Diese Forschung wurde von der Grundlagenforschung Forschungsprogramm durch die National Research Foundation of Korea (NRF) vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (2013068067) finanziert unterstützt; von Brain Korea 21 Graduiertenprogramm des koreanischen Ministeriums für Bildung, Wissenschaft und Technologie, Seoul National University Hospital, der koreanischen Society of Hypertension (2013), SK Telecom Research Fund (Nr. 3420130290) und der National Natural Science Foundation of China (NSFC 31.460.265; NSFC 81.260.035).

Das Protokoll ist in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die UN-National Institutes of Health veröffentlicht (NIH Publication No. 85-23, überarbeitet 1996). Es wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der Seoul National University (IACUC Zulassung Nr .: SNU-101213-1) zugelassen. 1. Puffer Vorbereitung (Tabelle Materialien und Geräte) <ol><li> Bereiten 300 ml frisches Isolationslösung am Tag des Experiments (in mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl 2 3,5; Glucose, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4; Taurin, 20; pH 7,4 mit NaOH). </li><li> Herstellung von 100 ml frischem Aufbewahrungslösung am Tag des Experiments (in mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO 4 5; CaCl 2 0,2; Natrium-Pyruvat 5; 5,5 Glucose; Taurin 20; HEPES 10; Mannit 29; pH 7,4 mit NaOH). </li><li> Bereiten 1L Perfusionslösung (in mM: NaCl, 141,4; KCl, 4; NaH 2 PO 4, 0,33; MgCl 2, 1; HEPES, 10; Glucose, 5,5; CaCl 2, 1,8; Mannit, 14.5; pH 7,4 mit NaOH). </li><li> Herstellung von 30 ml Kollagenase - Lösung 1 durch Kollagenase - Zugabe (1 mg / ml), Protease (0,1 mg / ml), Rinderserumalbumin (BSA, 1.67mg / ml) und Ca 2+ (0,05 mM) 25 ml Isolations Lösung. </li><li> Es werden 20 ml Kollagenase - Lösung 2 durch Kollagenase Zugabe (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml) und Ca 2+ (0,05 mM) zu 16,7 ml Isolierungslösung. </li><li> Vorbereitung 40 ml BSA-Lösung durch Zugabe von 0,4 g BSA zu 40 ml Isolationslösung. Separate 10 ml und 30 ml in zwei Bechern. Hinzufügen Ca 2+ zu 30 ml BSA - Lösung so , dass die endgültige Ca 2+ -Konzentration in der BSA - Lösung beträgt 1 mM. </li></ol> 2. Vorbereitung für die Isolierung der linksventrikulären (LV) Myozyten <ol><li> Übertragen 8-12 Wochen alte, männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten in sauberen Transportkäfigen aus dem Tier Anlage zur Herstellung und Isolierung Raum. </li><li> Hessen zwei Wasserbäder bis 37 o C. Hinweis: Verwenden Sie ein Wasserbad für das Wasser - ummantelten Reservoir und den Perfusionsschläuche des Langendorff-Perfusionssystem. Verwenden Sie die anderen Wasserbad Myokardgewebe Stämme, um zu agitieren einzelnen Myozyten zu trennen. </li><li> 5 ml und 3,3 ml BSA - Lösung (ohne Ca 2+) zu 25 ml Kollagenase - Lösung 1 und 16,7 ml Kollagenase - Lösung 2 , um das Volumen auf 30 ml zu begrenzen und 20 ml. </li><li> Hinzufügen Isolationslösung (100 ml) und Kollagenase - Lösung 1 (30 ml) zu Spalte 1 (Col. 1) und der Spalte 2 (Col. 2) in der Langendorff - Perfusionssystem, bzw. (1A). </li><li> Oxydieren das Isolationslösung und Kollagenase - Lösung 1 in Spalte 1 und Spalte 2 über das Sauerstoffverbindungsrohr in der Langendorff - Perfusionssystem (1A). In ähnlicher Weise oxygenate Kollagenase - Lösung 2 und die BSA - Lösung im Schüttelwasserbad mit 100% O 2 über dieSauerstoff Verbindungsrohr. </li></ol> 3. Isolierung von LV Myozyten <ol><li> Anesthetize eine SD - Ratte über intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital (30 mg / kg) und das Anästhetikum Status durch Zeh bestätigen Kneifen und der Mangel an Rückzug Reflexion. </li><li> Bewegen Sie die Ratte auf eine Dissektion Fach. In der Rückenlage, sichern Sie die vier Beine an den Seiten des Körpers mit Klebeband. </li><li> Bewerben Brust-Mitte axiale Einschnitte mit chirurgischen Schere, um die Truhe zu öffnen, um sicherzustellen, das Herz nicht zu beschädigen. Verwenden Sie ein anderes Paar saubere Schere , um das Herz von den Verbindungsgefäße zu sezieren (zB obere und untere Hohlvene, Lungengefäße und Aorta) und Perikardmembran 13. </li><li> Lassen Sie einen Teil der Aorta eine ausreichende Länge (5-8 mm), klemmen die Aorta mit einer feinen Pinzette, und montieren Sie schnell die Kanüle des Langendorff - Perfusionssystem innerhalb von 1 min (1A). Binden Sie Nähfaden 4/0 dicht über der Aorta. </li><li&gt; Schalten Sie das Ventil auf Spalte 1 und das isolierte Herz mit vorgewärmten und mit Sauerstoff angereicherten Isolationslösung für 10 min (Perfusions-Rate: 12-14 ml / min) perfuse. Schalten Sie das Ventil auf Spalte 1, schalten Sie das Ventil auf Spalte 2 und perfuse das Herz mit Kollagenase-Lösung 1 für 8 - 10 min. </li><li> Abmontieren verdaut Herz durch die Aorta schneiden und übertragen es durch Halten der Aorta mit einer Pinzette in den Kolben mit frischen Isolationslösung (Abbildung 1Bi). Verwenden einer feinen Schere und Pinzette die meisten der LV freien Wand zu schneiden (einschließlich des Septum) in kleinere Stücke (~ 22 mm, Abbildung 1Bii). </li><li> Übertragen Sie die Stücke in einen Kolben vorgewärmte und mit Sauerstoff angereicherte frische Kollagenase - Lösung 2 (Abbildung 1Biii) enthält. Schütteln für 10 min. Halten Sie sich an die myocyte haltigen Kollagenase-Lösung 2 liefert Sauerstoff. </li><li> Bewegen Sie den myocyte - Suspension auf eine 10 ml Zentrifugenröhrchen Tropfer mit einem Saugball mit und fügen Ca 2+ - enthält BSA - Lösung (1: 1 in Volumen). Zentrifuge bei 30 g für 2 min und den Überstand verwerfen. Resuspendieren des Pellets Myozyten in 5 ml BSA-Lösung. Zentrifuge und den Überstand verwerfen. </li><li> Disperse die myocyte Pellets und halten Myozyten in 10 ml vorge mit Sauerstoff angereicherte Speicherlösung bei RT (Abbildung 1Biv-vi). </li><li> Wiederholen Sie die Verfahren (Schritte 3,7-3,9) mit dem restlichen LV Gewebe in den Kolben. Hinweis: Bewahren Sie die Verfahren zu wiederholen (Schritte 3,7 bis 3,9) erneut, bis die meisten der LV Gewebe verschwindet eine gute Ausbeute an Myozyten zu erhalten. </li><li> Halten Sie die Myozyten in Speicherlösung für 6-8 Stunden bei RT bis zum Ende der Experimente. </li></ol> 4. Gleichzeitige Messungen intrazellulärer Ca 2+ Transienten und Muskelzellen Kontraktions <ol><li> Last LV Myozyten mit dem Acetoxymethylester Fura-2 AM (2 uM). Hinweis: Führen Sie alle Ladevorgänge und Experimente mit geladenen Myozyten in einem dunklen Rohr (Abbildung 1Bvii). <ol><li> Centrifuge die Myozyten-Suspension (1 ml) bei 2.000 xg für 10 sec. Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren die myocyte Pellet in 1 ml Tyrode - Lösung mit einer niedrigen Ca 2+ Konzentration (250 &amp; mgr; M, Tisch Materialien und Geräte). </li><li> In Fura-02.00 und Poloxamer 407 (2 ul), sanft die myocyte Suspension zu dispergieren, und halten Sie die Mischung bei RT (20 bis 24 ° C) für 15 Minuten (Abbildung 1Bvii). </li><li> Zentrifuge die Mischung für 5 Sekunden, um den Überstand verwerfen und die Myozyten - Pellet in 1 ml Perfusionslösung 2+ , enthaltend 500 uM Ca dispergieren. Nach 10 min Zentrifugation der Mischung für 5 Sekunden und den Überstand verwerfen. </li><li> In frischen Perfusions - Lösung (500 &amp; mgr; M Ca 2+, 1 ml) und halten Sie die Fura-02.00 - geladen myocyte Pellet in dieser Lösung für Aufnahmen. </li></ol></li><li> Messung des LV Myozyten Kontraktion und intrazellulären Ca 2+ <ol><li> Vor der Aufnahme, füllen Sie das Perfusions-Schlauch, der durch eine läuftWassermantel mit der Tyrode - Lösung, die auf 36 o C vorgewärmt ist </li><li> Legen Sie ein paar Tropfen des Fura 02.00 - geladen LV myocyte Suspension auf die Kammer eines invertierten Fluoreszenzmikroskop 5 - 8 min. perfuse langsam die Tyrode-Lösung (2,2 ml / min). </li><li> Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Start&quot; auf der Frontplatte des digitalen Stimulator Feldstimulation (2 Hz) starten. Hinweis: Die Ausgangsspannung (10 V, 5 msec Dauer) wird in der Kammer durch Platindrähte mit den Myozyten aufgebracht auf jeder Seite der Kammer positioniert ist. <ol><li> Wählen Sie Myozyten stabil, dass Vertrag (nicht diejenigen, die Anzeige Hyper- oder Hypo-Kontraktion) für die Aufnahme. </li></ol></li><li> Stellen Sie die myocyte der Wahl in der horizontalen Position des videobasierten Sarkomers Detektionssystem und stellen Sie den Fokus des Mikroskops optimale Bilder von Sarkomere zu erhalten. Positionieren Sie den lila rechteckigen Kasten auf dem Gebiet, in dem klar Sarkomere klar, bis die durchschnittliche beobachtet werdenvon Sarkomers Längen (rot Peak) zeigt eine singuläre scharfe Spitze (2A, unteres Bild). </li><li> Aufzeichnen der Änderungen der Sarkomerlänge in Reaktion auf Feldstimulation (2A und B). Hinweis: Verwenden Sie die geladenen Myozyten in 1 - 2 Stunden. </li><li> Stellen Sie die Blende der Kamera so , dass das Feld in der videobasierten Sarkomers Detektionssystem ist die Größe der Myozyten (2A). Stimulieren die Myozyten mit einer Anregung bei 360 nm / 380 nm und Emission bei 510 nm (Erfassungsfrequenz 1000 Hz). Nehmen Sie Sarkomerverkürzung und die Fura2 AM Verhältnis mit Feldstimulation (2B). </li></ol></li></ol> 5. Bewertung der myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit <ol><li> Der Mittelwert der Sarkomers Längen und Ca 2+ Transienten im Steady-State (10 - 20 Spuren) , und zeichnen Sie die Phase-Ebene Schleife des Fura-2 - Verhältnis vs. Sarkomerlänge des gleichen myocyte (beide mit Messwerts und Deltaänderungen; 2C). </li><li> In jedem Plot definieren Fura -2 - Verhältnis bei 50% Relaxation (EC 50, 2C). Vergleichen Sie sowohl die Schleife und EC 50 von jeder Intervention. </li></ol>

<ol>
	<li>Bers, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+excitation-contraction+coupling.">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li><li>Eisner, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+calcium+cycling+in+cardiac+muscle.">Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle.</a> Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).</li><li>Palmiter, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+regulating+the+myofilament+response+to+Ca2+:+implications+of+mutations+causal+for+familial+hypertrophic+cardiomyopathy.">Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy.</a> Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).</li><li>Missiaen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+intracellular+Ca2++homeostasis+and+disease.">Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease.</a> Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).</li><li>Trafford, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca+content+in+cardiac+ventricular+myocytes.">A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).</li><li>Berlin, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+cytosolic+calcium+buffering+properties+of+single+rat+cardiac+myocytes.">Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes.</a> Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).</li><li>Robertson, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+time-course+of+Ca2++exchange+with+calmodulin,+troponin,+parvalbumin,+and+myosin+in+response+to+transient+increases+in+Ca2+.">The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+.</a> Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).</li><li>Schober, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofilament+Ca2++sensitization+increases+cytosolic+Ca2++binding+affinity,+alters+intracellular+Ca2++homeostasis,+and+causes+pause-dependent+Ca2+-triggered+arrhythmia.">Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia.</a> Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).</li><li>Briston, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balanced+changes+in+Ca+buffering+by+SERCA+and+troponin+contribute+to+Ca+handling+during+&#946;-adrenergic+stimulation+in+cardiac+myocytes.">Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during &#946;-adrenergic stimulation in cardiac myocytes.</a> Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).</li><li>Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+control+of+cardiac+myofilament+response+to+calcium+by+S-glutathionylation+at+specific+sites+of+myosin+binding+protein+C.">Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C.</a> Front Physiol. 4, 336 (2013).</li><li>Jin, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofilament+Ca2++desensitization+mediates+positive+lusitropic+effect+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+in+left+ventricular+myocytes+from+murine+hypertensive+heart.">Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+L-type+Ca2++channel+activity+by+neuronal+nitric+oxide+synthase+and+myofilament+Ca2++sensitivity+in+cardiac+myocytes+from+hypertensive+rat.">Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat.</a> Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).</li><li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li><li>Spurgeon, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+calcium+and+myofilaments+in+single+rat+cardiac+myocytes+achieve+a+dynamic+equilibrium+during+twitch+relaxation.">Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation.</a> J Physiol. 447, 83-102 (1992).</li><li>Preston, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+effects+of+the+DCM+mutant+Gly159Asp+troponin+C+in+skinned+muscle+fibres.">Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres.</a> Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).</li><li>Willott, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Troponin+that+cause+HCM,+DCM+AND+RCM:+what+can+we+learn+about+thin+filament+function?.">Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function?.</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).</li><li>Yasuda, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+study+contraction+characteristics+of+a+single+cardiac+myocyte+using+carbon+fibers.">A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).</li><li>Sears, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neuronal+nitric+oxide+synthase+isoform+regulates+myocardial+contraction+and+calcium+handling.">Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling.</a> Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).</li><li>Ashley, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+nitric+oxide+synthase+1+regulates+basal+and+beta-adrenergic+contractility+in+murine+ventricular+myocytes.">Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes.</a> Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).</li><li>Zhang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+phospholamban+phosphorylation+is+associated+with+impaired+relaxation+in+left+ventricular+myocytes+from+neuronal+NO+synthase-deficient+mice.">Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice.</a> Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).</li><li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium.">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li><li>Grynkiewicz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Hier beschreiben wir die Protokolle Änderungen von myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in einzelnen isolierten Kardiomyozyten zu bewerten und betonen die Bedeutung der Messung dieser Parameter neben elektrophysiologischen Eigenschaften, die intrazelluläre Ca2 + Transienten und myofilament Dynamik. Dies liegt daran, die Aufnahmen von einem oder zwei der Parameter können die Mechanismen zugrunde liegenden Herzkontraktion und Entspannung nicht expliziert. Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren , die Myozyten - Kontraktion und die intrazelluläre Ca 2+ Profil einzeln 1, das vorliegende Verfahren messen sucht beide Parameter gleichzeitig im gleichen Herzmyozyten. Eine Reihe von Verfahren sind im allgemeinen zur Bewertung der myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit von Muskeln oder Myozyten 15,16,17, beispielsweise Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen exogenen Ca 2+ und Sarkomers / Zellenlänge / Spannung in enthäuteten Myozyten verwendet(Behandelt mit Detergenzien wie Saponin oder β-Esin um die Membran zu permeabilisieren). Die Längen sind mit Fotodiode und Laserstrahlbeugungsverfahren gemessen, und die Spannung mit Kraftaufnehmer oder Kohlefasern). Diese Techniken sind weit verbreitet in der Muskelstudien verwendet , weil sie quantitative Bewertungen von myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit ermöglichen. Endogene Ionenkanal - Aktivitäten in der Plasmamembran und intrazellulären Ca 2+ Handhabung erforderlich diejenigen sind jedoch auf die Mechanik der myofilament initiieren, werden in diesen Techniken vernachlässigt. Darüber hinaus sind die Muskelstreifen oder Myozyten in Untersuchung vorgedehnten zu einer bestimmten diastolischen Länge und unter diesen Bedingungen die anfängliche Sarkomerlänge kann von der tatsächlichen diastolischen Länge der Myozyten (insbesondere in Krankheitszuständen und mit Eingriffen) unterscheiden. Dies unterstreicht die Vorteile der aktuellen Messung, wo Zellorganellen relativ unbeeindruckt bleiben, wodurch, so dass der umfassende Evaluation von myocyte Kontraktionsfunktion. Verständlicherweise Qualität der Myozyten (Ca 2+ -tolerating) und die optimale Beladung von Fura - 02.00 sind zwei Schlüsselelemente für eine erfolgreiche Beurteilung der myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit. Dementsprechend sind mehrere Modifikationen an dem Protokoll angewandt , um praktikable stabförmigen Myozyten erhalten (60-80% der gesamten Zellen, wie zuvor 18,19,20 beschrieben). Zunächst wird eine geringe Dosis von Ca 2+ auf die Lösungen während der Aufschlußverfahren zugesetzt (beispielsweise die Ca 2+ -Konzentration beträgt 50 &amp; mgr; M in den Kollagenase - Lösungen und 200 uM in der Speicherlösung). Zweitens, während der Verdauung wird BSA auf die Kollagenase-Lösungen zugesetzt Membranstabilität zu verbessern. Drittens sind die meisten der Lösungen während der Isolierung oxygenierten, die den Prozentsatz der funktionellen Myozyten und die Dauer der Experimente (6-8 h) erhöht. Viertens werden isolierte Myozyten in Speicherlösung c gehaltenontaining 200 uM Ca 2+. Um eine optimale Beladung mit Fura 02.00 zu erhalten, zwei unterschiedliche Ca 2+ Konzentrationen (250 und 500 &amp; mgr; M) verwendet , und Poloxamer 407 (2 &amp; mgr; l, 20% in Dimethylsulfoxid) zugesetzt , um die Durchlässigkeit von Fura-2AM durch die Membran zu verbessern und seine Stabilität in Myozyten. Es sollte , dass alle Indikatorfarbstoffe Ca 2+ 21 Puffer sind Ca 2+ zu beachten. Daher sollten Forscher unter Verwendung einer hohen Konzentration von Fura-2 AM oder eine längere Inkubation vermeiden übermäßige Pufferung und reduziert Myozyten Kontraktilität vermeiden. Es wird empfohlen, myocyte Kontraktion ohne Fura - 2 Laden wird routinemäßig überprüft, was ein wesentlicher Schritt ist die Qualität der Myozyten und den Ladestatus zu schätzen. Variability in Laden ist unvermeidlich. Daher ist es wichtig, die Variabilität der Myozyten-Kontraktion zu überprüfen, insbesondere, ob die Anzahl der Myozyten in der Kammer ähnlich ist, bevor und einem öffentlichenfter Laden. Analyse von Hyper- oder Hypo-Contracting Myozyten sollte vermieden werden, weil sie nicht den durchschnittlichen Stand von Myozyten repräsentieren und kann verzerrten Ergebnissen und Auswertungen führen. Es sollte beachtet werden , daß die gemessenen Änderungen der Fura 2 - Verhältnis sind Reflexionen des intrazellulären Ca 2+ Ebene, anstatt die tatsächliche chemische Konzentration von Ca 2+. Daher wertet der hier beschriebenen Verfahren qualitative Veränderungen von myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit, anstatt die tatsächliche Empfindlichkeit des Myofilamente zu Ca 2+. Kalibrierung von Fura - 2 - Signal an die intrazelluläre Ca2 + -Konzentration ist die Lösung zuverlässig Ca 2+ Konzentrationen in einzelnen Myozyten zu erwerben. Das Kalibrierungsverfahren erfordert das Laden Myozyten mit verschiedenen Konzentrationen von Ca 2+ -konjugiertem Fura - 02.00 (Ca 2+ -Konzentration im Bereich von 0 bis 39 uM), und die erhaltene Fura - 2 -Verhältnissen mit th berechnete folgende Formel: [Ca 2+] i = Kd * (R - R min) / (Rmax - R) * F380max / F380min 21. Es ist möglich , die gepoolten Mittelwerte Ca 2+ -Konzentrationen durch einen solchen Kalibrierungsverfahren abgeleitet werden . Da jedoch das Laden von Ca 2+ Indikatoren variable unter Myozyten und Kalibrierung ist nicht in einer einzelnen Zelle durchgeführt, Ca 2+ -Konzentrationen nicht genau erfasst werden. Wenn ferner F360 / F380 gemessen wird , statt F340 / F380 (wie in der vorliegenden Studie), die Fura 2 -Verhältnis weniger genau (weil F360 der isobestischen Wellenlänge von Fura-2 - Fluoreszenz 22). Dennoch ist es immer noch eine gültige Methode zur qualitativen Veränderungen in myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in physiologischen Experimenten beurteilen, besonders in erkrankten menschlichen Herzen, wo Myofilamente können gleichzeitig nach Änderungen in der intrazellulären Umgebung verändert werden. Es wird empfohlen, dass dieses Verfahren mit alternativen Methoden kombiniert wird (wie dezuvor in der Diskussion Abschnitt beschrieben) , um genau die wahre Empfindlichkeit von Myofilamente zu Ca 2+ zu analysieren. Die andere Begrenzung des Verfahrens bei der Untersuchung von Myozyten Kontraktion der unbelasteten Zustand. Es kann die Änderungen in myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit unterschätzen oder überschätzen. Deshalb, um genau myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit, Analyse sollte durchgeführt werden , mit alternativen Messungen für sowohl qualitative als auch quantitative Bewertung zu bewerten. Die Technik ist für myokardiale Funktion in gesunden und kranken Herzen der Beurteilung, einschließlich der menschlichen Herz Proben, in denen die zellulären Redox-Milieu und posttranskriptionales Modifikationen verändert werden, was zu einer damit einhergehenden Veränderungen in myofilament Funktionen. Insbesondere Ionenkanäle, die intrazelluläre Ionenhomöostase und regulatorische Proteine ​​in Myofilamente sind interaktiv; daher alle diese Komponenten funktionieren in concert Herzleistung in vivo zu bestimmen (beispielsweise wie in der Echokardiographie gemessen). Abschließend beschreiben wir eine Methode , um die Änderungen von myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit und betonen die Bedeutung der Analyse dieser Parameter in Verbindung mit Herz - Elektrophysiologie, intrazellulärer Ca 2+ Handhabung und myocyte Kontraktion zu bewerten eine vollständige Profil von myocyte Funktion zu erhalten. Myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit sollte mit erkranktem Herzmodelle routinemßig in mechanistische Studien gemessen werden, wobei Änderungen dieser Parameter sowie verschiedene intrazelluläre Signalwege miteinander verbunden sind.

Kardiale Erregungs Kontraktion (EC) Kopplung ist das Grundschema für die mechanischen Eigenschaften des Myokards Analyse, dh die kontraktile Funktion des Herzens 1,2. EC Kopplung durch Membrandepolarisation sekundär zu den Aktivitäten von sarkolemmalen Ionenkanäle (beispielsweise die spannungsabhängigen Na + Kanal, der durch Patch-Clamp - Techniken gemessen werden kann) eingeleitet wird. Nachfolgende Aktivierung von spannungsabhängigen L-Typ - Ca 2+ -Kanälen (LTCC) und Ca 2+ -Einstrom durch LTCCs den Großteil der Ca 2+ -Freisetzung durch Ryanodin - Rezeptoren (RyRs) auslösen, die cytosolische Ca 2+ -Konzentration von nanomolaren Erhöhung (nM ) (uM) Ebene mikromolar. Eine solche Erhöhung der cytosolischen Ca 2+ Ca 2+ fördert die Bindung an Troponin C (TnC) in dünnen Fäden und entlockt Konformationsänderungen des Filaments Komplex die Actin-Myosin - Wechselwirkung zu erleichtern , und erreicht myocardial Kontraktion 3. Umgekehrt wird die cytosolische Ca 2+ erneut uptaken zurück in das sarkoplasmatische Retikulum (SR) durch die Ca 2+ -ATPase in SR (SERCA2a) oder aus dem Myozyten über das Na + / Ca 2+ -Austauscher und dem Plasmalemma extrudiert Ca 2+ ATPase 1,2. Folglich stiftet der Rückgang der cytosolischen Ca 2+ Konformationsänderungen von dünnen Fäden wieder in den ursprünglichen Zustand, was zur Dissoziation von Aktin-Myosin und myocyte Entspannung 1-3. In diesem Schema wird die Aktivität von SERCA2a allgemein als die Geschwindigkeit der myokardialen Entspannung zu bestimmen , weil es für die 70 - Konten - 90% der cytosolischen Ca 2+ Entfernung in den meisten Säugetierherzzellen 1. Als solche anormalen Handhabung Ca 2+ von LTCC, RyR und SERCA2a usw. hat die primären Mechanismen für beeinträchtigte Kontraktilität und Entspannung in das kranke Herz 1-4 betrachtet. 2+ , die Funktionen als der Bote in der EG - Kopplung entfallen rund 1% der gesamten intrazellulären Ca 2+ und die Mehrheit der Ca 2+ gebunden ist , an intrazelluläre Ca2 + Puffer 5,6. Dies ist aufgrund der Tatsache , dass verschiedene Ca 2+ Puffer in Herzmyocyten reichlich vorhanden sind, beispielsweise Membran - Phospholipiden, ATP, Phosphokreatin, Calmodulin, Parvalbumin, Myofibrille TnC, Myosin, SERCA2a und Calsequestrin in der SR. 5,6,7. Unter ihnen sind SERCA2a und TnC die vorherrschenden Ca2 + Puffer 5,6,7. Weiterhin 2+ Ca seiner Bindungspuffern während twitch ein dynamischer Prozess ist (beispielsweise 30-50% der Ca 2+ bindet an TnC und distanzieren von ihm während Ca 2+ Transienten 7) und die Änderung in Ca 2+ Bindungs ​​Ursache zusätzlicher &quot;Freigabe&quot; von freiem Ca 2+ in das Cytosol führt zu den Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ concentration. Folglich Störung der intrazellulären Ca 2+ Ebene induziert abnorme myofilament Bewegungen, die die Vorläufer der Kontraktions Dysfunktion und Arrhythmien 8,9. Viele Faktoren (sowohl physiologische und pathologische) können die Quellen der post-transkriptionalen Modifikationen myofilament Proteine ​​sein, die myofilament Ca 2+ Pufferung und myofilament 2+ 8-10 Empfindlichkeit Ca beeinflussen. Vor kurzem wurde berichtet , dass Mutationen in myofilament Proteine ​​, die die Ca 2+ erhöhen Bindungsaffinität und die intrazelluläre Ca2 + Handhabung, die Auslösung Pause abhängige Potenzierung von Ca 2+ Transienten, abnormal Ca 2+ Freisetzung und Arrhythmien 8. Im Einklang mit diesem Konzept haben wir auch , dass myofilament Ca 2+ Desensibilisierung bei hypertensiven Rattenherzen sekundär auf die Hochregulation der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase mit erhöhten systolischen und diastolischen Ca 2+ Ebenen zugeordnet gezeigt11, die wiederum 12 die Anfälligkeit der LTCC auf Ca 2+ -abhängigen Inaktivierung erhöht. Daher ist myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit ein &quot;aktives&quot; Regulator der intrazellulären Ca 2+ Homöostase und Myozyten kontraktilen Funktion. Es ist notwendig geworden , Wechselwirkungen zwischen myofilament und Ca 2+ zu analysieren Proteine ​​für die gründliche Untersuchung von myocyte EG - Kopplung und die Herzfunktion Handhabung. Hier beschreiben wir ein Protokoll , das die Veränderungen der myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in isolierten Kardiomyozyten bewertet. Umfassende Analyse der intrazellulären Ca 2+ Profil, myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit und Kontraktion werden neuartige Mechanismen der myokardialen Mechanik raben.

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley rat</td><td>Koatech</td><td></td><td>8-12 weeks</td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium</td><td>Hanlim Pharmaceutical (Korea)</td><td>AHN901</td><td>Insurance code:645301220</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Merck</td><td>8.08616.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td><td>Molecular Probes</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127 20% solution in DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Water Bath</td><td>Chang Shin Scientific</td><td>Model: C-108</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard Softwae Suite</td><td>IonOptix Ltd</td><td>Experimental Builder</td><td>Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes</td></tr><tr><td>Myocyte Calcium &amp;amp; Contractility Recording System</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circulating Water Bath</td><td>BS-Tech</td><td>BW2-8</td><td></td></tr><tr><td>Myocyte Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td>DIATPHOTO 200</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S Power</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence &amp;amp; Video Detection</td><td>IonOptix</td><td>MyoCam-S</td><td></td></tr><tr><td>CFA300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT400</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence &amp;amp; System Interface</td><td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td>Excitation Light Source</td><td>IonOptix</td><td>mSTEP</td><td></td></tr><tr><td>High intensity ARC Lamp Power supply</td><td>Cairn Reseach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter wheel controller</td><td>IonOptix</td><td>GB/MUS200</td><td></td></tr><tr><td>Digital Stimulator</td><td>Medical Systems Corportion</td><td>S-98 Mutimode</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Compositions of Experimental Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 135</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentration (mmol) 3.5</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Concentration (mmol) 20</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71649</td><td>Concentration (mmol) 0.4</td></tr><tr><td>Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 120</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0.2</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentration (mmol) 29</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Concentration (mmol) 20</td></tr><tr><td>Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 141.4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 4</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>Concentration (mmol) 0.33</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 1.8&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentration (mmol) 1</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentration (mmol) 14.5</td></tr><tr><td>Collangenase Solution 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation Solution (30mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Concentration (mmol) 1.67 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentration (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td>Concentration (mmol) 0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0.05 mM</td></tr><tr><td>Collangenase Solution 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation Solution (20mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)</td><td></td><td></td><td>Concentration (mmol) 1.67 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentration (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0.05 mM</td></tr><tr><td>BSA solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation Solution (40mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Concentration (mmol) 400 mg</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 1mM</td></tr></tbody></table>

assessment of myofilament ca2+ sensitivity underlying cardiac excitation-contraction coupling

Herzinsuffizienz und Herzrhythmusstörungen sind die häufigsten Ursachen für Mortalität und Morbidität weltweit. Jedoch bleibt der Mechanismus der Pathogenese und myokardialen Funktionsstörung in dem erkrankten Herzen vollständig geklärt werden. Recent zwingenden Beweis zeigt , daß Änderungen in der myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit beeinflussen intrazellulärem Ca 2+ Homöostase und Ionenkanalaktivitäten in Kardiomyozyten, die wesentlichen Mechanismen , die für die kardialen Aktionspotentials und Kontraktion in gesunden und kranken Herzen. Tatsächlich Aktivitäten von Ionenkanälen und Transportern Herzaktionspotentiale zugrunde liegen (zB Na +, Ca 2+ und K + -Kanäle und der Na + -Ca 2+ Exchanger) und die intrazelluläre Ca 2+ Umgang mit Proteinen (z. B. Ryanodinrezeptoren und Ca 2+ -ATPase in Retikulum (SERCA2a) oder Phospholamban und seine Phosphorylierung) werden üblicherweise auf Evalu gemessenaßen die grundlegenden Mechanismen von Herz Erregung und Kontraktion (EG) Kupplung. Beide elektrischen Aktivitäten in der Membran und die intrazelluläre Ca 2+ Veränderungen sind die Triggersignale von EC - Kopplung, wohingegen myofilament die Funktionseinheit der Kontraktion und Entspannung, und myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit ist zwingend notwendig , bei der Umsetzung von Myofibrillen Leistung. Dennoch wenige Studien inkorporieren myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in die funktionelle Analyse des Myokards , wenn es im Mittelpunkt der Studie. Hier beschreiben wir ein Protokoll , das Sarkomerverkürzung / re-Verlängerung und der intrazellulären Ca 2+ Ebene mit Fura-2 AM (ratiometrisch Erkennung) und bewerten die Veränderungen von myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in Herzmuskelzellen aus Rattenherzen misst. Das Hauptziel ist , dass myofilament betonen Ca 2+ Empfindlichkeit sollte für mechanistische Analyse in Betracht EG Kupplung genommen werden. Umfassende Untersuchung von iauf den Kanälen, Ionentransporter, intrazellulärer Ca 2+ Handhabung und myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit , die myocyte Kontraktilität in gesunden und kranken Herzen zu Grunde liegen wird für die Gestaltung wirksamer Strategien der translationalen und therapeutischen Wert wertvolle Informationen liefern.

LV Myozyten werden aus normalen und hypertensiven Rattenherzen isoliert. Stabförmige Myozyten mit klaren Riefen (die Sarkomere) und stabile Kontraktionen in Reaktion auf Feldstimulation werden als die optimale Myozyten zu sein und sind für die Aufnahmen (2A) ausgewählt. In dem Beispiel in F ild 2A gezeigt ist , -beladene a Fura 02.00 LV Myozyten ist horizontal und die Blende der Kamera positioniert ist , so eingestellt, dass die Myozyten der größte Teil des Aufzeichnungsfelds und minimale Hintergrundbereich belegt ist enthalten. Im Aufzeichnungsfeld, passen Sie die Abmessungen des lila Box durch Klicken und Ziehen Sie dieses Feld auf dem Computerbildschirm (durch das Aufnahmeprogramm). Wenn die durchschnittliche Sarkomerlänge eine scharfe rote Spitze zeigt, starten Sie die Aufnahme (2A, unteres Bild). Sowohl Sarkomerlänge und intrazellulärer Ca 2+ transie<html> nts (Fura-2 - Verhältnisse) gleichzeitig aus den gleichen Myozyten (3A) aufgezeichnet. Die mittleren Spuren Sarkomerlänge und Ca 2+ Transienten werden in 3B gezeigt. Einzeln diastolischen / systolischen Sarkomers Längen Zeit Peak (PT) und Sarkomerverkürzung werden gemessen, um die Amplitude und die Dynamik von Myozyten Kontraktilität zu untersuchen. Zeit bis 50% Relaxation (TR 50) analysiert , um die Relaxation der Myozyten zu beurteilen. In ähnlicher Weise der diastolischen und systolischen Fura-2 - Verhältnisse (Ca 2+ Transienten), Zeit (PT) von Ca 2+ Transienten und Zeitkonstante von Ca 2+ vorübergehende Zerfall (tau) zu Peak werden analysiert , um myocyte Kontraktion und Entspannung (Tabelle beurteilen 1). In diesem Beispiel werden die Amplituden der Ca 2+ Transienten in LV Myozyten von einer hypertensiven Ratte moderat erhöht und Kontraktion moderat reduziert (3B und Tabelle 1). Inhalt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Darüber hinaus sind die Beziehungen zwischen dem Fura - 2 - Verhältnis und Sarkomerlänge (die myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit von LV Myozyten anzeigt) sind in beiden Schein und hypertensiven Ratten aufgetragen ( . 3C) , um die Fura-2 - Sarkomerlänge Trajektorie während der Entspannungsphase des Myozyten definiert ein quasi~~POS=TRUNC von Cytosol Ca 2+, Ca 2+ myofilament Bindung und Sarkomerlänge 14; daher wird die Entspannungsphase zwischen den beiden verglichenen Gruppen. die Rechtsverschiebung der Flugbahn in Myozyten aus der Gruppe hypertensive. Dementsprechend eine reduzierte myofilament Antwort auf Ca 2+ (3C) zeigt, die intrazelluläre Ca 2+ -Konzentration , die für Halb Relaxation (EC 50) erhöht wird (3C) , die sich auf myofilament Ca 2+ -desensitization in Hypertonie. Abbildung 1. Verfahren für die LV Myozyten von Rattenherzen zu isolieren. (A) Das System Langendorff - Perfusion verwendet , um die Isolationslösung in das Herz über die Aorta (kleines Bild, vergrößertes Bild des montierten Herz auf dem Perfusions - System) eine Kanüle eingeführt , um perfuse (B) i - iii. Das Herz nach der Verdauung mit Kollagenase - Lösung 1 und seziert LV Gewebe in einer Schale und Kolben (B) iv - vi:.. Muskelzellen - Suspension nach der Zugabe von Kollagenase - Lösung 2, Myozyten Pellet nach Zentrifugation und resuspendiert Myozyten - Pellet in Aufbewahrungslösung (B) vii: Inkubation inkubieren LV Myozyten in Fura 02.00 - haltige Isolationslösung (2 uM Fura 2 AM, 250 &amp; mgr; M Ca 2+ und mit 2 ul Poloxamer 407); Auswaschen, waschen LV Myozyten mit Isolationslösung mit 500 &amp; mgr; M Ca 2+; Lagerung, halten Fura-2 AM - geladen LV Myozyten infrische Isolationslösung , die 500 &amp; mgr; M Ca 2+. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54057/54057fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54057/54057fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54057/54057fig2.jpg" /> Abbildung 2. Messung der Sarkomerverkürzung und der Fura-2 - Ratio (indikativ für die intrazelluläre Ca2 + Ebene). (A) Ein Diagramm Sarkomers, ein Bild einer Fura-2 -beladenen LV Myozyten und der gemittelte Sarkomerlänge (die rote peak) auf dem Computer angezeigt. In der unteren Platte, ist die schwarze Linie die durchschnittliche jeder horizontalen Pixelzeile innerhalb der violetten Bereich von Interesse. Die blaue Linie ist die gleichen Daten an jedem Ende auf Null gesetzt. Die rote Linie ist die schnelle Fourier-Transformation (FFT) Leistungsspektrum, das die Anzahl der Signale die FFT repräsentiert hat berechnet. Eine scharfe peak bedeutet eine saubere Sarkomers Aufnahme. (B) Die gleichzeitige Aufnahmen von Sarkomerlänge und der Fura -2 - Verhältnis in Reaktion auf Feldstimulation (2 Hz). (C) Phase-Ebene Grundstück des Verhältnisses Fura 2 gegen Sarkomerlänge des gleichen LV myocyte (beachten Sie, dass sowohl die tatsächliche Länge / Fura 2-Verhältnis und Deltaänderungen dieser Parameter analysiert werden). EC 50 (Fura 2 - Verhältnis bei 50% Entspannung, Kreis durch einen Pfeil) ist der qualitativen Vergleich von myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit zwischen den Gruppen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54057/54057fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54057/54057fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54057/54057fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse der Analyse von LV myocyte Kontraktion in der Sham und hypertensiven Ratten. (A) Raw Spuren von Sarkomers shortening und Fura - 2 Verhältnismessung in LV Myozyten von Schein und hypertensiven Ratten (B) Durchschnittliche Spuren von Sarkomerlänge und Fura -. 2 Signale. 2 - Verhältnis vs. Sarkomerlänge (sowohl die tatsächliche Länge und Fura - - 2 - Verhältnis und delta Änderungen dieser Parameter) in den beiden Gruppen Parameter in den gemittelten Spuren analysiert werden in Tabelle 1 (C) Phase Lebene Plots der Fura gezeigten . Die Trajektorie Schleife wird nach rechts verschoben und 50 EC neigt in Hypertension , höher zu sein, myofilament Ca 2+ Desensibilisierung hindeutet. PT, Zeit (sec) zu Peak; Tau, Zeitkonstante von Ca 2+ vorübergehende Zerfall (sec) (erhalten durch den Rückgang Phase des Fura - Fitting - 2 - Verhältnis mit einer Exponentialfunktion) .TR 50: Zeit bis 50% Relaxation (sec). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54057/54057eq1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54057/54057fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54057/54057fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen</a>dieser Figur. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Parameter </td><td> Schein </td><td> Hypertonie </td></tr><tr><td rowspan="5"> Intrazellulärem Ca 2+ </td><td> Diastolischen Ca 2+ </td><td> 1,189 </td><td> 1,124 </td></tr><tr><td> Der systolische Ca 2+ </td><td> 1,71 </td><td> 1,691 </td></tr><tr><td> Amplitude (Δ-Verhältnis) </td><td> 0,521 </td><td> 0,567 </td></tr><tr><td> Time to Peak (PT, s) </td><td> 0,021 </td><td> 0,031 </td></tr><tr><td> Tau (s) </td><td> 0,079 </td><td> 0,076 </td></tr><tr><td rowspan="7"> Sarkomers </td><td> Der diastolische </td><td rowspan="2"> 1,758 </td><td rowspan="2"> 1,78 </td></tr><tr><td> Sarkomerlänge (um) </td></tr><tr><td> Sarkomers </td><td rowspan="2"> 0,122 </td><td rowspan="2"> 0,115 </td></tr><tr><td> Kürzung (16; Länge, mm) </td></tr><tr><td> Time to Peak (PT, s) </td><td> 0,064 </td><td> 0,055 </td></tr><tr><td> Time to 50% </td><td rowspan="2"> 0,032 </td><td rowspan="2"> 0,03 </td></tr><tr><td> Entspannung (TR 50, s) </td></tr><tr><td> EC50 </td><td> [Ca 2+] i (Fura-2 - Verhältnis) 50% Sarkomers relengthening </td><td> 0,2382 </td><td> 0,3224 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Analyse der Fura - 2 - Verhältnis (intrazelluläre Ca2 +) und Sarkomerlänge Messungen.

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling at JoVE.com

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Beurteilung der myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Empfindlichkeit Basiswert Cardiac elektromechanischen Kopplung

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

assessment-myofilament-ca2-sensitivity-underlying-cardiac-excitation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

9.4K Aufrufe.  Seoul National University College of Medicine. This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts. 

Serie: Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and geometric&#160;deformation. Our understanding of the internal relationships between these events has been limited because we can neither &#39;see&#39; inside the muscle nor precisely track the spatio-temporal nature of excitation-contraction dynamics. To resolve these problems, we have constructed a device that combines a suite of imaging modalities. Specifically, it integrates a brightfield microscope to measure local changes of sarcomere length and tissue strain, a fluorescence microscope to visualize the Ca2+ transient, and an optical coherence tomograph to capture the tissue&#39;s geometric&#160;changes throughout the time-course of a cardiac cycle. We present here the imaging infrastructure and associated data collection framework. Data are collected from isolated rod-like tissue structures known as trabeculae carneae. In our instrument, a pair of position-controlled platinum hooks hold each end of an ex vivo muscle sample while it is continuously superfused with nutrient-rich saline solution. The hooks are under independent control, permitting real-time control of muscle length and force. Lengthwise translation enables the piecewise scanning of the sample, overcoming limitations associated with the relative size of the microscope imaging window (540 &#181;m by 540 &#181;m) and the length of a typical trabecula (&#62;2000 &#181;m). Platinum electrodes at either end of the muscle chamber stimulate the trabecula at a user-defined rate. We exploit the stimulation signal as a trigger for synchronizing the data from each imaging window to reconstruct the entire sample twitching under steady-state conditions. Applying image-processing techniques to these brightfield imaging data provides tissue displacement and sarcomere length maps. Such a collection of data, when incorporated into an experiment-modeling pipeline, will provide a deeper understanding of muscle contractile homogeneity and heterogeneity in physiology and pathophysiology.

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

This protocol presents a collection of sarcomere, calcium, and macroscopic geometric&#160;data from an actively contracting cardiac trabecula ex vivo. These simultaneous measurements are made possible by the integration of three imaging modalities.

Simultane Hellfeld-, Fluoreszenz- und optische Kohärenztomographische Bildgebung kontrahierender Herztrabekel Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

Forschung

Biotechnik

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Biologie

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

In Vitro-Bewertung der Herzfunktion mit gehäuteten Kardiomyozyten

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Medizin

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Kontraktilität Messungen auf isolierte Papillarmuskeln für die Untersuchung von Herz Inotropie bei Mäusen

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury and/or remodeling. One approach for assessing these functional alterations utilizes unloaded shortening and Ca2+ transient analyses in primary adult cardiac myocytes. For this approach, adult myocytes are isolated by collagenase digestion, made Ca2+ tolerant, and then adhered to laminin-coated coverslips, followed by electrical pacing in serum-free media. The general protocol utilizes adult rat cardiac myocytes but can be readily adjusted for primary myocytes from other species. Functional alterations in myocytes from injured hearts can be compared to sham myocytes and/or to in vitro therapeutic treatments. The methodology includes the essential elements needed for myocyte pacing, along with the cell chamber and platform components. The detailed protocol for this approach incorporates the steps for measuring unloaded shortening by sarcomere length detection and cellular Ca2+ transients measured with the ratiometric indicator Fura-2 AM, as well as for raw data analysis.

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

A set of protocols are presented that describe the measurement of contractile function via sarcomere length detection along with calcium (Ca2+) transient measurement in isolated rat myocytes. The application of this approach for studies in animal models of heart failure is also included.

Analyse der kardialen kontraktilen Dysfunktion und Ca2+ Transienten in Nagetiermyozyten

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Skelettmuskelzellen

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, including voltage-gated ion channels. This approach has been used primarily in heterologous expression systems to simultaneously measure membrane currents, the electrical manifestation of the channels&#39; activity, and fluorescence measurements, reporting local domain rearrangements. Functional site-directed fluorometry combines electrophysiology, molecular biology, chemistry, and fluorescence into a single wide-ranging technique that permits the study of real-time structural rearrangements and function through fluorescence and electrophysiology, respectively. Typically, this approach requires an engineered voltage-gated membrane channel that contains a cysteine that can be tested by a thiol-reactive fluorescent dye. Until recently, the thiol-reactive chemistry used for the site-directed fluorescent labeling of proteins was carried out exclusively in Xenopus oocytes and cell lines, restricting the scope of the approach to primary non-excitable cells. This report describes the applicability of functional site-directed fluorometry in adult skeletal muscle cells to study the early steps of excitation-contraction coupling, the process by which muscle fiber electrical depolarization is linked to the activation of muscle contraction. The present protocol describes the methodologies to design and transfect cysteine-engineered voltage-gated Ca2+ channels (CaV1.1) into muscle fibers of the flexor digitorum brevis of adult mice using in vivo electroporation and the subsequent steps required for functional site-directed fluorometry measurements. This approach can be adapted to study other ion channels and proteins. The use of functional site-directed fluorometry of mammalian muscle is particularly relevant to studying basic mechanisms of excitability.

Autor im Rampenlicht: Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur  

Functional site-directed fluorometry is a method to study protein domain motions in real time. Modification of this technique for its application in native cells now allows the detection and tracking of single voltage-sensor motions from voltage-gated Ca2+ channels in murine isolated skeletal muscle fibers.

Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

Beurteilung der myofilament Ca

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Simultane Hellfeld-, Fluoreszenz- und optische Kohärenztomographische Bildgebung kontrahierender Herztrabekel Ex Vivo

Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

In Vitro-Bewertung der Herzfunktion mit gehäuteten Kardiomyozyten

Kontraktilität Messungen auf isolierte Papillarmuskeln für die Untersuchung von Herz Inotropie bei Mäusen

Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca

Analyse der kardialen kontraktilen Dysfunktion und Ca²⁺ Transienten in Nagetiermyozyten

Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur

Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur

Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur