We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundstr&#246;m at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).

1. Setup-Assembly <ol><li> Herstellung der sternförmigen Arena (19,5 cm 19,5 cm 0,7 cm) aus Polytetrafluorethylen (PTFE) gemäß der bereitgestellten Zeichnung (Ergänzende Materialien, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). Die Arena kann durch Ausübung einer gewerblichen oder einer benutzerdefinierten Einrichtung hergestellt werden. </li><li> Erwerben zwei Glasplatten (20,25 cm mal 20,25 cm mit einer Dicke von 2 mm), und ein Loch bohren (~ 0,7 cm im Durchmesser) genau in der Mitte von einer der Glasplatten ein diamantbeschichteten Bohrer. </li><li> Herstellung eines lichtdichten Verhalten Feld für die Verhaltens Arena. Auch die Herstellung einer lichtdichten Kameragehäuse für die Infrarot-CCD-Videokamera nach den zur Verfügung gestellten Zeichnungen (Supplementary Materials, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). Die Boxen können durch eine kommerzielle oder eine benutzerdefinierte Einrichtung hergestellt werden. </li><li> Montieren Sie das Klimagerät an der hinteren Wand und den LED-Arrays an den Seitenwänden des Verhaltens Box. Legen Sie die Temperaturfühlerim Verhalten Feld durch ein Seitenloch für Echtzeit - Temperatur - Feedback und Anpassung (siehe Abbildungen 1 und 2 für Details). </li><li> Befestigen Sie den IR-Filter und Zirkularpolarisator auf die Kamera, und montieren Sie die Baugruppe in das Kameragehäuse. Das Verhalten Feld und Kamerafeld werden durch ein Glasfenster für eine bessere Temperatursteuerung des Verhaltens Kasten (siehe 1 und 2 für Details) getrennt. </li><li> Schließen Sie den Infrarot-CCD-Kamera mit einem Kameraadapter. Schließen Sie die Kamera-Adapter an einen USB-Konverter. Schließen Sie den USB-Konverter an einen USB-Anschluss am Computer für die Datenerfassung. </li><li> Installieren Sie den Treiber für den Video-Konverter auf dem Computer nach den Anweisungen des Herstellers. Optional installieren Sie eine breitere Palette von Kameraeinstellungen und Aufnahmeparameter Bildverarbeitungssoftware vom Hersteller des USB-Videowandler zur Verfügung gestellt zuzugreifen. </li><li> Schließen Sie das Klimagerät (durch &quot;-Ausgabe&quot;Auf der Rückseite der Temperatursteuerung) und der Temperatursonde (durch&quot; Thermoelement &quot;auf der Rückseite der Temperaturregler) auf die Temperatur-Controller. Die Sonde in das Verhalten Feld. Hinweis: Das Temperatursteuersystem in unserem Layout Aufrechterhaltung der Box Temperatur zwischen 18 ° C und 30 ° C fähig ist. Höhere oder niedrigere Umgebungstemperaturen für thermogene (dTrpA1, TRPM8 oder shibire ts) Experimente nützlich sein könnten neuronale Aktivität oder hemmen die synaptische Übertragung zu manipulieren. Bei den meisten Experimenten wird die Temperatur bei 25 ° C gehalten. </li><li> Montieren Sie den Geruch Abgabesystem in den folgenden Schritten (siehe Abbildung 1B für detaillierte Schaltpläne und Anschlussarmaturen): <ol><li> Verwenden, um die Luftdruckregler des Lufteingang von dem zentralen Luftsystem zu steuern. Schließen Sie einen Kohlenstoff Luftfilter (gefüllt mit Holzkohle) mit dem Druckregler, um die Luft aus dem zentralen ein reinigenir-System. </li><li> Montieren Sie den Stromregelsystem, das aus mehreren Kanälen geregelt durch hochauflösende Messröhren. </li><li> Verbinden Sie den Ausgang aus dem Kohlenstoff - Luftfilter des Durchfluss - Messrohre über einen Verteiler , wie in 1B und 2F gezeigt. Richten Sie die Ausgabe der Messröhren durch elektronisch gesteuerte 3-Wege - Magnetventile zu regulieren , wenn saubere Luft , um die Durchflussmessgeräte verlassen in den Raum ausgestoßen wird oder in diese eingegeben maßgeschneiderte Geruch Kammern 24. </li><li> Installieren Sie das Magnetventilsteuerung entsprechend der Anleitung des Herstellers. </li></ol></li><li> Installieren Sie die elektronische Luftmengenmesser, indem sie es mit einem Datenerfassungsgerät (DAQ) und eine Stromversorgung anschließen gemäß der Anleitung des Herstellers. Installieren Sie die DAQ-Interface-Software zu gleichen Flussraten in jedem Quadranten der Arena überprüfen Sie vor jedem Experiment. </li></ol> 2. olfaktorischer Stimuli Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie 5 Geruchant Kammern 24 , die aus einem Kunststoffaußenbehälter bestehen, Glasinnenbehälter, eine maßgeschneiderte PTFE Deckeleinsatz, original Behälterdeckel mit Mittelteil entfernt und zwei Einwegventile. Hinweis: Ein O-Ring um den Deckel aus PTFE verwendet werden könnten Luftleck aus dem Geruchskammer während Geruchs Perfusion zu verhindern. Siehe Abbildung 1 für schematische und 2 für Fotos der Kammern. </li><li> Verwenden Sie vier Riechstoff Kammern für Lösungsmittelkontrollen und eine Kammer für einen Test Riechstoff. Füllen Sie die Glasbehälter mit 1000 ul Lösungsmittel bzw. Riechstoff Verdünnung (Test Riechstoffe + geeigneten Lösungsmitteln, gründlich mischen, bevor Experimente), legen Sie den Glasbehälter im Inneren der entsprechenden Kunststoffkammer (verschütten Sie nicht die Flüssigkeit in die Kunststoffkammer) und ziehen Sie den Deckel . Achten Sie darauf, immer eine saubere Kammer für den Test Riech- und Lösungsmittelkontrollen verwenden. Hinweis: olfaktorischen Reiz kann durch 1/16 Verdünnung von Apfelessig (5% Säure) in w ausgelöst werdenater. Im Gegensatz dazu kann olfaktorischen Abstoßungsverhalten unter Verwendung einer 10% igen Verdünnung von Ethylpropionat in Mineralöl sucht werden. Steuer Stimuli in diesen Fällen sind geruchsKammern mit reinem Mineralöl. </li></ol> 3. Fly Vorbereitung <ol><li> Hinten fliegt auf Standard cornmeal Medium. Legen Sie 30 männliche und 30 weibliche Eltern Fliegen in einer Standardflasche, und lassen Sie sie legen Eier für 5 Tage bei 25 ° C oder Raumtemperatur. </li><li> Für jedes Experiment collect neu geschlüpften (&lt;1 Tag alt) 25 männlich und 25 weiblich fliegt unter kurzen CO 2 Narkose. </li><li> Halten Sie fliegt in einem Fläschchen mit Standard-fly Medium für 2-4 Tage. </li><li> 40-42 Stunden vor dem Experiment, übertragen die Fliegen ohne CO 2 Narkose &#160; in ein Fläschchen mit ~ 10 ml 1% iges Agarosegel. Dies wird die Fliegen halten, ohne Nahrung angefeuchtet, die ihre Bewegungsaktivität zu erhöhen hilft. Hinweis: Mehr als 90% der Fliegen den Hunger überleben sollte. Einige Genotypen sind weniger heilendein und kann nicht durch eine 40 Stunden Hunger machen. In diesen Fällen kürzere Zeiträume, wie beispielsweise 24-28 h sind akzeptabel, aber sollten die gleiche für alle Versuchsbedingungen und repeats gehalten werden. </li></ol> 4. Verhaltensreaktionen auf Attraktive und Repellent Riechstoffe <ol><li> Schalten Sie den Temperaturregler und stellen Sie es auf 25 ° C. </li><li> Verbinden Sie die Riechstoffkammern (Kontroll- und Test Riechstoffe) durch den Schlauch mit dem Auslass des Riechstoffkammer einlegen und auf die Push-to-Connect-Fitting auf das Verhalten Feld. </li><li> Überprüfen Sie die Strömungsgeschwindigkeit in jedem Quadranten durch den Luftmengenmesser verwendet, um sicherzustellen, dass die Steuer- und Riechstoffluftströme auf 100 ml / min gleich sind. </li><li> Reinigen Sie die PTFE-fly-Arena und die Glasplatten mit 70% Ethanol 2-3 mal und lassen Sie sie vollständig trocknen (~ 3-4 min). </li><li> Befestigen Sie die Glasplatten in die Arena mit Klammern. </li><li> Transfer fliegt ohne CO 2 Narkose in die Arena durch das Loch in einer der Glasplatten. Achterner kann die Übertragung, legen Sie eine kreisförmige Gitter auf dem Loch entfernt entweichen zu verhindern. Hinweis: CO 2 Anästhesie gezeigt wurde 25 Drosophila Verhalten zu beeinflussen , und nicht innerhalb von 24 h einer Verhaltensexperiment verwendet werden soll. </li><li> Legen Sie die Arena mit Fliegen in die lichtdichte Kammer, schließen Sie die vier Steuerluftströme durch den Schlauch an den Push-to-Connect-Fitting auf das Verhalten Feld der Arena Ecken angebracht verbinden, schließen Sie die Tür der Kammer und warten 10- 15 Minuten, damit sich die Fliegen an die neue Umgebung gewöhnen. Wenn möglich, schalten Sie das Licht in den Raum ab, wo die Experimente durchgeführt werden, möglichst wenig Licht Leck zu vermeiden, die Vorspannung der experimentellen Ergebnis kann. </li><li> Führen Sie einen 5-10 min Kontrollexperiment, bei dem Fliegen zu 4 Steuerluftströmen ausgesetzt sind. </li><li> Analysieren Sie die Daten sofort (siehe Datenanalyse Abschnitt weiter unten), um sicherzustellen, dass die Fliegen gleichmäßig in der Arena verteilt sind, und die Art der Index in der Nähe0. Dieser Schritt ist wichtig, da es , dass es in der Arena sind keine unkontrollierten Quellen der Präferenz oder Vermeidung überprüft (zB Licht von außen, ungleichmäßige Temperaturverteilung, unebene Arena, Geruchsbelästigungen undicht, etc.). Wenn die Fliegen ungleicher verteilt sind oder ihre Bewegungsaktivität niedrig ist, verwerfen die Fliegen, reinigen Sie die Arena wieder (Schritt 4.4) und eine neue Charge von Fliegen verwenden, um das Experiment zu wiederholen. </li><li> Schließen Sie den Test Riechstoff Kammer mit dem Setup durch Einschalten der 3-Wege-Ventile oder Umstecken der Verbinderrohre. </li><li> Führen Sie Testversuch für 5-10 Minuten und die Daten analysieren , wie in Abschnitt 5 weiter unten (siehe auch Referenz 14 und Abbildung 3). Aufnahmen länger als 20 Minuten können in Dateien kommen, die rechnerisch Prozess schwierig sein kann. Wenn mehr experimentelle Aufnahmen gewünscht werden, schnell zu stoppen und das Tracking-Programm neu starten. Dies führt zu einer ~ 10 sec Lücke zwischen experimentellen Aufnahmen. </li><li> discard Fliegen. </li><li> Saubere Arena und Glasplatten mit 70% Ethanol (Schritt 4.4) und Anschlussrohre innerhalb der lichtdichten Gehäuse ersetzen. Zur Beschleunigung der Experimente kann eine neue, saubere Arena verwendet werden, und die schmutzige Arena gereinigt, während Versuchsdurchläufe durchführen. </li><li> Führen Sie ein anderes Experiment mit einer neuen Charge von Fliegen, falls erforderlich. Wenn mehrere Experimente am selben Tag ausgeführt werden, extreme Vorsicht walten, um sicherzustellen, dass keine Geruchsstoff in dem System von einer vorherigen Testlauf gelassen wird. Dies ist normalerweise kein Problem mit geringen Konzentrationen von Geruchsstoffen oder mit CO 2, aber zur Herstellung hochkonzentrierter Stimuli bis zu einem 24 - Stunden - Abstand zwischen Versuchsdurchläufe erforderlich sein. Darüber hinaus können alle Rohre, nachdem die Strömungsrohre ersetzt werden, wenn Riechstoff Kontamination während Kontrollversuchen vermutet wird. Lassen Sie immer die trockene Luft auf zwischen den Versuchen, um kontinuierlich das System spülen </li></ol> 5. Datenanalyse Hinweis: Die vorgeschlagene fly-Tracking-Akquisition software (die in Materialien), verfolgt Fliegen in Echtzeit während der Erfassung und speichert den Zeitstempel und Koordinaten aller erkannten Fliegen im Format * .dat. Wir haben eine maßgeschneiderte Matlab Routine entwickelt, um die Daten in ein Matlab-Format zu konvertieren, und die Daten zu analysieren. Code-Beispiele sind in ergänzenden Materialien zur Verfügung gestellt, aber Einzelheiten der Umsetzung werden auf der Software zur Datenerfassung ab. <ol><li> Legen Sie die Rohdaten. Erstellen Sie eine räumliche Maske , die die Konturen der Arena und die Maske auf die Rohdaten folgt alle Datenpunkte zu entfernen , die außerhalb der Arena fallen , wie sie repräsentieren Lärm (4A, Ergänzender - Code MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. m). </li><li> Entferne alle Datenpunkte , die mit einer Geschwindigkeit unter 0,163 cm / s für mehr bewegen als 3s, da diese Daten wahrscheinlich Rauschen sein oder erzeugt durch unbewegte Fliegen (4B, Ergänzender - Code TemporalFiltering.m). </li><li> Visualisieren verbleibenden DatenPunkte , indem sie aus auf einmal oder als einzelne Trajektorien (Abbildung 3, Ergänzender Kodex SingleTrajectoryViewer.m) aufgetragen ist . Hinweis: Die Lage der Geruchsgrenzen in der Vier-Felder von einer Reihe von Faktoren, die abhängig ist, wie die Eigenschaften jeder Geruchsstoff und die Luftströmungsraten verwendet werden. Zum Beispiel wird sehr flüchtige Riechstoffe wahrscheinlich den Geruch Quadrant vollständiger als weniger flüchtige Riechstoffe füllen. So ist es wahrscheinlich, dass jeder Geruchsstoff leicht Grenzen unterschiedlicher Geruch aufweisen kann. Die Verwendung eines Photoionisationsdetektor Geruchsgrenzen zu messen, kann problematisch sein, da es ein Vakuum verwendet Luft von einer bestimmten Stelle zu probieren, und stört so die Odormittelkonzentration an dieser Stelle. Dennoch können schnell geschätzten Grenzen Geruch auf Basis von Verhaltensdaten fliegen. So kann beispielsweise eine Geruchsgrenze basierend auf kumulierten fly Tracks in Reaktion auf verschiedene Gerüche deutlich in den Figuren 3C und 3D zu beobachten. </li><li> Calculate eine Attraktion Index zu bestimmen , ob Kontrollexperimenten keine Präferenz Reaktion erzeugen, und auch die Antwort auf Riechstoff zuzugreifen (oder optogenetische 9) Reiz. Um eine Art Index (AI) zu berechnen, verwenden Sie die letzten 5 min von einer Steuer- oder Testaufzeichnung. Um ein Maß der Anziehung zu erhalten, die zwischen +1 (absolute Attraktion) und -1 (absolute Abstoßung) fällt, wird die folgende Formel verwendet, um die AI zu berechnen: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54346/54346eq1.jpg" /> wobei N Test die Anzahl von Datenpunkten in dem Test Quadranten ist, N Steuer die durchschnittliche Anzahl der Datenpunkte in den drei Steuer Quadranten. Diese Maßnahme ist intuitiv wie egal wäre von nahezu Null-Werte angegeben werden. Allerdings ist es nicht richtig, den Anteil der Gesamtzahl von Fliegen zeigen, die in der Riechstoff Quadranten befinden. Um diese Maßnahme zu erhalten, ein Anteil Index (PI) verwendet werden: <img alt="Gleichung 2" src=&quot;/files/ftp_upload/54346/54346eq2.jpg&quot; /&gt; wobei N - Test ist die Zahl der Datenpunkte in dem Test Quadranten und N total die Gesamtzahl der Datenpunkte in allen vier Quadranten. Diese Formel stellt eine Maßnahme , die zwischen 0 und 1, mit 0,25 entspricht , ohne Verhaltenspräferenz (3E und 4C Ergänzungs - Code AttractionIndex.m) fällt. </li><li> Führen Sie 5-10 Wiederholungen jeder Versuchsbedingung, eine neue Gruppe von Fliegen für jede Wiederholung verwenden. Vergleichen Sie die Attraktion Indizes zwischen den Bedingungen oder gegen Kontrollen durch den Kolmogorov-Smirnov nicht-parametrischer Test (Abbildung 3F, kstest2 Funktion in Matlab). </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Das Vier-Feld Olfaktometer beschrieben hier ist ein vielseitiges Verhaltenssystem zur Untersuchung der olfaktorischen Reaktionen von großen Populationen von Wildtyp und Mutante Drosophila - Fliegen. Jeder Versuch dauert ca. 1 Stunde (einschließlich Setup, Versuchsdurchläufe und Reinigung), und 4-6 Experimente können routinemäßig jeden Tag durchgeführt werden. Ein typischer Test 40-50 Fliegen für 5 Minuten unter Verwendung erzeugt etwa 450.000 Datenpunkte für die Analyse verfolgt. Die beschriebene Anordnung kann auch verwendet werden, mit geringen Modifikationen in Reaktion Bewegungen anderer Insekten oder Insektenlarven zu überwachen, um eine Zeitdauer olfaktorischen oder andere Sinnesreize über, im Bereich von Minuten bis Tagen. Der Vier-Quadranten-Assay ist empfindlich gegenüber den Auswirkungen von sowohl anziehenden und abstoßenden Reize. Die meisten Riechstoffe erzeugen Attraktion Indizes (AI) zwischen -0,9 und +0,9 (Gleichung 1). Ein AI im Bereich von 0,5 bis 1 bedeutet starke Anziehungsverhalten der Fliegen auf die Reize, während AI im Bereich von -0,5 bis -1ausgelöst durch starke Abschreckungsmittel. Im Allgemeinen eine neutrale Reaktion durch Kontrolle Gerüche (trockene Luft, befeuchtete Luft, Mineralöl) zwischen +0,1 und -0,1 fallen. Die KI ändert sich häufig im Verlauf des Tests Experiment, was die Zeit vergeht in die Riechstoff Federn laufen erfordern, initial Anziehung und Erhöhung der lokomotorischen Aktivität gegenüber einem neuen Stimulus und die schließliche Desensibilisierung in Antwort auf den Reiz. Pre-Test Kontrollläufe sind wichtig und müssen sorgfältig durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass Fliegen wurden gleichmäßig in der Arena in Abwesenheit des gewünschten Stimulus verteilt. Häufigste Ursachen der räumlichen Vorspannung von Fliegen in der Arena sind: ungleiche Luftströme, möglicherweise aufgrund einer getrennten Schläuchen oder unzureichend geklemmt Glasplatten des sternförmigen Arena (in unserer Erfahrung, Fliegen können Unterschiede von Luftstrom zu erfassen, der so wenig wie 15 ml / min); ungleichmäßige Temperaturverteilung über die Arena, die durch das Festlegen der verbessert werden kann,Klimagerät zu erzeugen schwächer und diffuse Luftströmung und / oder längere Zeit vor Erwerb Periode (~ 20 min) Temperatur der Arena, um sicherzustellen, selbst; minimale Lichtverlust durch die Temperaturfühler Öffnung, die durch Abdichten der Öffnung mit schwarzem Klebeband reduziert werden kann; Restgeruch in der Arena oder in der Luftzufuhrsystem, in welchem ​​Fall die Einrichtung (Arena, Durchflußrohre, Armaturen des lichtdichten Gehäuse, etc.) müssen gründlich gereinigt werden und für mehrere Tage trocknen gelassen oder , falls möglich ersetzt. Die Wartung der olfaktorischen Ausrüstung ist wichtig für eine zuverlässige und konsistente Ergebnisse. Push-to-Connect-Armaturen auf das Verhalten Kasten und Lufteinlässe und Innenwänden der Arena sollte mit Ethanol nach jedem Experiment gereinigt werden, wenn starke Gerüche verwendet werden und erlaubt vollständig zu trocknen. Die Glasplatten sollten dreimal mit einer 70% Ethanol gewaschen werden, die in der Regel ausreichend ist, Restgeruch und Schmutz von den Platten zu entfernen, aber ist nützlich Hexanbei der Entfernung von Fliegen abgelagerte organische Verbindung (beispielsweise bestehend aus Pheromonen langen Kohlenwasserstoffketten). Seife ist in der Regel nicht empfohlen, da es in der Regel aromatische Bestandteile enthält, die olfaktorische Verhalten beeinflussen würden. Das Verhalten Feld sollte auf die trockenen Lufteinlässe zwischen den Experimenten verbunden bleiben (zB über Nacht) Entfernung der Restgerüche aus dem System zu erleichtern. Wenn der Bewegungsaktivität der Fliegen niedrig ist, kann sie zu wenige Datenpunkte zu erzeugen, die häufig zu einer verrauschten und variable Art Index. Längere Hunger und Aufnahmezeiten helfen kann, dieses Problem zu lösen. Im Gegensatz dazu, wenn die Fliegen krank sind, 24-28 h Hunger im allgemeinen ausreichend, so lange Lokomotion Aktivität wäre für die Verbesserung, wie sie überall in Experimenten konsistent ist. Es gibt eine feine Balance einen gesunden Zustand der Fliegen zwischen Erhaltung und Steigerung der Fortbewegung. 40 Stunden Hungern kann als Ausgangspunkt verwendet werden und später modifiziertbasierend auf den experimentellen Ergebnissen benötigt. Art der Indizes wird etwas von der Dauer des Hungers betroffen sein, so ist es wichtig, alle Versuchstiere für den gleichen Zeitraum, um zu verhungern verwirrende Wirkung von Hunger Zeit zu vermeiden. Längere Hungerzeiten in der Regel Abstoßungsreaktionen schwächer (näher an 0) zu machen, und attraktive Antworten stärker. Trockene Luft Steuerluftströme dazu neigen, um die Fliegen zu vertrocknen, und sollte nicht länger als 40 min verwendet werden. Der Vier-Quadranten - Olfaktometer kann verwendet werden , um Antworten einzelner 16,18 oder mehrere Fliegen auf einen einzelnen Reiz zu studieren oder die Wahl bevorzugt zwischen Stimuli zu studieren. Zum Beispiel könnten verschiedene Gerüche in jedem der vier Quadranten verwendet werden. Dies könnte auch die Antworten auf geruchs Mischungen verwendet werden, um zu bestimmen, indem sie die Grenzen der geruchs Quadranten untersuchen. Es sollte auch beachtet werden, dass obwohl das Tracking-System einzelne Tracks ermöglicht aus den gesammelten Daten isoliert werden, ist esmöglich, dass einzelne Fliegen können anders verhalten, wenn sie als Teil einer Gruppe getestet, als wenn sie alleine getestet werden. Beispielsweise Gruppen von Fliegen aufweisen geruchs geführt Abstoßung aufgrund physikalischer Wechselwirkungen zwischen Linie 26 erhöht. Das Tracking-System und das Layout kann auch für die Verwendung in nicht-olfaktorischen Assays angepasst werden. Der Test Rahmen kann leicht ein LED - Array 9 für optogenetische Stimulation oder einer Wärmeplatte 27 für thermogenetics aufzunehmen. Das System kann auch Verhaltens Auswahl einer Zeitskala von vielen Stunden zu untersuchen angepasst, beispielsweise Eiablage Verhalten 14 zu studieren. In diesem Fall muss die Erfassungsbildrate angepasst werden, um die Erzeugung von großen Datendateien, und eine Feuchtigkeitsquelle und dem Substrat (1% Agarose-Gel) zu vermeiden, müssen als Eiablage Substrat vorgesehen werden. Eine Einschränkung dieser Einrichtung ist, dass die Fliegen nachgeführt werden als IR-reflektierende Gegenstände in und unterhalb der Arena- wenn irgendein Element eines optogenetische oderthermogene Experiment reflektiert IR, die irrelevanten Datenpunkte benötigt, während die Nachbearbeitung entfernt werden. Derzeit ist es auch nicht möglich, Fliegen mit einer räumlichen Auflösung zu filmen, die verschiedene Fliegen kontinuierlich unterscheidbar sein können, aber dies kann durch die Verwendung fortgeschrittener Videokameras in Zukunft verbessert werden. Eine weitere Einschränkung des gegenwärtigen Systems ist, dass die Bewegung von Fliegen auf zwei Dimensionen beschränkt ist, zu Fuß Verhaltensweisen zu fördern und die olfaktorischen induzierten Flug Reaktionen verhindern. Es sollte beachtet werden, dass zusätzliche automatisierte Assays wurden auch die Geruchsverhalten von einzelnen oder Gruppen von Fliegen zu untersuchen entwickelt. Das ähnlichste Design des Assays hier beschrieben ist ein Verfahren , entwickelt von Beshel und Zhong 28. In diesem Test werden die Antworten von ~ 30 Fliegen in einer kleinen kreisförmigen Arena (etwa ein Viertel der Fläche der Vier-Felder-Arena) überwacht, in denen Gerüche von 1 von 4 Geruch Häfen entlang der Arena wa geliefert werdenll, und in der Mitte der kreisförmigen Arena durch ein Loch entfernt. Neben einer kleineren Arena, umfassen andere Designunterschiede Verhaltensweisen unter Lichtbedingungen durchgeführt wird, und Riechstoffe hauptsächlich konzentriert nahe der Geruchs Ports (statt im gesamten Riechstoff Quadranten, wie durch die gewellten Wände des Vierfeld-Arena gerichtet). Nichtsdestoweniger ist die kreisförmige Bühne ein geeignetes Verfahren zum Screenen olfaktorischen Antworten von Fliegen und hier beschrieben zur Fliege Verfolgungs Design angepasst werden können. Ein alternativer Ansatz ist, um gleichzeitig die Aktivität vieler Einzellinie in Reaktion auf Gerüche überwachen. Im Flywalk Test werden einzelne Fliegen in kleinen Röhrchen gegeben, und ihre Antworten verfolgt , wenn Riechstoffe durch die Röhre 29,30 perfundiert werden. Änderungen in der Vorwärts- oder Rückwärtsrichtung oder Änderungen der Geschwindigkeiten kann zu messen verwendet werden, wenn ein Riechstoff allgemein anziehend oder abstoßend ist. Dieser Test, wie das Vier-Felder-Test, verfolgt automatisch fly movements und kann so verwendet werden, um schnell olfaktorischen Reaktionen auf eine breite Palette von Gerüchen zu messen. Doch im Gegensatz zu dem Vier-Feld, komplexe Motordynamik, wie Bahndrehwinkel und mögliche soziale Interaktionen, verpasste vielleicht im Flywalk Test-Aufnahme. Automatische Verfolgung einzelner Fuß Fliegen hat auch zu einem T-Labyrinth - Typ - Test 31,32 angepasst. In diesem Test werden die Fliegen in kleinen Kammern angeordnet, in denen Gerüche von beiden Enden der Kammer durchblutet werden und Ausgang über einen Port in der Mitte der Kammer. Die Positionen der Fliegen werden automatisch nachgeführt. Dies ahmt, eine Fliege Skala, einem T-Labyrinth Rahmen. In Kombination mit Optogenetik, dieser Test besonders gut wurde zur Untersuchung neuronaler Schaltkreise vermittelnde olfaktorischen Lernen und Gedächtnis geeignet, und kann auch verwendet werden, die geruchlichen Vorlieben der einzelnen Fliegen zu messen. Ähnlich wie Flywalk, ist es nicht komplexe Tätigkeit Dynamik überwachen können, die über größere räumliche Bereiche auftreten könnten, Wie jene , die bei der Lebensmittelsuch 14 oder Verhaltensweisen auftreten , die nur in fly Populationen vorkommen.

Die Fähigkeit zur äußeren Umgebung anzupassen und zu reagieren, ist von entscheidender Bedeutung für das Überleben aller Tiere. Ein Tier braucht, Gefahren zu vermeiden, Nahrung suchen und finden mates, und aus früheren Erfahrungen zu lernen. Sensorische Systeme funktionieren eine Vielzahl von Reizen, wie visuelle, chemische und mechanosensorischen, und senden diese Signale an das zentrale Nervensystem zu empfangen, zu interpretieren und decodiert. Das Gehirn leitet dann entsprechende motorische Verhaltensweisen auf der Grundlage der wahrgenommenen Umgebung, wie zum Beispiel Futter für Lebensmittel oder von einem Raubtier zu entkommen. Zu verstehen, wie sensorische Systeme, die die Außenwelt erkennen, und wie das Gehirn und Entscheidungen lenkt decodiert, ist eine große Herausforderung in der Neurobiologie. Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges Modellsystem für die, wie neuronale Schaltkreise Führungsverhalten zu untersuchen. Neben halten einfach und kostengünstig ist, zeigen Drosophila viele verschiedene und komplexe Verhaltensweisen schablonenhaft , und doch tun dies mit einem compact Nervensystem von etwa 100.000 Neuronen. Powerful genetische Techniken existieren , um die Drosophila - Genoms für die Manipulation und Tausende von transgenen Linien erzeugt wurden , die selektiv und reproduzierbar die gleichen Untergruppen von Neuronen 10-13 kennzeichnen. Diese transgenen Linien kann verwendet werden, um selektiv die Aktivität der markierten Neuronen manipulieren (aktivieren oder inhibieren), und diese Manipulationen können eingesetzt werden, wie neuronale Funktionen Führungsverhalten zu untersuchen. Mehrere Verhaltenstests wurden Verhaltensweisen für die Untersuchung verschiedener Drosophila entwickelt. Drosophila, wie viele Tiere, nutzen ihren Geruchssinn für viele Verhaltens Entscheidungen zu führen, wie Nahrung zu finden, finden Kollegen und Gefahren zu vermeiden. Der Geruchssinn ist daher eine gute sensorische System für die Untersuchung, wie äußere Reize werden erkannt und interpretiert von einem Tier das Nervensystem zu entsprechenden Entscheidungen führen. Als solches sind eine Anzahl von Assays für investiga entwickeltting Larven- und Erwachsenen olfaktorische Verhalten. Traditionell wurden durch eine zwei Wahl T-Labyrinth Paradigma getestet, olfaktorische Verhalten in Drosophila, die zur Bestimmung von angeborenen verwendet werden können und gelernt Geruchsverhalten 3. In diesem Test werden etwa 50 Fliegen eine Wahl zwischen zwei Rohren gegeben: ein Rohr enthält den fraglichen Geruch und die andere enthält eine Steuerriechstoff (in der Regel der Geruch Lösungsmittel). Die Fliegen sind eine bestimmte Zeit gegeben, um eine Wahl zu treffen, und dann die Anzahl der Fliegen, die in den verschiedenen Kammern sind gezählt. Obwohl die T-Labyrinth ein einfacher Test für viele Experimente ist, gibt es einige Einschränkungen. Beispielsweise werden olfaktorische Verhalten an nur einem Zeitpunkt gemessen wird, und verschiedene Möglichkeiten vor diesem Zeitpunkt gemacht werden verworfen. In ähnlicher Weise werden die einzelnen Verhalten der Fliegen in der Bevölkerung vernachlässigt. Darüber hinaus erfordert die T-maze manuelles Zählen von Fliegen, die zu Fehlern führen könnte. Schließlich, da es nur zwei gemessenen Auswahl dieserreduziert die statistische Aussagekraft oft zu erkennen subtile Verhaltensänderungen erforderlich. Eine Alternative zu einer Zwei-choice T-Labyrinth ist ein Vier-Quadranten (Vier-Felder) Olfaktometer 14-18. In diesem Test erforschen Tiere eine Arena, in der jeder der vier Ecken der Arena mit einer potentiellen Quelle von odorierten Luft gefüllt ist. Die Arena hat eine gespitzten Sternform, die Bildung von vier experimentell definierten Geruchs Quadranten zu maximieren. Wenn Geruch in einer der Ecken zugeführt wird, dann wird sie enthalten, nur in diesem einen Quadranten. Das Verhalten der Tiere können verfolgt werden, da sie den Geruch Quadranten betreten und verlassen, und leicht im Vergleich zu ihrem Verhalten in den drei Steuer Quadranten. Der Vier-Quadranten-Olfaktometer Assay somit Aufzeichnungen räumliche und zeitliche Verhaltensreaktion auf die Geruchsreize über einen großen experimentellen Arena. Der Vier-Quadranten - Olfaktometer wurde zuerst von Pettersson et al. 15 und Vet et al. 17 , um die ol zu untersuchenFabrik Verhaltensreaktionen einzelner parasitären Hautflügler. Faucher et al. 18 und Semmelhack und Wang 16 angepasst ist, die Einrichtung , die geruchlichen Reaktionen der einzelnen Drosophila zu überwachen. Der Vier-Quadranten-Olfaktometer ist ebenso empfindlich auf anziehende und abstoßende Reaktionen, so dass für eine breite Palette von Test Geruchs- und Bedingungen. Sonderanfertigungen geschrieben fly - Tracking - Software, entwickelt von Alex Katsov 19 und aktuell gehalten von Julian Brown (detailliert in Materialien), eingeführt zusätzliche Vorteile auf neuere Implementierungen des Vier-Quadranten - Olfaktometer 14,20-23. Es ist nun möglich, 100 fliegt mit hoher räumlicher (27,5 Pixel / cm) und zeitliche (30 Bilder pro Sekunde) Auflösung gleichzeitig zu testen, die unsere verschiedenen Parameter wie Position, Geschwindigkeit und Beschleunigung von Fliegen zu jedem Zeitpunkt erlaubt das Extrahieren. Dies ermöglicht Untersuchungen über die Dynamik der Verhaltensreaktionen auf Gerüche &quot;Fliegen 20 </sup&gt;. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass die Identität der einzelnen Fliegen in der Bevölkerung während der gesamten Verfolgungsperiode nicht aufrecht erhalten wird. Stattdessen wird jeder Flugbahn so lange wie zwei fly Spuren aufgezeichnet nicht schneiden. An welchem ​​Punkt werden neue Spuren zugewiesen, nachdem die Fliegen auseinander. Durch die Integration von anderen Video-Capturing - Software ( die in Werkstoff - Tabelle), kann die gleiche Konfiguration flexible Tracking - Perioden und könnte verwendet werden , Fliegen für bis zu 24 Stunden zu verfolgen , indem Sie Bilder mit einer niedrigeren Bildrate nehmen. Diese Option wurde verwendet , um Eiablageverhalten von Fliegen und vergleichen ihre Körperpositionen mit Eiablage Präferenzen 14 studieren. Das Vier-Feld Olfaktometer kann auch Antworten verwendet werden , um zu studieren , um zu multimodal (zB olfaktorischen und visuellen) Stimuli oder optogenetische 9 oder thermogene 21 Stimulation mit Präsentationen von Sinnesreizen zu kombinieren. Darüber hinaus ermöglicht die hohe zeitliche Auflösung der Extraktion von Trajektorien for jedes einzelne Haar in der Ensemble-Datensatz. Daher ermöglicht das Verfahren Untersuchung in olfaktorischen geführte Bevölkerung Verhaltensweisen und auch individuelle soziale Interaktionen. Die Daten, die durch diesen Test erzeugt sind robust und hoch reproduzierbar, was die Verwendung des Vierfeld-Olfaktometer für Verhaltens Bildschirmen. Wir beschreiben hier die Setup-Baugruppe für ein Vier-Quadranten-Olfaktometer. Wir zeigen weiterhin, seine Verwendung bei der Untersuchung von olfaktorischen Reiz in Reaktion auf Apfelessig und Abstoßung in Reaktion auf hochkonzentrierte Ethylpropionat. Schließlich beschreiben wir und Beispielcode für die Analyse der aufgezeichneten Flugverfolgungsdaten bereitzustellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1935">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Air delivery system&#160;</td>
			<td style="width:397px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:960px;">(Quantity needed)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Tubing and connectors</td>
			<td style="width:397px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermoplastic NPT(F) Manifolds</td>
			<td>Cole-Parmer, IL, USA</td>
			<td>R-31522-31</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hex reducing&#160; nipple (1/4MNPT-&#62;1/8MNPT)</td>
			<td>McMaster-Carr, IL, USA</td>
			<td>5232T314</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing (ID:1/8)</td>
			<td>McMaster-Carr, IL, USA</td>
			<td>5108K43</td>
			<td>50Ft</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing (ID:1/16)</td>
			<td>McMaster-Carr, IL, USA</td>
			<td>52355K41</td>
			<td>100Ft</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Barbed tube fittings</td>
			<td>McMaster-Carr, IL, USA</td>
			<td>5117K71</td>
			<td>1pack</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Push-to-connect tube fittings</td>
			<td>McMaster-Carr, IL, USA</td>
			<td>5779K102</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Barbed Tube Fittings (1/4MNPT-&#62;1/8BF)</td>
			<td>McMaster-Carr, IL, USA</td>
			<td>5463K439</td>
			<td>1 pack (10)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Barbed Tube Fittings (1/8MNPT-&#62;1/8BF)</td>
			<td>McMaster-Carr, IL, USA</td>
			<td>5463K438</td>
			<td>2 pack (10)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Barbed Tube Fittings (1/8MNPT-&#62;1/16BF)</td>
			<td>McMaster-Carr, IL, USA</td>
			<td>5463K4</td>
			<td>2 pack (10)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Barbed Tube Fittings (1/4MNPT-&#62;1/4BF)</td>
			<td>McMaster-Carr, IL, USA</td>
			<td>&#160; 5670K84</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hex head plug</td>
			<td>McMaster-Carr, IL, USA</td>
			<td>48335K152</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Air pressure regulator, air filter and flowmeters</td>
			<td style="width:397px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td>(Quantity needed)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Labatory gas drying unit</td>
			<td>W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA</td>
			<td>Model: L68-NP-303; stock #26840</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multitube frames for 150-mm flowtubes</td>
			<td>Cole-Parmer, IL, USA</td>
			<td>R03215-30</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multitube frames for 150-mm flowtubes</td>
			<td>Cole-Parmer, IL, USA</td>
			<td>R03215-76</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150-mm flowtubes</td>
			<td>Cole-Parmer, IL, USA</td>
			<td>R-03217-15</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Valve Cartridge</td>
			<td>Cole-Parmer, IL, USA</td>
			<td>R-03218-72</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Precision Air regulator</td>
			<td>McMaster-Carr, IL, USA</td>
			<td style="width:244px;">6162K13</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Soleniod valves</td>
			<td>Automate Scientific, Berkeley, CA</td>
			<td style="width:244px;">02-10i</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Solenoid valve controller</td>
			<td>ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA</td>
			<td style="width:244px;">01-18</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Electronic flow meter</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td style="width:244px;">AWM3100V</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a&#160;</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td style="width:244px;">NI USB-6009</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Power supply</td>
			<td>Extech Instruments</td>
			<td style="width:244px;">382200</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Odor chambers</td>
			<td style="width:397px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml</td>
			<td style="width:397px;">Nalgene</td>
			<td style="width:244px;">562118-0002</td>
			<td>At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass odor chamber, 0.25 oz</td>
			<td style="width:397px;">Sunburst Bottle</td>
			<td style="width:244px;">LB4B</td>
			<td>At least 5 are required per experiment&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">&#34;In&#34; valve for odor chamber</td>
			<td style="width:397px;">Smart Products, Inc., CA, USA</td>
			<td style="width:244px;">214224PB-0011S000-4074</td>
			<td>1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">&#34;Out&#34; valve for odor chamber</td>
			<td style="width:397px;">Smart Products, Inc., CA, USA</td>
			<td style="width:244px;">224214PB-0011S000-4074</td>
			<td>1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">O ring</td>
			<td style="width:397px;">RT Dygert International, MN, USA</td>
			<td style="width:244px;">AS568-029 Buna-N O-R</td>
			<td>1 pack (100)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Fly arena, camera and behavior boxes</td>
			<td style="width:397px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td>(Quantity needed)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:335px;">Behavior and camera box material</td>
			<td style="width:397px;">Interstate plastics, CA, USA</td>
			<td style="width:244px;">ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)</td>
			<td>1803 sq inch</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8&#34; thick, 12&#34;x12&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr, IL, USA</td>
			<td>8545K27&#160;</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Glass plates, 1/8&#34; Thick, 9&#34;x 9&#34;</td>
			<td>McMaster-Carr, IL, USA</td>
			<td>8476K191&#160;</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dual action thermoelectric controller</td>
			<td>WAtronix Inc, CA, USA</td>
			<td style="width:244px;">DA12V-K-0</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">IR LED array</td>
			<td>Advanced Illumination, Rochester, VT, USA</td>
			<td style="width:244px;">AL4554-88024, PS24-TL</td>
			<td>2 LED arrays and one power supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Air conditioner Unit</td>
			<td style="width:397px;">Melcor Store</td>
			<td style="width:244px;">&#160;MAA280T-12</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Imaging system</td>
			<td style="width:397px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td>(Quantity needed)</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens</td>
			<td style="width:397px;">B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td>
			<td style="width:244px;">PEC21211 KP</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CCXC-12P05N Interconnect Cable</td>
			<td style="width:397px;">B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td>
			<td style="width:244px;">SOCCXC12P05N</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">DC-700 Camera Adapter</td>
			<td style="width:397px;">B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td>
			<td style="width:244px;">SODC700</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">B+W 40,5 093 IR filter</td>
			<td style="width:397px;">B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA</td>
			<td>65-072442</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TiFFEN 40.5mm Circular polarizer</td>
			<td style="width:397px;">Amazon</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">IR Videocamera</td>
			<td style="width:397px;">Industrial Vision Source, FL, USA</td>
			<td>Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">USB video converter</td>
			<td>The Imagingsource, NC, USA</td>
			<td style="width:244px;">DFG/USB2-It</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">iFlySpy2 (fly tracking software)</td>
			<td style="width:397px;">Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com</td>
			<td style="width:244px;">iFlySpy2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">IC Capture 2.2 software</td>
			<td style="width:397px;">The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Miscellaneous</td>
			<td style="width:397px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td>(Quantity needed)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:335px;">Dremel rotary tool</td>
			<td style="width:397px;">Dremel, Racine, WI, USA</td>
			<td style="width:244px;">Dremel 8000-03&#160;</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:335px;">Diamond-coated drill bits for glass cutting</td>
			<td style="width:397px;">Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY</td>
			<td style="width:244px;">90606328</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

olfactory behaviors assayed by computer tracking of drosophila in a four-quadrant olfactometer

Eine zentrale Herausforderung in der Neurobiologie ist zu verstehen , wie neuronale Schaltkreise funktionieren Verhaltensweisen geeignetes Tier zu führen. Drosophila melanogaster ein ausgezeichnetes Modellsystem für solche Untersuchungen aufgrund seiner komplexen Verhaltensweisen, leistungsstarke genetische Techniken ist, und kompakt Nervensystem. Verhaltenstests Laboratory haben lange mit Drosophila verwendet Eigenschaften der natürlichen Umgebung zu simulieren und untersuchen die neuronalen Mechanismen , die entsprechenden Verhaltensweisen zugrunde liegen (zB Phototaxis, Chemotaxis, sensorische Lernen und Gedächtnis) 1-3. Mit der jüngsten Verfügbarkeit von großen Sammlungen von transgenen Drosophila Linien , die spezifische neuronale Untergruppen bezeichnen, haben Verhaltenstests auf eine herausragende Rolle genommen Neuronen mit Verhaltensweisen zu verknüpfen 11.04. Vielseitig und reproduzierbare Paradigmen zusammen mit den zugrunde liegenden Berechnungsroutinen für die Datenanalyse, sind unverzichtbar für schnelle Tests von Kandidaten Fliegenlinien mit verschiedenen genotypes. Besonders nützlich sind Konfigurationen, die getestet in der Anzahl der Tiere, flexibel sind, die Dauer der Experimente und der Art der dargebotenen Stimuli. Der Test der Wahl sollte auch reproduzierbare Daten generieren, die leicht zu erwerben und zu analysieren ist. Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung eines Systems und eines Protokolls zur Bestimmung von Verhaltensreaktionen von Drosophila - Fliegen in einem großen Vierfeld - Arena. Das Setup wird hier Antworten von Fliegen auf einen einzelnen Geruchsreizes zu untersuchen; jedoch kann die gleiche Einstellung mehrerer olfaktorischen, optischen oder optogenetische Stimuli oder eine Kombination von diesen zu testen, modifiziert werden. Die Olfaktometer Einrichtung zeichnet die Aktivität von Fliegenpopulationen auf Gerüche reagieren, und Rechen analytischen Methoden werden angewendet, um Fliegenverhalten zu quantifizieren. Die gesammelten Daten werden analysiert, um ein schnelles Auslesen eines experimentellen Lauf zu erhalten, die für eine effiziente Datenerfassung und die Optimierung der experimentellen Bedingungen wesentlich ist.

Die Vier-Quadranten-Olfaktometer-Assay erfasst und analysiert die Wanderaktivitäten von vielen Fliegen über einen großen Verhaltens Raum. Geruchsstoffe können in die Luftströme eingeführt werden, die man eingeben, zwei, drei oder alle vier Quadranten. In Abwesenheit von Gerüchen, werden die Fliegen frei zwischen allen vier Quadranten bewegen. Dieses Verhalten ist von entscheidender Bedeutung zu beobachten, denn sie zeigt, dass nicht-absichtlich Vorurteile wurden nicht in den Test eingeführt. Diese Verzerrungen können , umfassen Licht, Temperaturschwankungen, Unterschiede in der Luftströmung oder Geruchs Verunreinigungen. 3B zeigt die Verhaltensreaktionen in dem Vier-Quadranten - Olfaktometer von 25 männlichen und 25 weiblichen Fliegen Luft trocknen. Eine einzelne Fly-Spur aus den gesammelten Daten werden auch in 3B markiert ist , und zeigt , dass diese Fliege die gesamte Verhaltens Arena wurde zu erkunden. Die Attraktion Indexwert (AI) für alle analysierten Spuren über die 5-Minuten-Testperiode nahe 0, indicating einen Mangel an Anziehungskraft auf den Geruch Quadranten. In ähnlicher Weise ist der Prozentsatz Index (PI) des Experiments 0,24, was darauf hinweist, dass Fliegen in allen vier Quadranten in der 5 min Testperiode ziemlich gleichmäßig verteilt wurden. Die vier Feldverhaltensreaktion auf eine attraktive Riechstoff ist in 3C gezeigt. Apfelessig wird in den Luftstrom eingeführt von &#160; oben links Geruch Quadrant Luftstrom durch eine 6,25% Verdünnung von Apfelessig in die Testkammer Geruch platzieren. Die gesammelten Flugspuren in grau dargestellt zeigen, dass die meisten Fliegen in diesem Geruch Quadranten sammeln, und nicht mehr alle vier Quadranten erkunden. Eine einzelne farbige Fliege Spur zeigt, dass einmal eine Fliege den Apfelessig geruchs Quadrant Apfel betritt, ist es in der attraktiven Geruch Quadranten zu bleiben neigt. Die KI von 0,94 für das Experiment in der Nähe von 1, was starke Anziehungskraft auf diese Riechstoff. Der PI von 0,92 zeigt an, dass 92% der Fliegen rim Geruch Quadranten während der Analyseperiode emained. Die vier Feldverhaltensreaktion auf eine abstoßende Geruchsstoff wird in 3D gezeigt. Eine 10% ige Verdünnung des Riechstoff Ethylpropionat in einer Geruchskammer gelegt wurde als die Geruchsquelle für den linken oberen Luftstrom verwendet wird. Die geballte fly Spuren für den analysierten Experiment zeigen Vermeidung der Geruchs Quadranten, andeutend geruchs geführt Abstoßung. Eine einzelne farbige Fliege Spur zeigt, dass eine Fliege, wenn sie den Geruch Quadrant eingegeben, schnell weg den Geruch Quadranten zu vermeiden gedreht. Die KI von -0,68 kleiner als 0 ist, die Abstoßung gibt, und in der Nähe auf -1, was auf eine starke Abstoßungsriechstoff Antwort. Der PI von 0,06 für das Experiment legt nahe, daß nur 6% (im Vergleich zu ca. 25% in den neutralen Geruch Experimenten) der Fliegendatenpunkte verfolgt wurden im Geruch Quadranten über den Verlauf des Experimentes gefunden. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=&quot;1&quot;&gt; Eine Attraktion Index ist die am weitesten verbreitete metrische olfaktorischen Daten für die Analyse, da sie Werte größer als 0 ermöglicht weniger Anziehung (positiv) und Partituren, um anzuzeigen, als 0, um anzuzeigen, Abstoßung (negativ). Je näher die Partitur auf +1 oder -1, desto stärker ist die Anziehung oder Abstoßung zu diesem Geruch auf. Wie oben beschrieben, kann diese Metrik zeigen nicht eindeutig den Prozentsatz oder Anteil von Fliegen zur Geruchs Quadranten über den Verlauf des Experiments verfolgt. In diesem Fall kann ein Prozentsatz Index informativer. 3E Diagramme , die die Beziehung zwischen AI und PI - Scores, und wie sich diese Zahlen beziehen sich auf die anziehende oder abstoßende Verhalten. Das Vier-Feld-Test führt zu robusten und reproduzierbaren olfaktorische Verhalten. Dies ermöglicht eine quantitative Vergleiche zwischen Kontroll- und Versuchsbedingungen wie in 3F gezeigt ist , und ermöglicht auch die Identifizierung von subtilen olfactory Antworten, die von der Neutralität abweichen. Ferner, da die Daten mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung erhalten wird, ist es möglich , zahlreiche Faktoren der Verhaltensreaktionen, wie beispielsweise Flugbahnen einzelner Fliegen zu untersuchen (wie in 3 gezeigt), sowie verschiedene Aktivitäts Dynamik der Fliegen charakterisieren in ein Geruch Feld (zB Änderungen in Richtung und Geschwindigkeit 19,20). Es kann oft schwierig sein, das Vier-Feld-Arena in genau der gleichen Stelle für jedes Experiment zu positionieren, vor allem, da eine häufige Reinigung der Arena benötigt wird. Die zur Verfügung gestellten Analysen Skripte für diese geringfügige Schwankungen kompensieren , indem zuerst die Daten passend wie in 4A gezeigt. In diesem Fall wird die Form der Vierfeld-Arena berechnet, und Datenpunkte, die außerhalb dieses Raumes liegen, werden entfernt. Diese verfolgten Objekte stellen oft debris oder Reflexionen, die fälschlicherweise verfolgt werden. Als sie in der Arena nicht liegen und somit Lärm darstellen, ist es wichtig, dass diese Datenpunkte entfernt werden fehlerhaft zu verhindern Datenanalysen. Ebenso ist es auch wichtig, getrackten Datenpunkte zu entfernen, die Rauschen oder unbewegten Fliegen in der Arena darstellen könnte. Um dies zu erreichen, wird eine Analyse Skript verwendet (und hier zur Verfügung gestellt) , die Datenpunkte entfernt , die im Wesentlichen nicht bewegen (wie in 4B gezeigt). Diese Datenpunkte sind in der Regel in der Minderheit, doch ihre Retention zu Fehlern bei der Analyse führen würde. Art der Index und Vorlieben Indexwerte können nach einem festgelegten Zeitraum berechnet werden (zB am Ende eines 5 min Experiment wie in Abbildung 3). Es sollte jedoch angemerkt werden, dass, da Fliegen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung verfolgt werden, ähnliche Analysen während des gesamten Experiments durchgeführt werden konnte. Das istin 4C in dem die Art der Index und Percentage Index Scores berechnet in kontinuierlichen 10-sec bins über die Zeitperiode angezeigt. Eine solche Analyse ermöglicht eine bessere Würdigung der olfaktorischen Veränderungen, die während des gesamten Experiments, wie Gewöhnung an Riechstoff auftreten könnten. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54346/54346fig1.jpg" /> Abb . 1: Schematische Darstellung des Vier-Quadranten - Olfaktometer (A) Das Verhalten Aufbau eines Geruchsabgabesystem zusammengesetzt ist, Temperaturregelsystem (nicht grafisch dargestellt), Bildaufnahmesystem (IR LED - Leuchten und IR - CCD - Kamera an einen Computer angeschlossen ist ), vier-Quadranten-Arena und lichtdichten Verhalten und Arena-Boxen. Die roten Kreise bezeichnen die entsprechenden Komponenten in Abbildung 2 (B) Ausführungsplanung des Geruchsabgabesystems gezeigt. Die grünen Zeichen stehen für die Verbindung / Umwandlung Größen von fDie Armaturen. Schläuche von 1/16 ID und 1/8 OD sind gelb, während diejenigen von 1/8 ID und 1/4 OD markiert sind, in rosa markiert. Abkürzungen: IR, Infrarot; CF, Kompressionsverschraubung; BF, Schlauchtülle, MNPT, Mann National Pipe Thread. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54346/54346fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54346/54346fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54346/54346fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Fotos von der Setup - olfaktorischen Assay (A) Weitfeld - Ansicht der Kamera - Box und Verhalten Box. (B) Blick in das Verhalten Feld. Der Temperaturfühler, Stecker Rohre und IR-LED-Arrays sind beschriftet. (C) Vier-Quadranten - Arena. (D) Weitfeld - Ansicht des Geruchsabgabesystems auf das Verhalten Box verbunden. Das Kameragehäuse wurde entfernt, um die CCD-Kamera zu offenbaren. (E </strong&gt;) Zentral Luft zuerst durch einen Druckregler geleitet und dann durch einen Kohlefilter. (F) Beispiel der Geruchsröhren verbunden mit dem Verteiler. (G) Hochaufgelöste Strömungsrohre regulieren den Luftstrom. (H) Der Geruch Förderschlauch und Anschlüsse hinter den Durchflußrohr Regler. (I) Die Magnetventile regulieren , wenn saubere Luft durch einen Geruchskammer geleitet wird , oder in den Raum ausgestoßen. (J) Die Geruchskammern sind mit Einwegventilen verbunden ist , und enthält eine innere Glasbehälter für das Odoriermittel. (K) Das Verhalten Box enthält außerhalb Push-to-Connect - Armaturen, die mit dem Geruch Förderschlauch anschließen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54346/54346fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54346/54346fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54346/54346fig3.jpg" /> <strOng&gt; Abbildung 3: Beispiel Daten , die ein Vier-Feld olfaktorischen Assay generiert unter Verwendung von (A) Schematische Darstellung des Vier-Feld - Arena.. (B) Neutrale Reaktionen beobachtet werden, wenn alle vier Quadranten nur trockene Luft Perfusion enthalten. (C) Art der Antworten auf eine 6,25% Verdünnung von Apfelessig aus dem linken oberen Quadranten perfundiert. (D) Repulsion Verhaltensweisen , die von 10% Ethylpropionat ausgelöst. In 2B bis 2D wird eine einzelne Bahn aus der erhaltenen Daten aufgetragen. Ein Farbverlauf wird verwendet, um den Zeitverlauf der Aufnahme zu bedeuten, mit blauen und roten Farben, die Anfang und Ende der Aufnahmen ist, respectively. (E) Vergleich der Art Index (AI) und der Prozentsatz Index (PI). (F) Durchschnitt KI von 3- 6 Experimente ohne Geruch (Control), Apfelessig (ACV) und 10% Ethylpropionat (EP). Fehlerbalken zeigen SEM. Statistische Differenz wurde von der Kolmogorov-Smirnov te ausgewertetst. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54346/54346fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54346/54346fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54346/54346fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Beispieldaten , die durch die Datenanalyse Schritte (A) räumliche Filterung der Daten, durchgeführt von MaskSpatialFiltering.m , um Datenpunkte zu entfernen , die außerhalb der Arena fallen. Rote Kreise zeigen Anfangspositionen der Kreise, die verwendet werden, um die Grenzen der Arena zu definieren. Schwarze Kreise sind die endgültigen Positionen erworben, durch den Kreis passend zu den Daten umreißt (grau schattierte Fläche im Inneren des Vier-Felder). Rote Punkte und schwarze Pfeile bezeichnen Datenpunkte, die aus dem Datensatz nach diesem Filterschritt entfernt werden. (B) eine zeitliche Filterung von Daten, die von TemporalFiltering.m durchgeführt. Dieser Filterschritt entfernt Datenpunkte, die sehr slo bewegenWLY oder gar nicht, da sie wahrscheinlich vom unbewegten Fliegen erzeugt werden oder durch Schmutz / Reflexionen von der Arena. Ein roter Punkt durch eine gestrichelte roten Kasten umgeben zeigt Positionen von ~ 6.000 Datenpunkte mit identischen Koordinaten, die von diesem Filterungsschritt entfernt wird. (C) Art der Index (AI) und Percentage Index (PI), berechnet in 10-Sekunden - Bins in den letzten 5 Minuten eines Experiments durch AttractionIndex.m. Temporal Profile dieser Indizes enthalten Informationen über die Dynamik von Verhaltensreaktionen und können für eine detaillierte Analyse von Verhaltensweisen verwendet werden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54346/54346fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54346/54346fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Olfaktorischen Behaviors Assayed von Computer-Tracking<em&gt; Drosophila</em&gt; In einem Vier-Quadranten-Olfaktometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

olfactory-behaviors-assayed-computer-tracking-drosophila-four

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

15.6K Aufrufe.  Johns Hopkins University School of Medicine. We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Serie: Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

Combining Computer Game-Based Behavioural Experiments With High-Density EEG and Infrared Gaze Tracking

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they yield data relevant to the cognitive processing that occurs under ecologically valid conditions. These two goals often are at odds, since well controlled stimuli often are too repetitive to sustain subjects' motivation. Studies employing electroencephalography (EEG) are often especially sensitive to this dilemma between ecological validity and experimental control: attaining sufficient signal-to-noise in physiological averages demands large numbers of repeated trials within lengthy recording sessions, limiting the subject pool to individuals with the ability and patience to perform a set task over and over again. This constraint severely limits researchers' ability to investigate younger populations as well as clinical populations associated with heightened anxiety or attentional abnormalities. Even adult, non-clinical subjects may not be able to achieve their typical levels of performance or cognitive engagement: an unmotivated subject for whom an experimental task is little more than a chore is not the same, behaviourally, cognitively, or neurally, as a subject who is intrinsically motivated and engaged with the task. A growing body of literature demonstrates that embedding experiments within video games may provide a way between the horns of this dilemma between experimental control and ecological validity. The narrative of a game provides a more realistic context in which tasks occur, enhancing their ecological validity (Chaytor &amp; Schmitter-Edgecombe, 2003). Moreover, this context provides motivation to complete tasks. In our game, subjects perform various missions to collect resources, fend off pirates, intercept communications or facilitate diplomatic relations. In so doing, they also perform an array of cognitive tasks, including a Posner attention-shifting paradigm (Posner, 1980), a go/no-go test of motor inhibition, a psychophysical motion coherence threshold task, the Embedded Figures Test (Witkin, 1950, 1954) and a theory-of-mind (Wimmer &amp; Perner, 1983) task. The game software automatically registers game stimuli and subjects' actions and responses in a log file, and sends event codes to synchronise with physiological data recorders. Thus the game can be combined with physiological measures such as EEG or fMRI, and with moment-to-moment tracking of gaze. Gaze tracking can verify subjects' compliance with behavioural tasks (e.g. fixation) and overt attention to experimental stimuli, and also physiological arousal as reflected in pupil dilation (Bradley et al., 2008). At great enough sampling frequencies, gaze tracking may also help assess covert attention as reflected in microsaccades - eye movements that are too small to foveate a new object, but are as rapid in onset and have the same relationship between angular distance and peak velocity as do saccades that traverse greater distances. The distribution of directions of microsaccades correlates with the (otherwise) covert direction of attention (Hafed &amp; Clark, 2002).

Procedures for recording high-density EEG and gaze data during computer game-based cognitive tasks are described. Using a video game to present cognitive tasks enhances ecological validity without sacrificing experimental control.

Die Kombination Computer Game-Based Behavioural Experimente mit High-Density EEG-und Infrarot-Tracking-Gaze

Experimental paradigms are valuable insofar as the timing and other parameters of their stimuli are well specified and controlled, and insofar as they ...

Forschung

Neurowissenschaften

Assessment of Social Interaction Behaviors

Social interactions are a fundamental and adaptive component of the biology of numerous species. Social recognition is critical for the structure and stability of the networks and relationships that define societies. For animals, such as mice, recognition of conspecifics may be important for maintaining social hierarchy and for mate choice 1.
A variety of neuropsychiatric disorders are characterized by disruptions in social behavior and social recognition, including depression, autism spectrum disorders, bipolar disorders, obsessive-compulsive disorders, and schizophrenia. Studies of humans as well as animal models (e.g., Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Mus musculus, Rattus norvegicus) have identified genes involved in the regulation of social behavior 2. To assess sociability in animal models, several behavioral tests have been developed (reviewed in 3). Integrative research using animal models and appropriate tests for social behavior may lead to the development of improved treatments for social psychopathologies.
The three-chamber paradigm test known as Crawley's sociability and preference for social novelty protocol has been successfully employed to study social affiliation and social memory in several inbred and mutant mouse lines (e.g. 4-7). The main principle of this test is based on the free choice by a subject mouse to spend time in any of three box's compartments during two experimental sessions, including indirect contact with one or two mice with which it is unfamiliar. To quantitate social tendencies of the experimental mouse, the main tasks are to measure a) the time spent with a novel conspecific and b) preference for a novel vs. a familiar conspecific. Thus, the experimental design of this test allows evaluation of two critical but distinguishable aspects of social behavior, such as social affiliation/motivation, as well as social memory and novelty. "Sociability" in this case is defined as propensity to spend time with another mouse, as compared to time spent alone in an identical but empty chamber 7. "Preference for social novelty" is defined as propensity to spend time with a previously unencountered mouse rather than with a familiar mouse 7. This test provides robust results, which then must be carefully analyzed, interpreted and supported/confirmed by alternative sociability tests. In addition to specific applications, Crawley's sociability test can be included as an important component of general behavioral screen of mutant mice.

Here we describe a detailed protocol for examination of sociability in mice by using Crawley's sociability and preference for social novelty test. We describe the advantages and possible applications for this procedure, including critical details important for correct interpretation of the results.

Bewertung der sozialen Interaktion Behaviors

Social interactions are a fundamental and adaptive component of the biology of numerous species. Social recognition is critical for the structure and ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Erwachsene olfaktorischen Schock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Eine EDV-gestützte Multi-Elektroden-Patch-Clamp-System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Ganze Berge Immunmarkierung der olfaktorischen Rezeptorneuronen in der<em&gt; Drosophila</em&gt; Antennen

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Low-cost Method for Analyzing Seizure-like Activity and Movement in Drosophila

Video tracking systems have been used widely to analyze Drosophila melanogaster movement and detect various abnormalities in locomotive behavior. While these systems can provide a wealth of behavioral information, the cost and complexity of these systems can be prohibitive for many labs. We have developed a low-cost assay for measuring locomotive behavior and seizure movement in D. melanogaster. The system uses a web-cam to capture images that can be processed using a combination of inexpensive and free software to track the distance moved, the average velocity of movement and the duration of movement during a specified time-span. To demonstrate the utility of this system, we examined a group of D. melanogaster mutants, the Bang-sensitive (BS) paralytics, which are 3-10 times more susceptible to seizure-like activity (SLA) than wild type flies. Using this novel system, we were able to detect that the BS mutant bang senseless (bss) exhibits lower levels of exploratory locomotion in a novel environment than wild type flies. In addition, the system was used to identify that the drug metformin, which is commonly used to treat type II diabetes, reduces the intensity of SLA in the BS mutants.

A Low-cost Method for Analyzing Seizure-like Activity and Movement in Drosophila

Using a webcam and a combination of free and inexpensive software programs, locomotive patterns in Drosophila melanogaster can be analyzed to detect differences in the speed, distance, and time of various motor activities.

Ein Low-Cost-Methode für die Analyse von Beschlagnahme-ähnliche Aktivität und Bewegung in<em&gt; Drosophila</em

Video tracking systems have been used widely to analyze Drosophila melanogaster movement and detect various abnormalities in locomotive behavior. While ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Erwerb von qualitativ hochwertigen digitalen Video<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Verhalten der Erwachsenen aus einer seitlichen Perspektive

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters

The ability to measure neurotransmitter release on a rapid time scale allows patterns of neurotransmission to be linked to specific behaviors or manipulations; a powerful tool in elucidating underlying mechanisms and circuitry. While the technique of microdialysis has been used for decades to measure nearly any analyte of interest in the brain, this technique is limited in temporal resolution. Alternatively, fast scan cyclic voltammetry is both temporally precise and extremely sensitive; however, because this technically difficult method relies on the electroactivity of the analyte of interest, the possibility to detect nonelectroactive substances (e.g., the neurotransmitter glutamate) is eliminated. This paper details the use of a turn-key system that combines fixed-potential amperometry and enzymatic biosensing to measure both electroactive and nonelectroactive neurotransmitters with temporal precision. The pairing of these two powerful techniques allows for the measurement of both tonic and phasic neurotransmission with relative ease, and permits recording of multiple neurotransmitters simultaneously. The aim of this manuscript is to demonstrate the process of measuring dopamine and glutamate neurotransmission in vivo using a naturally rewarding behavior (i.e., sexual behavior) in female hamsters, with the ultimate goal of displaying the technical feasibility of this assay for examining other behaviors and experimental paradigms.

Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters

This paper details the use of fixed-potential amperometric recordings using carbon fiber electrodes and enzymatic biosensor technology to measure the release of dopamine and glutamate with high temporal resolution during natural rewarding behavior in the female hamster.

Messung In Vivo Veränderungen der extrazellulären Neurotransmitter während natürlich lohnende Verhaltensweisen in weiblichen syrischen Hamster