Diese Arbeit wurde durch das Department of Defense Breast Cancer Research Program unter Verleihungsnummer (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324 und dem Integrated Imaging-Programm unterstützt.

Alle beschriebenen Verfahren müssen mit den Richtlinien und Vorschriften für den Einsatz von Wirbeltieren, einschließlich der vorherigen Zustimmung des Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care und Use Committee entsprechend durchgeführt werden. 1. Erstellen von fluoreszenzmarkierten Tumoren und Tumor-assoziierten Makrophagen <ol><li> Generieren Sie fluoreszenzmarkierten Tumorzellen durch die spontane, autochthonen, gentechnisch veränderte Maus Brustkrebsmodell Kreuzung , wo die Maus - Mammatumorvirus long terminal repeat den Polyoma Mitte - T - Antigen (MMTV-PyMT) mit transgenen Mäusen mit fluoreszierenden Reporter - Laufwerke [dh Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), verbesserte cyan fluoreszierende Protein (ECFP) oder Dendra2] 8,9. </li><li> Fluoreszenz Etikett Makrophagen in PyMT Tiere mit fluoreszenzTumorZellen gekennzeichnet durch mit myeloid- und Makrophagen spezifischen fluoreszierenden Reporter gentechnisch veränderter Mausmodelle Kreuzung [dh MacGreen 15 oder MacBlue Mäuse CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16]. </li><li> Alternativ erzeugen fluoreszenz Tumoren durch orthotope Transplantation von fluoreszenzmarkierten PyMT Tumorzellen (syngene), humane Brustkrebszelllinien oder primären humanen Patienten stammt Tumoren (Xenotransplantate) 11,17 bezeichnet. <ol><li> Implantat fluoreszenz PyMT Tumorzellen in syngene Mäuse , die mit fluoreszierendem Protein-markiertem myeloischen Zellen markiert Tiere mit fluoreszierend markierten Tumorzellen und myeloiden Zellen 13 zu erzeugen. </li></ol></li><li> Injizieren von 100 &amp; mgr; l von 10 mg / kg fluoreszierendes 70 kDa Dextran durch intravenöse (iv) Schwanzvene in severe combined immunodeficiency (SCID) -Mäusen mit Xenotransplantattumoren von menschlichen Zelllinien oder Patienten stammenden primären Tumoren fluoreszenz Etikett Makrophagen 2 h vor Beginn von intravital Bildgebung. </li></ol> 2. Mikroskopaufbau und Imaging Vorbereitung Hinweis: Dieses Verfahren beschreibt den Aufbaufür intravital Bildgebung auf einem Multi Mikroskop 8. <ol><li> Schalten Sie alle Mikroskop und Laser-Komponenten, einschließlich Zwei-Photonen-Laser und Detektoren. </li><li> Schalten Sie den Heizkasten auf 30 ° C auf die Bühne Vorwärmung. Dieser Schritt ist entscheidend für die physiologische Temperatur des Tieres gehalten wird. </li><li> Für den Einsatz auf einem inversen Mikroskop Ort der maßgefertigte Tischeinsatz auf dem Mikroskoptisch. Der Brauch Einsatz ist ein Blatt von 1/8 &quot;dicken Aluminium gefräst in der Tischeinlage Raum zu passen und mit einem Durchmesser von 1&quot; Durchgangsloch in der Mitte für die Bildgebung. <ol><li> Wischen Sie den Mikroskoptisch und Tischeinsatz mit 70% Ethanol und Luft trocknen lassen. </li><li> Platzieren Sie einen großen Tropfen Wasser auf dem 20X, 1,05 NA Mikroskopobjektiv optischen Kontakt mit dem Deckglas zu halten. </li><li> Platz Deckglas (# 1.5 Dicke) über den Imaging-Port auf dem Mikroskoptisch Einsatz. Sichern Sie an Ort und Stelle mit Labor Band. </li><li> Verwenden Sie einen Locher eine 2 cm x 2 cm großes Loch zu stanzenin einer flexiblen Gummiauflage und legen Sie die Gummiauflage auf dem Mikroskoptisch mit dem Loch in der Unterlage mit dem Loch in der benutzerdefinierten Stufe Einsatz ausgerichtet ist. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Schwanzvenenkatheter und Reagenzien für die Injektion während der Bildgebung <ol><li> Schneiden Sie ein 30 cm Länge von Polyethylen (PE) Rohr. </li><li> Mit einer Pinzette, bewegen Sie die Metallnadel einer 31 G-Nadel hin und her, bis er aus der Kunststoff-Fittings bricht. </li><li> Mit einer Pinzette, legen Sie das stumpfe Ende der abgelösten Nadel in den PE-Schlauch. </li><li> Legen Sie eine 31 G-Nadel in das andere Ende des PE-Schlauch. </li><li> Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und legen Sie sie in den 31 G-Nadel und spülen Sie alle Luft aus dem Schlauch und Nadel mit PBS. PBS für die Aufrechterhaltung der Hydratation verwendet wird und Blut Osmolarität 9,18 jedoch isotonischer Kochsalzlösung kann auch verwendet werden. </li><li> Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit 200 ul 3 mg / kg 155 kDa Dextran-Tetramethylrhodamin (TMR) Oder Quantenpunkte für die vaskuläre Kennzeichnung. </li><li> Bereiten andere injizierbare Proteine ​​wie beispielsweise eine 165 Aminosäure - Isoform des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors A (VEGFA 165) in einer 1 cc Spritze und auf Eis stellen . Injizieren von 0,2 mg / kg VEGFA 165 19 bei einer Konzentration von 0,05 mg / ml. </li></ol> 4. Einsetzen des Verweil Schwanz Venenkatheter <ol><li> Legen Sie das Tier unter Narkose unter Verwendung eines Induktionskammer mit 5% Isofluran mit O 2 als Trägergas. </li><li> Übertragen Sie die Maus auf die chirurgische Plattform, sobald es vollständig betäubt und reagiert nicht auf einer Zehe Prise. </li><li> Offene Isoflurananästhesie Linie auf die chirurgische Plattform, schließen Sie die Anästhesie Leitung an die Induktionskammer und legen Sie den Nasenkegel über das Tier Schnauze. Reduzieren Sie die Isofluran von 5% auf 2,5%. </li><li> Anwenden Augensalbe für die Augen der Maus Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern. </li><li> Erhitzen Sie das Tier unter der Heizlampefür weitere 2 min Zirkulation in den Schwanz zu erhöhen, wie verlangsamt Zirkulation mit tiefer Narkose. </li><li> Sterilisieren Sie die Maus Schwanzvene mit 70% Ethanol. </li><li> Legen Sie die Spitze des 31 G-Nadel aus dem in Abschnitt 3 in die seitliche Schwanzvene des Tieres konstruiert Katheter und drücken Sie die Nadel in 2-3 mm. </li><li> Ziehen Sie die Spritze Blut zu sehen, zurück, um den Katheter gewährleistet in die Schwanzvene gelegt wird. </li><li> Verwenden, um eine 1 cm Länge lab Band über der Nadel angeordnet, um die Nadel an Ort und Stelle parallel zu der Vene entlang der Länge des Schwanzes zu halten. </li></ol> 5. Hautlappen chirurgischen Eingriff Expose die Brusttumor <ol><li> Mit dem Tier auf der chirurgischen Plattform Tupfer des Tumors und der ventralen Oberfläche mit 70% Ethanol. Anmerkung: Wie beschrieben, ist dieses Verfahren nicht vollständig aseptischen Bedingungen durchgeführt. Für lange Imaging-Sitzungen, wo Infektion ein Störfaktor werden kann, wird empfohlen, eine aseptische Technik zu verwenden. </li><li> Mit sterile Zange, heben Sie die Bauchhaut und mit einer sterilen Schere eine subkutane Schnitt entlang der ventralen Mittellinie ca. 1 cm Länge. Vermeiden Sie das Peritoneum während der Einschnitt Punktierung. </li><li> Vorsichtig schneiden das Bindegewebe der Brustdrüse und Tumor entfernt vom Peritoneum Anbringen der Brusttumor zu belichten. </li><li> Mit einer Schere und Pinzette vorsichtig entfernen und die Faszien und Fett von der freiliegenden Oberfläche des Tumors unter Beibehaltung der Integrität der Gefäßversorgung des Tumors und die Minimierung von Blutungen wegschneiden. Dieser Schritt ist entscheidend, um die Tumor-Architektur und Gefäßversorgung des Tumors zu halten. </li></ol> 6. Vorbereitung der Tiere für die Mikroskopie <ol><li> Übertragen Sie das Tier auf die vorgewärmten Abbildungsstufe mit dem auf dem Deckglas platziert ausgesetzt Tumor auf der Bühne Einsatz über das Mikroskopobjektiv für die Bildgebung. Achten Sie darauf, die Schwanzvene Katheter sanft mit dem Tier zu übertragen, um nicht die Nadel zu entfernen. </li><li> Platz the Anästhesie Bugspitze über die Schnauze des Tieres Anästhesie Satz auf 3% Isofluran aufrecht zu erhalten. </li><li> Positionieren Sie das Tier so, dass der Tumor in das Loch des Gummikissen ruht und in Kontakt mit dem Deckglas. </li><li> Verwenden Sie zwei Gummi-Pads, um sanft den Tumor in Position zu halten und fixieren Sie diese mit Labor Band an den Mikroskoptisch Bewegung während der Bildaufnahme zu reduzieren. </li><li> Füllen der Kammer aus dem Gummikissen mit PBS, das Gewebe zu halten hydratisiert und optischem Kontakt mit dem Deckglas erhalten. </li><li> Starten Sie das Tier die Überwachung der Vitalfunktionen mit einem Pulsoximeter Sonde. Bringen Sie einen Clip Sensor an den Oberschenkel des Tieres. Alternativ kann eine Manschette, die verwendet werden, um den Hals zu passen kann konfiguriert ist. </li><li> Legen Sie die Heizkasten über das Tier zu halten bei 30 ° C 20. </li><li> reduzieren Sie langsam das Niveau von Isofluran auf 0,5-1% Narkose zu halten und den Blutfluss aufrechtzuerhalten. </li></ol> 7. Bildaufnahme und Injektion von Fluorescent Farbstoffe und injizierbare Proteine <ol><li> Verwendung des Mikroskop-Okular Fokus auf den fluoreszierenden Tumorzellen auf der Oberfläche des Tumors. </li><li> Wählen Sie einen Bereich von Interesse durch Bereiche mit fließenden Blutgefäße zu finden. Die Auswahl eines Bereichs von Interesse mit fließenden Blutgefäße ist entscheidend für die Tumorgefäße zu bewerten. </li><li> Sobald eine Region von Interesse ausgewählt wurde Schalten Sie das Mikroskop in Multibildgebungsmodus. </li><li> Den oberen und unteren Grenzen einer z-Serie. Stellen Sie die obere Grenze der z-Serie durch die Schärfeneinstellvorrichtung mit dem Ziel auf den gewünschten Startposition zu bewegen und auf die Z-Position &quot;Oben&quot; Taste. Bestimmen die Obergrenze der z-Reihe durch die Kollagenfaser-Netzwerk an der Oberfläche des Tumors in der Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) -Kanal Visualisierung und Beobachtung, wenn keine Zellen, aber nur Kollagenfasern sichtbar sind. <ol><li> Stellen Sie die Untergrenze der z-Reihe durch das Ziel auf den gewünschten Abbildungstiefe bewegt (typically 50-150 &amp; mgr; m) und dann auf die Z-Position &quot;Unten&quot; -Taste. </li><li> Stellen Sie die Schrittgröße um den gewünschten Wert in die Schrittgröße Feld eingeben. Bestimmen Schrittgröße basierend auf Überlegungen zur Auflösung und Aufnahmezeit (in der Regel 2 &amp; mgr; m für die hochauflösende 3D-Rekonstruktion verwendet und 5 um auf andere Weise). </li></ol></li><li> Stellen Sie den Zeitraffer-Intervall auf die Time-Lapse-Panel durch Umschalten und Eingabe der gewünschten Ablaufzeit in die Time-Lapse-Feld. Für eine optimale zeitliche Auflösung das Zeitintervall für die kontinuierliche Bildgebung auf 0 sec. Hinweis: Für lange Zeitraffer-Bildgebung ist es empfehlenswert, das Zeitintervall zwischen den Aufnahmen zu 10 Sekunden bis zum Ziel gesetzt, Tauchflüssigkeit aufzufüllen. </li><li> Nachdem die Parameter für die Abbildung bestimmt worden sind, injizieren langsam 155 kDa-Dextran-TMR. <ol><li> Entfernen Sie die Spritze mit PBS in die Schwanzvene Katheter und ersetzen mit der Spritze, die 155 kDa Dextran-TMR kümmert sich keine Blasen in den li vorstellenne. </li><li> injizieren Sie langsam 155 kDa Dextran-TMR in die Maus, mit einem maximalen Volumen von 200 &amp; mgr; l, und ersetzen Sie die Spritze mit der Spritze PBS enthält. Kritischste Schritt: Führen Sie die Injektion langsam und Vorkehrungen treffen, um zu vermeiden Lösung außerhalb der Vene zu bekommen. </li></ol></li><li> Starten Sie den Erwerb der Z-Stack-Zeitraffer-Bildgebung durch einen Klick auf den Z-Stapel und Zeitraffer-Tasten, sie zu drücken und dann auf die Aufnahmetaste klicken. </li><li> Wenn andere fluoreszierende Dextrane, dh 10 kDa - Dextran-Fluorescein - Isothiocyanat (FITC), oder Proteine, dh VEGFA 165 haben im Voraus vorbereitet worden ist , injizieren sie nach dem Beginn der Bildaufnahme für at = 0 min Start. <ol><li> Entfernen Sie die Spritze mit PBS in die Schwanzvene Katheter und ersetzen mit der Spritze , die 10 kDa Dextran-FITC oder VEGFA 165 kümmert sich keine Blasen in die Leitung einzuführen. </li><li> injizieren Sie langsam injizierbaren in die Maus über die Schwanzvene Katheterund ersetzen Sie die Spritze mit einer Spritze mit PBS. </li></ol></li><li> Alle 30-45 min, injizieren langsam 50 ul PBS oder Kochsalzlösung Hydratation des Tieres zu halten. </li></ol> 8. Euthanasie <ol><li> Bei Beendigung der Bildaufnahme, euthanize das Tier. <ol><li> Erhöhen Sie die Isofluran bis 5%. </li><li> Halten Sie das Tier unter 5% Isofluran bis 30 Sekunden, nachdem er aufhört, das Tier von der Bühne zu atmen und zu entfernen. </li><li> Führen Sie Zervikaldislokation vollständige Euthanasie zu gewährleisten. </li></ol></li></ol> 9. Bildverarbeitung <ol><li> Erwerben Sie Bilder in 16-Bit-TIFF-Dateien für jeden einzelnen Kanal zu jedem Zeitpunkt und sparen nacheinander. </li><li> Führen Trennung der spektralen Überlappung (dh GFP und GFP), die Abschaffung der xy Drift und die Erzeugung von Filmen von Zeitraffer-Sequenzen unter Verwendung von etablierten Verfahren in ImageJ 9. Führen Sie 3D - Oberflächenrekonstruktionen von hochauflösenden Bildern 13. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Zelluläre Interaktionen, die sich spontan in der Tumor-Mikroumgebung auftreten können, auf Veränderungen in der Tumorzellbeweglichkeit und intravasation führen. Hochauflösende intravital Bildgebung von lebenden Tumorgewebe ermöglicht die Visualisierung von mehrzelligen Dynamik , die hochtransienten 10,13,24 sein kann. End-Punkt in - vivo - Tests oder Zeitraffer-Bilder mit diskreten Zeitpunkten erworben wesentlichen Informationen über die molekularen Mechanismen von Prozessen in der Tumor - Mikroumgebung zur Verfügung stellen kann. Intravital Imaging - Studien wurden zu untersuchen Prozesse im Tumormikromilieu verwendet , die über mehrere Tage stattfinden, die Generierung neuer Erkenntnisse auf die Angiogenese, Tumorzellmigration und das Ansprechen auf medikamentöse Behandlung 25-30. Allerdings könnten diese Assays nicht die Kinetik der transiente Ereignisse in der Tumor - Mikroumgebung erfassen aufgrund der Zeitskala der Prozesse 7,31 untersucht. mehrere transiente Ereignisse von konstanten Prozesse Erkennungsmerkmal ist eine bedeutende AnzeigeVorteil der Intravitalmikroskopie. Die intravitalAbbildungsTechnik in diesem Protokoll beschrieben ermöglicht die direkte Sichtbarmachung zellulärer Dynamik im Tumormikroumgebung durch Fluoreszenzmarkierung von mehreren Zelllinien und Strukturen. Multiphotonenmikroskopie ermöglicht eine größere Tiefe der Bildgebung über Einzelphotonen konfokaler Mikroskopie mit einer Tiefe von 300 um routinemäßig 24 durchgeführt. Erwerb von Z-Stapeln von 50 bis 100 &amp; mgr; m mit 2 &amp; mgr; m Schritten ist von ausreichend hoher Auflösung 3D - Rekonstruktion von zellulären Interaktionen zu erzeugen, einschließlich Vorsprünge , die Zellen machen , wie sie aufeinander zu 13 und Gefäßstrukturen in der Tumor - Mikroumgebung erweitern. Filme und 3D-Rekonstruktionen von Zeitrafferbildsequenzen ermöglichen die Quantifizierung der zellulären Motilität (Geschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit), und Veränderungen in der Fluoreszenzsignalintensität von injizierbaren Farbstoffen, Gefäßdurchlässigkeit. Um sp zu erfassenontaneous zelluläre Ereignisse die Anzahl der einzelnen Bilder in einer einzigen Sequenz erfasst muss für eine Rate der Bildaufnahme zu ermöglichen, optimiert werden, dass die Kinetik des Ereignisses erfasst, aber das gilt auch für eine ausreichende physische Raum, um die Wahrscheinlichkeit der Erfassung jedes einzelnen Ereignisses zu erhöhen während eine einzige Zeitraffersequenz. Die räumlichen Bildparameter, die berücksichtigt werden müssen, gehören; die Anzahl der Scheiben in einer Z-Stapel, die Anzahl der Sichtfelder mit Z-Stapel erfaßt und der axiale Abstand zwischen den einzelnen Scheiben in einer Z-Stapel. Daher Einstellung dieser Parameter vor der Bildaufnahme beginnt, ist ein wichtiger Schritt im Protokoll. Mit dem Multi Mikroskop, den Erwerb von 30 Frames (500 &amp; mgr; m × 500 &amp; mgr; m) in einer z-Serie beträgt ca. 60 sec. Da die Dauer von intravasation beobachteten Tumorzelle in der Größenordnung von Minuten 13 sein kann, mehrere Z-Stacks für die 3D - Rekonstruktion von intravasation Erfassung wurde die Akquisitionszeit eines Z-Stack begrenzt to 60 Sek. eine einzelne Sichtfeld daher mit bis zu 30 Scheiben in eine Z-Stapel wurde erworben. Darüber hinaus wurde seit 3D-Rekonstruktion von Zellen der axialen Stufe zwischen Z-Scheiben gewünscht, wurde auf 2 &amp; mgr; m eingestellt. Dies ermöglicht eine ausreichende Informationen über Zellvolumina für die 3D-Rekonstruktion zu ermöglichen. Diese Parameter müssen für jedes Mikroskop und Bildbearbeitungssoftware basierend auf der Kinetik der Live-Veranstaltungen genutzt optimiert werden untersucht. Die Modifizierung des Gummikissens auf dem Mikroskoptisch und die Schwanzvene iv Katheter haben sowohl für eine signifikante Erhöhung der Abbildungszeit erlaubt. Die Gummiunterlage bildet eine gut aufrechterhalten Hydratation des Tumors zu ermöglichen, während XY Drift auf dem Deckglas minimieren. Die Kombination der Heizkammer mit der Verabreichung von PBS hält Hydratation und physiologischer Temperatur von Tieren. Diese Bedingungen kombiniert Gefäßperfusion halten und die Durchblutung für erweiterte Bildgebung von zellulären Ereignissen ermöglichen an den Tumor vasculature einschließlich vaskuläre Permeabilität und Tumorzelle intravasation. Eine Einschränkung dieser Technik ist die Anzahl der fluoreszierenden Markierungen, die verwendet werden können, Zellen in der Tumor-Mikroumgebung zu visualisieren. Transgene Mäuse zu erzeugen mit zusätzlichen Zelltypen (dh, Endothelzellen, Fibroblasten oder Perizyten) fluoreszierendes Protein enthält , kann schwierig und zeitraubend sein. Doch künftig mögliche Anwendungen könnte eine Kombination aus fluoreszierenden Protein Markierung von Stroma-Zelltypen mit implantierten Tumorzellen und 70 kDa Dextran Markierung von Makrophagen zu nutzen. Durch die Verwendung einer Kombination dieser Markierungsstrategien und der Kreuzung von transgenen Mäusen neue Kombinationen von zellulären Etiketten erzeugt werden, um zelluläre Bewegung und Ereignisse in der Tumor-Mikroumgebung zu bewerten. Anders als Endpunkt Experimente basieren auf Immunfluoreszenzanfärbung ermöglicht hochauflösende Intravitalmikroskopie die Visualisierung von spontanen und transienteEreignisse im Tumormikromilieu. Die intravital Bildgebung hier beschriebene Verfahren zeigt neue Ereignisse und zellulären Interaktionen im Tumormikromilieu, die nicht von statischen Bildern entschlüsselt werden kann. Mit neuartigen Informationen zu den interagierenden Zellen Arten oder Prozessen, und die Kinetik dieser Ereignisse können Hypothesen generiert werden, um die Signalwege zu untersuchen, die diese Interaktionen fahren.

Verbreitung von Tumorzellen von der primären Mammatumor wurde nicht nur Tumorzellen gezeigt einzubeziehen, aber Host stromalen Zellen, einschließlich Makrophagen und Endothelzellen. Darüber hinaus ist Tumorgefäße mit einer erhöhten Permeabilität 1 abnormal. Somit bestimmen, wie Tumorzellen, Makrophagen und endothelialen Zellen in Wechselwirkung treten Gefäßpermeabilität und Tumorzell intravasation in dem primären Tumor-Mikroumgebung zu vermitteln, ist wichtig für das Verständnis der Metastasierung. die Kinetik der vaskulären Permeabilität, Tumorzelle intravasation und dem darunterliegenden Signalisierungsmechanismus von mehrzelligen Interaktionen im Tumormikroumgebung zu verstehen, können wichtige Informationen bei der Entwicklung und Verabreichung von Antikrebstherapien bereitzustellen. Die primäre Mittel der Tumor vaskuläre Permeabilität in vivo zu studieren die Messung von extravaskulärem Farbstoffe wie Evans - Blau 2, hochmolekulare Dextrane (155 kDa) wurde3 und Fluorophor oder Radiotracer-konjugierte Proteine ​​(einschließlich Albumin) 4 in festen Zeitpunkten nach der Injektion des Farbstoffes. Fortschritte in der Mikroskopie, Tiermodelle und Fluoreszenzfarbstoffe haben die Visualisierung von zellulären Prozessen und vaskuläre Permeabilität in lebenden Tieren durch Intravitalmikroskopie 5 aktiviert. Live - Tierbildgebung mit dem Erwerb von statischen Bildern oder kurzen Zeitraffer-Sequenzen über mehrere Zeitpunkte nicht für das Verständnis von dynamischen Ereignissen im Tumormikromilieu 6,7 erlauben. Tatsächlich statische Bildaufnahme über den Verlauf von 24 Stunden gezeigt , dass Tumorgefäße undicht jedoch die Dynamik der vaskulären Permeabilität wurde 6 nicht beobachtet. So fängt längere kontinuierliche Zeitraffer-Bildgebung bis zu 12 Stunden, um die Kinetik der dynamischen Ereignissen im Tumormikromilieu. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von erweiterten Zeitraffer multiphotauf Intravitalmikroskopie dynamische vielzelligen Ereignisse in der Tumor-Mikroumgebung zu studieren. Mehrere Zelltypen in der Tumor-Mikroumgebung mit injizierbaren Farbstoffen markiert oder mit transgenen Tieren exprimieren fluoreszierende Proteine ​​verwenden. einen Schwanzvenenkatheter Gefäß Farbstoffe oder Proteine ​​verwendet, kann nach dem Start der Bildgebung injiziert werden kinetischen Daten von mehrzelligen Ereignisse im Tumormikromilieu zu erwerben. Für Live-Cell-Imaging wird die Brusttumor durch die chirurgische Vorbereitung einer Hautlappen ausgesetzt. Bilder werden für bis zu 12 Stunden erworben 8 eine Multiphotonen - Mikroskop ausgestattet mit mehreren Photovervielfacherröhren (PMT) Detektoren. Durch die Verwendung von geeigneten Filtern ermöglicht eine Subtraktion Algorithmus 4 PMT Detektoren 5 Fluoreszenzsignale im Tumormikromilieu zu erwerben gleichzeitig 9. Hochauflösende Multiintravitalmikroskopie erfasst einzelne Zelle auflösende Bildgebung von Tumor-Stroma-Interaktionen im Tumormikromilieu, zu einem besseren führenden uERSTÄNDIGUNG der vaskulären Permeabilität und Tumorzell intravasation 10-13. Insbesondere offenbart verlängerte intravitalAbbildungs ​​stark lokalisierten, transient Gefäßpermeabilität Ereignisse , die selektiv an den Stellen der Interaktion zwischen einer Tumorzelle, einem Makrophagen und einer Endothelzelle (definiert als der Tumor - Mikroumgebung der Metastasierung, TMEM 14) 13 auftreten. Weiterhin tritt Tumorzelle intravasation nur an TMEM und räumlich und zeitlich mit Gefäßpermeabilität 13 korreliert. Einzelne Zell Auflösung der Dynamik dieser Ereignisse wurde möglich durch die Verwendung erweiterter Zeitraffer-Multiphotonen-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Zellen im Tumormikromilieu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="637">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate</td>
			<td style="width:95px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">T1287</td>
			<td style="width:167px;">reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">70 kDa dextran-Texas Red</td>
			<td style="width:95px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">D-1830</td>
			<td>reconstitute at 10 mg/mL in 1 X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate</td>
			<td style="width:95px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:128px;">FD10S</td>
			<td>reconstitute at 20 mg/mL in 1 X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots</td>
			<td style="width:95px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">Q21561MP</td>
			<td>Dilute 25 uL in 175 uL of 1 X PBS for injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">MMTV-PyMT mice</td>
			<td style="width:95px;">Jackson Laboratory</td>
			<td align="right" style="width:128px;">2374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)</td>
			<td style="width:95px;">Jackson Laboratory</td>
			<td align="right" style="width:128px;">26051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Csf1r-EGFP mice</td>
			<td style="width:95px;">Jackson Laboratory</td>
			<td align="right" style="width:128px;">18549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">1 x PBS</td>
			<td style="width:95px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Isoethesia (isoflurane)</td>
			<td style="width:95px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td align="right" style="width:128px;">50033</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Oxygen</td>
			<td style="width:95px;">AirTech</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">1 mL syringe, tuberculin slip tip</td>
			<td style="width:95px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:128px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">30G x 1 (0.3 mm X 25 mm) needle</td>
			<td style="width:95px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:128px;">305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:248px;">Polyethylene micro medical tubing&#160;</td>
			<td style="width:95px;">Scientific Commodities Inc</td>
			<td style="width:128px;">BB31695-PE/1</td>
			<td>0.28 mm I.D. X 0.64 mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Microscope coverglass</td>
			<td style="width:95px;">Corning</td>
			<td style="width:128px;">2980-225</td>
			<td>thickness 1.5, 22 X 50 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">MouseOx oximeter, software and sensors</td>
			<td style="width:95px;">STARR Life Sciences</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">Laboratory tape</td>
			<td style="width:95px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:128px;">159015R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">soft rubber pad</td>
			<td style="width:95px;">McMaster-Carr</td>
			<td>8514K62</td>
			<td>Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16&#8221; Thick, 12&#34; x 12&#34;, 40 Oo Durometer, Plain Back</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">hard rubber pad</td>
			<td style="width:95px;">McMaster-Carr</td>
			<td>8568K615</td>
			<td>High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4&#34; Thick, 12&#34; X 12&#34;, 50A Durometer,</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Microscope</td>
			<td style="width:95px;">Olympus</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td>The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20x 1.05NA objective lens.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:248px;">7-Punch set</td>
			<td style="width:95px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:128px;">3429A12</td>
			<td>, 1/4&#34; to 1&#34; Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch,&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

Erweiterte Zeitraffer-Mikroskopie ermöglicht einzelne intravital Zellauflösende Bildgebung von mehrzelligen Prozesse im Tumormikromilieu. Durch fluoreszenz Markierung von Tumorzellen, Makrophagen, den vaskulären Raum und Visualisieren des Kollagenfasernetzwerk der zweiten Harmonischen Erzeugungssignal, mehrere Kompartimente in der Tumor-Mikroumgebung verwendet werden gleichzeitig während der Bildgebung verfolgt. Tumorzellen mit fluoreszierenden Proteinen markiert können in transgenen Mäusen erzeugt werden , wie in MMTV-PyMT-Dendra2 Mäusen mit Brusttumorzellen , markiert mit Dendra2 (1A) durchgeführt worden ist . Durch die Kreuzung dieser transgenen Mäuse mit CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP Mäuse, die Makrophagen , markiert mit ECFP, beide Tumorzellen und Makrophagen haben , werden in den MMTV-PyMT Mäusen markiert. Mit dem Doppelmarkierungsstrategie von Tumorzellen und Makrophagen, die die direkte Interaktion der beiden Zelltypen können in Echtzeit (Figur 1A sichtbar gemacht werden). Zusätzlich mit GFP transduziert menschlichen Brustkrebszelllinien oder Patienten stammende Tumorzellen kann zur Markierung von Tumorzellen verwendet werden. Makrophagen können etikettierenden fluoreszierend markiertes Dextran unter Verwendung von 70 kDa , die in den phagozytierenden Makrophagen akkumuliert (1B). Diese Methoden haben die Untersuchung von dynamischen vielzelligen Ereignisse wie Tumorzellen-Makrophagen-streaming Motilität, vaskulären Permeabilität und Tumorzell intravasation gefördert. Zu visualisieren Veränderungen in Tumorgefäßdurchlässigkeit, ein fluoreszierend markiertes Dextran mit hohem Molekulargewicht (155 kDa oder höher empfohlen 9,13,21,22) oder Quantenpunkten verwendet , um den vaskulären Raum zu etikettieren (Abbildung 1). 155 kDa Dextran oder Quantenpunkte sind groß genug , dass sie nicht ohne weiteres durch die interendothelialen Räume 23 diffundieren. Kontinuierliche hochauflösende Bildgebung erleichtert die Erfassung von vaskulären Permeabilität Ereignisse und dieQuantifizierung der Kinetik von Dextran Extravasation und Clearance bei TMEM (Abbildung 2 und Film 1). Da der Gefäßraum leicht durch das 155 kDa - Dextran bei der Einleitung der Zeitraffersequenz (wie in 0 &#39;von Figur 2) extravasalen fluoreszierenden Dextran definiert ist , kann in jedem Rahmen des Zeitablaufsequenz quantifiziert werden, Fig . 2 und Film 1 zeigen die Extravasation von 155 kDa Dextran-TMR durch eine Schwanzvene Katheter in ein MMTV-PyMT-Dendra2 injiziert; CSF1R-GFP - Maus. Dendra2-markierten Tumorzellen (grün) und GFP-markierten Makrophagen (Cyan) verwendet TMEM in lebenden Tieren zu identifizieren. Der TMEM Struktur an der Stelle der vaskulären Permeabilität in einem weißen Feld skizziert. Der Gefäßraum ist mit 155 kDa Dextran-TMR (rot) markiert sichtbar zu machen Gefäße und Extravasation von Gefäßinhalte bei Veranstaltungen der vaskulären Permeabilität fließt. Die Spitze von 155 kDa Dextran-TMR Extravasationin Abbildung 2 ist zwischen 29 &#39;und 34&#39; gesehen. Extravasalen Dextran ist an der weißen Pfeilspitze in den oberen Platten und an der roten Pfeilspitze in den unteren Platten, gesehen nur den Kanal des 155 kDa-Dextran-TMR zeigt. Die 155 kDa Dextran-TMR löscht aus dem Gewebe und wird als eine Abnahme der extravaskulärem TMR Signal gesehen , wie in Abbildung 2 bei 97 &#39;gesehen. Nach dem Übersetzen der Zeitraffer-Sequenz in ImageJ extravaskulärem Dextran quantifiziert. Neben spontanen Ereignissen in der Tumor-Mikroumgebung zu beobachten, ist es wichtig, die zugrundeliegenden molekularen Mechanismus der identifizierten Phänomene zu untersuchen. Injizieren zusätzliche vaskuläre Farbstoffe oder Proteine ​​Gefäßpermeabilität zu induzieren können Einblick in die Signalisierungsereignisse liefern Gefäßpermeabilität Regulieren dar. 3 zeigt den Unterschied in der Extravasation von 10 kDa - Dextran-FITC (grün) und 155 kDa - Dextran-TMR (rot).Mit hohem Molekulargewicht 155 kDa Dextran-TMR wird unmittelbar vor Beginn der Zeitraffer-Bildgebung verabreicht. Fünf Z-Stapel werden im Zeitraffer-Sequenz erworben eine Basislinie zu setzen, bevor 10 kDa Dextran-FITC injiziert wird. Nach dem Erwerb des 5. Z-Stack die 10 kDa Dextran-FITC durch die Schwanzvene Katheter ohne Unterbrechung Bildaufnahme verabreicht wird. Das Dextran-FITC wird das Gefäßsystem mit sofortiger Extravasation gesehen eintritt , während das 155 kDa Dextran-TMR auf den vaskulären Raum beschränkt bleibt (Abbildung 3, 0 &#39;und 6&#39;). Das 10 kDa - Dextran-FITC Extravasate vollständig aus dem Blutgefäß und löscht aus dem Gewebe des 155 kDa - Dextran-TMR in dem Blutgefäß (Abbildung 3 , wie gesehen bei 56 &#39;und Film 2) zu verlassen. Mit einem Zeitpunkt von vor der Injektion, die Kinetik von 10 kDa Dextran-FITC Extravasation leicht im Vergleich zu 155 kDa Dextran-TMR 13 werden kann. Die unmittelbare Extravasation von 10 kDa dextran-FITC nach Injektion signifikant unterschiedlich von der Retention von 155 kDa - Dextran-TMR in das Gefäßsystem und die spontane Gefäßpermeabilität Ereignisse 13. Weitere experimentelle Kontrollen können vaskuläre Permeabilität durch die mechanische Zerstörung des Endothels oder durch VEGFA 165 vermittelter Permeabilität 13 durchgeführt werden , einschließlich Induktion. Die Kinetik der Extravasation von 155 kDa-Dextran-TMR spontaner Permeabilität Ereignisse können zu 10 kDa Dextran verglichen werden, und andere Mittel der vaskulären Permeabilität induzieren die Ereignisse und Signale in Gefäßpermeabilität Ereignisse in der Tumor-Mikroumgebung beteiligt sind, zu verstehen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54042/54042fig1.jpg" /> Abbildung 1. Strategien für die Zellen und die Gefäße im Tumormikromilieu Beschriftung. (A) Transgene MMTV-PyMT Maus mit Tumorzellen markiert mit Dendra2 (MMTV-ICRE / CAGCAT-Dendra2 / MMTV-PyMT) und markierten Makrophagen , die mit GFP (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Tumorgefäße mit 155 kDa Dextran-TMR durch Schwanzvenenkatheter verabreicht markiert. (B) TN1-GFP - Patienten stamm Xenotransplantattumoren mit markierten Makrophagen mit 70 kDa Dextran-Texas - Rot und markierte Gefäße mit Quantenpunkten den Schwanz Venenkatheter verwendet wird . Maßstabsbalken, 50 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54042/54042fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54042/54042fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54042/54042fig2.jpg" /> Abbildung 2. Visualizing vorübergehende vaskulären Permeabilität. (A) Intravitalmikroskopie (IVM) Zeitraffer von 155 kDa Dextran-TMR (rot) Extravasation und Tumorzelle intravasation bei TMEM (weißer Kasten). Die Tumorzellen markiert mit Dendra2 (grün, TC), Makrophagen mit ECFP (Cyan, M) und blood Schiffe mit 155 kDa Dextran-TMR (rot, BV). Blutgefäßdurchlässigkeit Stellen (weißer Pfeil). (B) Isolierte 155 kDa Dextran-TMR - Kanal. Rote Pfeile markieren Dextran Extravasation (weiß). Maßstabsbalken, 50 &amp; mgr; m. Film von Zeitraffer-Mikroskopie in Film 1. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54042/54042fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54042/54042fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54042/54042fig3.jpg" /> Abbildung 3. Visualizing mehrere fluoreszenzmarkierte Dextrane. IVM Zeitraffer der Unterschied in Extravasation von 155 kDa Dextran-TMR (rot) und 10 kDa Dextran-FITC (grün). Makrophagen sind mit ECFP (cyan) und Kollagen in blau (SHG) markiert. Die Überlagerung der roten 155 kDa Dextran-TMR und grün 10 kDa Dextran-FITC in den Gefäßen ist gelb. Schnelle Extravasation von grün 10 kDa Dextran-FITC Spitze ist 6 min. Scale Bar, 50 &amp; mgr; m. Film von Zeitraffer-Mikroskopie in Movie 2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54042/54042fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54042/54042fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/54042/54042movie1.jpg" /> Film 1. Visualizing spontane vorübergehende Gefäßpermeabilität mit Zeitraffer IVM. Zeitraffer-Mikroskopie von transienten Blutgefäßdurchlässigkeit in einer transgenen MMTV-PyMT Maus mit Tumorzellen , markiert mit Dendra2 (MMTV-ICRE / CAGCAT sichtbar gemacht (wie in Abbildung 2 zu sehen) -Dendra2 / MMTV-PyMT) und Makrophagen , markiert mit GFP (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Extravasation von 155 kDa Dextran-TMR Extravasation (rot im linken Bereich, weiß rechts) ist an der Verzweigungsstelle des Tumorblutgefäße beobachtet. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54042/Movie_1-JoVE_Harney.avi" target="_blank">P</a>leasen hier klicken um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit.) <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/54042/54042movie2.jpg" /> Film 2. Visualizing Extravasation von mehreren fluoreszierend markierten Dextranen durch Zeitraffer IVM. Zeitraffer-Mikroskopie von Extravasation von 155 kDa Dextran-TMR (rot) und 10 kDa Dextran-FITC (grün) in einem transgenen (wie in Abbildung 3 zu sehen) MMTV-PyMT Maus mit markierten Makrophagen , die mit GFP (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP). SHG von Kollagen ist blau markiert. Red 155 kDa Dextran-TMR bleibt in der Gefäßversorgung des Tumors für die Dauer der Zeitraffer , während die grüne 10 kDa Dextran-FITC schnell Extravasate und löscht aus den Blutgefäßen und Gewebe. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54042/Movie_2-JoVE_Harney.avi" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54042/Movie_2-JoVE_Harney.avi" target="_blank">dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download</a> bereit <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54042/Movie_2-JoVE_Harney.avi" target="_blank">.)</a>

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Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie ausgedehnte Zeitraffer-Bildgebung von mehrzelligen Interaktionen in Echtzeit durchzuführen, in vivo auf Einzelzellauflösung.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

extended-time-lapse-intravital-imaging-real-time-multicellular

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.0K Aufrufe.  Albert Einstein College of Medicine.  Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie ausgedehnte Zeitraffer-Bildgebung von mehrzelligen Interaktionen in Echtzeit durchzuführen, in vivo auf Einzelzellauflösung. 

Serie: Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical excision of the tumor with a full lymphadenectomy in the drainage area of the tumor. However, removal of lymph nodes is associated with increased morbidity due to infection, wound breakdown and lymphedema.4,5 As an alternative, the sentinel lymph node procedure (SLN) was developed several decades ago to detect the first draining lymph node from the tumor.6 In case of lymphogenic dissemination, the SLN is the first lymph node that is affected (Figure 1). Hence, if the SLN does not contain metastases, downstream lymph nodes will also be free from tumor metastases and need not to be removed. The SLN procedure is part of the treatment for many tumor types, like breast cancer and melanoma, but also for cancer of the vulva and cervix.7 The current standard methodology for SLN-detection is by peritumoral injection of radiocolloid one day prior to surgery, and a colored dye intraoperatively. Disadvantages of the procedure in cervical and vulvar cancer are multiple injections in the genital area, leading to increased psychological distress for the patient, and the use of radioactive colloid.
Multispectral fluorescence imaging is an emerging imaging modality that can be applied intraoperatively without the need for injection of radiocolloid. For intraoperative fluorescence imaging, two components are needed: a fluorescent agent and a quantitative optical system for intraoperative imaging. As a fluorophore we have used indocyanine green (ICG). ICG has been used for many decades to assess cardiac function, cerebral perfusion and liver perfusion.8 It is an inert drug with a safe pharmaco-biological profile. When excited at around 750 nm, it emits light in the near-infrared spectrum around 800 nm. A custom-made multispectral fluorescence imaging camera system was used.9.
The aim of this video article is to demonstrate the detection of the SLN using intraoperative fluorescence imaging in patients with cervical and vulvar cancer. Fluorescence imaging is used in conjunction with the standard procedure, consisting of radiocolloid and a blue dye. In the future, intraoperative fluorescence imaging might replace the current method and is also easily transferable to other indications like breast cancer and melanoma.

Fluorescence imaging is a promising innovative modality for image-guided surgery in surgical oncology. In this video we describe the technical procedure for detection of the sentinel lymph node using fluorescence imaging as showcased in gynecologic oncologicy. A multispectral fluorescence camera system, together with the fluorescent agent indocyanine green, is applied.

Multispectral Real-time Fluoreszenz-Imaging für die intraoperative Detektion des Sentinel Lymph Node in Gynäkologische Onkologie

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

Forschung

Medizin

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

MAME Modelle für die 4D-Bildgebung lebender Zellen von Tumor: Mikroumgebung Wechselwirkungen, die Einfluss auf maligne Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, intestinal ischemia as well as following transplant and cardiovascular surgery.1 Reperfusion of previously ischemic tissue, while essential for the prevention of irreversible tissue injury, elicits excessive inflammation of the affected tissue. Adjacent to the production of reactive oxygen species, activation of the complement system and increased microvascular permeability, the activation of leukocytes is one of the principle actors in the pathological cascade of inflammatory tissue damage during reperfusion.2, 3 Leukocyte activation is a multistep process consisting of rolling, firm adhesion and transmigration and is mediated by a complex interaction between adhesion molecules in response to chemoattractants such as complement factors, chemokines, or platelet-activating factor.4
While leukocyte rolling in postcapillary venules is predominantly mediated by the interaction of selectins5 with their counter ligands, firm adhesion of leukocytes to the endothelium is selectin-controlled via binding to intercellular adhesion molecules (ICAM) and vascular cellular adhesion molecules (VCAM).6, 7 
Gold standard for the in vivo observation of leukocyte-endothelial interaction is the technique of intravital microscopy, first described in 1968.8
Though various models of IRI (ischemia-reperfusion injury) have been described for various organs, 9-12 only few are suitable for direct visualization of leukocyte recruitment in the microvascular bed on a high level of image quality.8 
We here promote the digital intravital epifluorescence microscopy of the postcapillary venule in the cremasteric microcirculation of the rat 13 as a convenient method to qualitatively and quantitatively analyze leukocyte recruitment for IRI-research in striated muscle tissue and provide a detailed manual for accomplishing the technique. We further illustrate common pitfalls and provide useful tips which should enable the reader to truly appreciate, and safely perform the method.
In a step by step protocol we depict how to get started with respiration controlled anesthesia under sufficient monitoring to keep the animal firmly anesthetized for longer periods of time. We then describe the cremasteric preparation as a thin flat sheet for outstanding optical resolution and provide a protocol for leukocyte imaging in IRI that has been well established in our laboratories.

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

Digital intravital epifluorescence microscopy of postcapillary venules in the cremasteric microcirculation is a convenient method to gain insights into leukocyte-endothelial interaction in vivo in ischemia-reperfusion injury (IRI) of striated muscle tissue. We here provide a detailed protocol to safely perform the technique and discuss its applications and limitations.

Real-time Digital Imaging von Leukozyten-Endothel-Interaktion in der Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der Ratte Cremastermuskel

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an increased risk of vascular morbidity.&#160;Yet, albeit&#160;the mounting clinical evidence, there is a paucity of clear studies of vascular toxicity and therefore the etiology of a heterogeneous group of vascular/cardiovascular disorders remains to be elucidated. Moreover, the mechanism that may underlie vascular toxicity can completely differ from the principles of chemotherapy-induced cardiotoxicity, which is related to direct myocyte injury. We have established a real-time, in vivo molecular imaging platform&#160;to evaluate&#160;the potential&#160;acute&#160;vascular toxicity of anti-cancer therapies.
We have set up a platform of in vivo, high-resolution molecular imaging&#160;in mice,&#160;suitable for visualizing vasculature within confined organs and reference blood vessels within the same individuals whereas each individual serve as its own control. Blood vessel walls were impaired after doxorubicin administration, representing a unique mechanism of vascular toxicity that may be the early event in end-organ injury. Herein, the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging is described, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

We herein describe the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapie-induzierte vaskuläre Toxizität - Echtzeit-<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The objective of this study was to use 3D CLSM time lapse confocal imaging to assess the in vitro biocompatibility of dental composites. This method provides an accurate and sensitive indication of viable cell rate in contact with dental composite extracts. The ELS extra low shrinkage, a dental composite used for direct restoration, has been taken as example. In vitro assessment was performed on cultured primary human gingival fibroblast cells using Live/Dead staining. Images were obtained with the FV10i confocal biological inverted system and analyzed with the FV10-ASW 3.1 Software. Image analysis showed a very slight cytotoxicity in the presence of the tested composite after 5 hours of time lapse. A slight decrease of cell viability was shown in contact with the tested composite extracts compared to control cells. The findings highlighted the use of 3D CLSM time lapse imaging as a sensitive method to qualitatively and quantitatively evaluate the biocompatibility behavior of dental composites.

The most studied aspect of the biocompatibility of dental composites is their cytotoxicity 3D CLSM time lapse imaging combined with fluorescent signal quantification allows sensitive evaluation of the cell fate over time. Utilizing this method could be an efficient tool to assess the cytocompatibility of dental composites.

Konfokale Zeitraffer Imaging als eine effiziente Methode für die Bewertung der Cytocompatibility Dental Composites

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting and sustaining this phenotype is critically important in normal alveolar growth and gas exchange throughout life. Several in vitro studies have characterized the role of key regulatory proteins, signaling molecules, and steroid hormones that can influence the rate of lung fluid clearance. However, in vivo examinations must be performed to evaluate whether these regulatory factors play important physiological roles in regulating perinatal lung liquid absorption. As such, the utilization of real time X-ray imaging to determine perinatal lung fluid clearance, or pulmonary edema, represents a technological advancement in the field. Herein, we explain and illustrate an approach to assess the rate of alveolar lung fluid clearance and alveolar flooding in C57BL/6 mice at post natal day 10 using X-ray imaging and analysis. Successful implementation of this protocol requires prior approval from institutional animal care and use committees (IACUC), an in vivo small animal X-ray imaging system, and compatible molecular imaging software.

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

Echtzeit-Röntgenbildgebung von Lungenflüssigkeitsvolumen in Neonatal Mauslunge

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...