito et al angepasst ist 16. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html> ftp_upload / 54375 / 54375fig3.jpg &quot;/&gt; Abb . 3: Immunfluoreszenzfärbung mit Stammzellen pluripotent Marker Der Immunfluoreszenztest zeigt , dass die TIL-derived iPSCs von zwei Patienten positiv sind für SSEA3, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60 und OCT3 / 4. Die Maßstabsbalken = 100 μm.The Figur wird von Saito et al 16 angepasst. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54375/54375fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Die Bestätigung der Pluripotenz für iPS - Zellen mit Teratom Bildung Hematoxylin- und Eosin-gefärbte Vertreter teratoma Abschnitte abgeleitet von der TIL-derived iPSCs Klon (6 Wochen nach der Injektion in NOD / SCID - Mäuse) gezeigt. Abbildung von Saito et al angepasst 16..com / files / ftp_upload / 54375 / 54375fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54375/54375fig5.jpg" /> Fig . 5: Eine Vielzahl von TCR-β - Gen Anordnungsmuster in TIL-iPSCs TCR-β - Gen - Umlagerungen in TIL-iPSCs werden durch Kapillarelektrophorese identifiziert. Die grüne Linie wird von der Band für das Gen Jβ1 abgeleitet, und die blaue Linie wird von der Band für das Jβ2 Gen abgeleitet. Die Abbildung von Saito et al angepasst ist 16. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54375/54375tbl1.jpg" /> Tabelle 1: Zusammensetzung für die T - Zell - Reprogrammierung, tumor Sammeln, SNL feeder - Zelle, und iPSC Medien und die Permeabilisierung und Blockierungspuffer. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375tbl1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375tbl1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a>

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-human-melanoma-tumor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K Aufrufe.  University of Michigan. The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Serie: Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Krebsforschung

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Immunologie und Infektion

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Medizin

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, there is no effective long-term treatment for vitiligo. Therefore, it is imperative to develop a convenient and effective treatment for vitiligo. Regenerative medicine technology for direct reprogramming of skin cells into melanocytes seems to be a promising novel treatment of vitiligo. This involves the direct reprogramming of the patient's skin cells into functional melanocytes to help ameliorate the loss of melanocytes in patients with vitiligo. However, this method needs to be first tested on mice. Although direct reprogramming is widely used, there is no clear protocol for direct reprogramming into melanocytes. Moreover, the number of available transcription factors is overwhelming. 
Here, a concentrated lentivirus packaging system protocol is presented to produce transcription factors selected for reprogramming skin cells to melanocytes, including Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9, and Snai2. Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were infected with the concentrated lentivirus for all these transcription factors for the direct reprogramming of the MEFs into induced melanocytes (iMels) in vitro. Furthermore, these transcription factors were screened, and the system was optimized for direct reprogramming to melanocytes. The expression of the characteristic markers of melanin in iMels at the gene or protein level was significantly increased. These results suggest that direct reprogramming of fibroblasts to melanocytes could be a successful new therapeutic strategy for vitiligo and confirm the mechanism of melanocyte development, which will provide the basis for further direct reprogramming of fibroblasts into melanocytes in vivo.

Here, we describe an optimized direct reprogramming system for melanocytes and a high-efficiency, concentrated virus packaging system that ensures smooth direct reprogramming.

Direkte Reprogrammierung von Mausfibroblasten in Melanozyten

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Vom Patienten stammende Melanom-Organoide: Eine Grenze in der Krebsimmuntherapie

Unveiling Therapeutic Opportunities with Melanoma Patient-derived Organoid Models

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While traditional two- and three-dimensional models can offer insights into cancer development and progression, these lack crucial aspects that hinder a faithful mimic of native tumors. An alternative model that has gained a lot of attention is the patient-derived organoid. The development of these organoids recapitulates the complex intercellular communication, tumor microenvironment, and histoarchitecture of tumors. This paper describes the protocol for establishing melanoma patient-derived organoid (MPDO) models. To validate these models, we assessed the immune cell composition, including the expression levels of T-cell activation markers, to confirm the cellular heterogeneity of the organoids. Additionally, to describe the potential utility of MPDOs in cellular therapies, we evaluated the cytotoxic capabilities of treating the organoids with &#947;&#948; T-cells. In conclusion, the MPDO models offer promising avenues for understanding tumor complexity, validating therapeutic strategies, and potentially advancing personalized treatment.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Nachbildung der Melanomkomplexität mit patienteneigenen Organoiden für die Bewertung von Immuntherapien

Here, we present a protocol to generate melanoma patient-derived organoids by culturing disassociated cell suspensions from fresh melanoma tissues. These organoids faithfully recapitulate patient-specific tumors in vitro, offering an innovative approach to exploring tumor immunosuppressive mechanisms, drug screening, drug resistance mechanisms, and cancer surveillance approaches.

Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While ...

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

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Generation der Integration freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen Mit Haarstamm Keratinozyten

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133

Direkte Reprogrammierung von Mausfibroblasten in Melanozyten

Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten

Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten

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