Name: the ex vivo culture and pattern recognition receptor stimulation of mouse intestinal organoids
Uploaded: 2016-05-18T15:00:00.000+00:00
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The authors would like to thank Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel and Bettina Heid for technical discussions. The authors thank Dr. Nanda Nanthakumar for providing the Caco-2 cells. The authors also thank The Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) at Virginia Tech. This work was supported by the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (to I.C.A.). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Die Kultur und die Wartung der intestinalen Organoide ist eine Prozedur, die von jedem einzelnen mit ausreichender Gewebekultur Technik beherrscht werden kann. Es gibt Feinheiten in Passagierung im Vergleich zu Zellen in einer konventionelleren Monoschicht wachsen, aber diese Feinheiten sind nicht schwierig zu überwinden. Die kritischen Schritte dieses Verfahrens beinhalten die Organoide auf eine ausreichend hohe Dichte für optimale seeding wachsen zu können. Die Versuche müssen nach unten mit Organoiden skaliert werden als große Einsaatdichten, die häufig im Zusammenhang mit Zelllinien erreicht werden kann, nicht praktikabel sind. Dies wird besonders deutlich, wenn mehrere Behandlungsgruppen sind. Dieses Protokoll soll eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zu schaffen, Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen des Darmepithels mit einer Vielzahl von verschiedenen Bakterien zu untersuchen, viral, und fungale Pathogene, sowie Adress Schwierigkeiten dieses Systems in Bezug auf die Normalisierung verwendet wird. Berichte werden, dass describ verfügbare die Wechselwirkungen von Darm Organoide mit dem bakteriellen Erreger Salmonellen, noch adressieren Methoden Normalisierung nicht , wenn Zytokine 13 zu messen. Es gibt mehrere Probleme, die auftreten, wenn organoiden Kulturen mit verschiedenen Methoden zu normalisieren. Normalisieren sezerniertes Protein über Bicinchoninsäure (BCA) ist eine Option; jedoch erforderlich , die Wachstumskomponenten für organoiden Kultur (N2 und / oder Vitamin B27) interferieren mit dem BCA - Assay (Daten nicht gezeigt) Normalisieren über zelluläre Lebensfähigkeit, wie beispielsweise eine modifizierte MTT - Assay wurde 14 beschrieben worden ist . jedoch eine Behandlung, die die mitochondriale Stoffwechselaktivität der Organoide verändern wird , wird eine ungenaue Methode zur Normalisierung über diese Technik als MTT einzuführen basiert auf Reduktion durch Einwirkung von mitochondrialen Dehydrogenasen 15. Es ist auch notwendig, N-Acetyl-Cystein (NAC) von den Medien, nicht zu entfernen,ly wenn Technik Normalisierung über die MTT erwünscht ist, aber mit einem bakteriellen Krankheitserreger , wie NAC 16 kann das Bakterienwachstum hemmen , wenn die Behandlung. Vorteile dieser Technik sind, dass sekretierte Zytokine und Proteinprodukte von Organoiden jetzt normalisierten gegen eine Standardkurve von Caco-2-Zellen sein kann. Einschränkungen dieser Technik sind, daß die Normalisierung, weil korrelativen ist eine Kernfärbung der nicht transformierten primären epithelialen Organoide werden normalisiert gegen die Kernfärbung eines Kolonkarzinom-Zelllinie. Die Autoren finden, dass mit Kern mit Methanol und Färbung Kerne Befestigung Farbstoff-Anfärben ist eine wirksame Normierungstechnik gegen eine Standardkurve von Caco-2-Zellen. Obwohl die Wachstumseigenschaften dieser Krebszelllinie Kolon nicht genau die Wachstumseigenschaften der intestinalen Organoiden nachahmen, eine Kernfärbung mit und mittlere Fluoreszenzintensität messen, ist eine gute Strategie gegen Gesamtzellzahl zu normalisieren. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Zusammengenommen die hier beschriebene Technik bietet einen guten Ausgangspunkt Wirt-Pathogen-Interaktionen mit ausreichender Normalisierung zu imitieren, die für die Herstellung von präzise Interpretationen mit diesem Modellsystem unerlässlich ist. Die Bedeutung dieser Technik in Bezug auf alternative Verfahren ist, dass die richtige Normalisierung durchgeführt werden muss, wenn jede Auswertung von sekretierten Protein, wie ELISA basierten Assays durchzuführen.

Die Fähigkeit , zu ernten und Kultur primären Organoide wurden Dünndarm, Dickdarm, Bauchspeicheldrüse, Leber und Gehirn und sind spannende Fortschritte germane zum Verständnis eines physiologisch repräsentativen Phänomene für Gewebe biology 1-5 ​​beschrieben. Die ersten Methoden , um die Kultur und die Wartung von kleinen Darm-Organoiden beschreiben wurde von Sato et al. Aus dem Labor von Hans Clevers 1. Vor dieser Methode, die Ernte und Kultur der primären intestinalen Epithelzellen nachgewiesen begrenzt und ineffektiv bei der Aufrechterhaltung epithelialen Zellwachstums werden. Verfahren enthalten Dissoziation des Gewebes durch Inkubation mit Enzymen wie Kollagenase und Dispase, die letztlich zum Auswachsen von vermischte primären Fibroblastenzellen 6 führen würde. Diese Bedingungen würden auch die epithelialen Zellkultur bei der Aufrechterhaltung Zeit eingeschränkt werden. Minimale bis keine Epithelzelle Nische bilden würde, wie die Epithelzellen Apoptose eintreten würde aufgrunddas Fehlen von geeigneten Wachstumsfaktoren oder Kontaktverlust Integrität, bezeichnet anokis 7. Das Aufkommen der 3D-organoiden Kultursystem hat ein Verfahren zur Kultur primären Darmzellen bereitgestellt 1 ein Spektrum von Darmzelltypen in Kultur anhalt enthält. Diese epithelialen Organoide haben Vorteile gegenüber Zelllinien ist , dass sie aus mehreren differenzierten Zellen zusammengesetzt sind, und imitieren besser das Organ sie in vivo 8 abgeleitet sind. Der Prozess, um schließlich &quot;wachsen, um ein Mini-Darm in einer Schale&quot; ein wertvolles Instrument für die Bewertung der Reaktion von Darmepithel unter verschiedenen Stimuli bewährt hat. Die Untersuchung der Interaktion von primären Darmzellen mit mikrobiellen Pathogen associated molecular patterns (PAMPs) ist auf dem Gebiet der Immunologie relevant , da diese molekularen Muster 9 unterschiedlichen Antworten von sowohl Wirt und Mikrobe regulieren kann. Nicht nur können die Ermittler untersuchen nun diese Interaktionen mit der Maus Organoiden, aber siekann von Menschen als auch 2 kultiviert werden. Diese Technologie hat das Potenzial, dramatisch personalisierte Medizin zu verändern und es ist verlockend, um Fortschritte zu spekulieren, dass diese Technik in naher Zukunft möglich machen wird. Das Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Protokoll für die Kultur, Expansion und Behandlung von Darm Organoide mit einer Vielzahl von Stimuli bereitzustellen. Solche Reize schließlich kann von Impfstoffen, bakterielle PAMPs reichen, Live-Erreger, gastrointestinale (GI) und Krebstherapeutika. Die Isolierung und Kultur von Maus - Darm-Organoiden wurde von Sato et al angepasst. Zwar gibt es geringfügige Abweichungen von der ursprünglichen Methode der Produktkultur sein Ende organoiden wird noch erreicht , wenn dieses Protokoll folgen. Dieses Verfahren wird auf die Beschreibung eine ausreichende Technik zum korrekten Normalisierung fokussiert, wenn sie mit nicht homogenen Zellstrukturen arbeitet, die berücksichtigt werden müssen, wenn ein Assay basierend auf Zelle n leitendenUmber.

<table><tbody><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050</td><td>(Section 1,3,6) Or equivalent brand</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td><td>Thermo</td><td></td><td>(Section 1,3)</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare</td><td>Sh30243.01</td><td>(Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells</td></tr><tr><td>HEK293T-Rspondin1 secreting cell line</td><td></td><td></td><td>(Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml conical tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>(Section 1) Or equivalent brand</td></tr><tr><td>T-175 Flask</td><td>Corning</td><td>431079</td><td>(Section 1) Or equivalent brand&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Protein Matrix</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>(Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco&#039;s (DPBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30264.01</td><td>(Section 2,3)</td></tr><tr><td>DMEM/F12&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>(Section 2,3) Advanced DMEM/F12</td></tr><tr><td>Corning 24 Well TC Plates</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>(Section 2)</td></tr><tr><td>N2 Supplement 100x&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>(Section 2)</td></tr><tr><td>B27 without vitamin A 50x&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010&amp;nbsp;</td><td>(Section 2)</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>(Section 2)</td></tr><tr><td>Glutamine Supplement (Glutamax)</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>(Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>(Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10ml Serological Pipet</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>(Section 2) Or equivalent brand</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>(Section 2) Stock = 100 mg/ml</td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>(Section 2) Stock = 1M</td></tr><tr><td>Recombinant Mouse EGF</td><td>Biolegend</td><td>585608</td><td>(Section 2) Stock = 500 mg/ml</td></tr><tr><td>Rocker Variable</td><td>Bioexpres</td><td></td><td>(Section 3)</td></tr><tr><td>dissecting scissors</td><td></td><td></td><td>(Section 3)</td></tr><tr><td>forceps</td><td></td><td></td><td>(Section 3)</td></tr><tr><td>glass slides</td><td></td><td></td><td>(Section 3)</td></tr><tr><td>dissecting tweezers</td><td></td><td></td><td>(Section 3)</td></tr><tr><td>25 ml Serological Pipet</td><td>Falcon</td><td></td><td>(Section 3)</td></tr><tr><td>EDTA&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9821</td><td>(Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA</td></tr><tr><td>Sterile Petri Dish 100mm x 15mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>(Section 3) Or equal sized TC dish</td></tr><tr><td>1ml Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>(Section 4)</td></tr><tr><td>Precision Glide Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305120</td><td>(Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm)</td></tr><tr><td>Flagellin from Bacillus subtilis</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-bsfla&amp;nbsp;</td><td>(Section 5,6)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>19115</td><td>(Section 5,6)&amp;nbsp;(Murray&amp;nbsp;et&amp;nbsp;al.)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td>(Section 5,6)Or equivalent brand</td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>211065</td><td>(Section 5)</td></tr><tr><td>Bacto Brain Heart Infusion</td><td>Becton Dickinson</td><td>237500</td><td>(Section 5)</td></tr><tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td><td>(Section 6)</td></tr><tr><td>Trypsin&amp;nbsp;</td><td>gibco</td><td>25200056</td><td>(section 6)</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>(Section 6)</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecuar Devices</td><td></td><td>(Section 6)</td></tr><tr><td>96 Well Assay Plate</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>(Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated</td></tr><tr><td>Nuclear Staining Dye</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>(section 6) Hoechst 33342</td></tr><tr><td>T-75 Flask</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>(Section 6) Or equivalent brand</td></tr><tr><td>15 ml conical tube</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>(Section1,3) Or equivalent brand</td></tr><tr><td>1.7 ml polypropylene tube</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td>Or equivalent brand</td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td>Or equivalent brand</td></tr><tr><td>TNF-alpha&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00443260_g1</td><td>Taqman gene expression assay kit</td></tr><tr><td>IL-6&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>(Mm 00446190_m1</td><td>Taqman gene expression assay kit</td></tr><tr><td>IL-1beta</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434228_m1</td><td>Taqman gene expression assay kit</td></tr><tr><td>IL-18</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434225_m1</td><td>Taqman gene expression assay kit</td></tr><tr><td>18s</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs 99999901_s1</td><td>Taqman gene expression assay kit</td></tr><tr><td>7500 Fast Real Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexus gradient Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>500 ng/ml</td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7559</td><td></td></tr></tbody></table>

the ex vivo culture and pattern recognition receptor stimulation of mouse intestinal organoids

Primäre Darm-Organoiden sind ein wertvolles Modell-System, das das Potenzial hat, deutlich auf dem Gebiet der Immunologie Schleimhaut auswirken. Allerdings führen die Komplexität der organoiden Wachstumseigenschaften erhebliche Einschränkungen für die Ermittler. Insbesondere sind die Wachstumsmuster der einzelnen organoiden sehr variabel und eine heterogene Population von Epithelzellen in Kultur zu schaffen. Mit einer solchen Einschränkungen können gemeinsame Gewebekulturpraktiken nicht einfach auf den organoiden System angewendet werden, aufgrund der Komplexität der Zellstruktur. Zählen und Plattieren basiert ausschließlich auf Zellzahl, die einzeln getrennten Zellen, wie beispielsweise Zelllinien gemeinsam ist, ist kein zuverlässiges Verfahren zur Organoide wenn nicht ein Normalisierungsverfahren angewendet wird. Normalisieren auf den Gesamtproteingehalt ist komplex aufgrund der Bewohner Proteinmatrix hergestellt. Diese Eigenschaften in Bezug auf die Zellzahl, Form und Zelltyp sollte in Betracht gezogen werden, wenn sekretiertes con AuswertungZelte aus der organoiden Masse. Dieses Protokoll wurde generiert ein einfaches Verfahren zur Kultur zu skizzieren und Dünndarm-Organoide mit mikrobiellen Krankheitserregern und pathogen associated molecular patterns (PAMPs) zu behandeln. Er betont auch die Normalisierungstechniken, die angewendet werden soll, wenn die Proteinanalyse nach einer solchen Herausforderung durchgeführt werden.

Wenn dieses Protokoll nach einer Darm Organoiden zu pflegen, charakteristische Kugel geformt Organoiden wird nach der Ernte vorhanden sein. Die Zugabe von R-spondin1 konditionierten Medien täglich wird das Wachstum und die Knospung der Organoide initiieren. Das Wachstum von Organoiden ist in 1A gezeigt - F, und ist repräsentativ für intestinale Organoide an den Tagen 1, 2, 4, 5, 6 und Tag 14. 1F inhomogenen Wachstumseigenschaften von Organoiden am Tag 14 darstellt. Sobald die Organoiden zu einer ausreichenden Zahl gezüchtet werden, können sie erneut ausplattiert und mit verschiedenen PAMPs und / oder Mikroben in Frage gestellt werden. Expressionsanalyse kann über Standardtechniken durchgeführt werden. Dies ist in Figur 2A-C dargestellt , die die mRNA - Expression von inflammatorischen Zytokinen IL-18 zeigt, IL-6 und TNF &amp; agr; die eine folgende analysiert24 - Stunden - Herausforderung von Organoiden mit durch Hitze abgetöteten L. monocytogenes und die PAMP Flagellin. Die Gründe für die mRNA-Expression Auswertung Zytokine IL-18, IL-6 und TNFa war, dass diese waren gute Kandidaten für die von Epithelzellen in Reaktion auf pathogene Herausforderung moduliert wird, und die Modulation dieser inflammatorischen Zytokinen würde die Wirksamkeit der Technik demonstrieren. 3A - C zeigt die relative Kernfärbung der intestinalen Organoide mit Kernanfärbung Farbstoff folgende Fixierung mit minimalen Hintergrundfärbung von Ablagerungen im residenten Proteinmatrix. Diese Methode der Fixierung und Färbung kann angewendet werden, Assays zu normalisieren, die für unterschiedliche Zellzahlen in jeder Vertiefung ausmachen werden. Dies ergibt sich in Figur 4 , wenn eine Standardkurve von seriellen Verdünnungen von Caco-2 - Zellen ausplattiert in Proteinmatrix zu erzeugen, dann fixiert und gefärbt mit KernFärbung Farbstoff. Der R 2 -Wert von 0,89 zeigt eine lineare Beziehung zwischen der Zellzahl und die mittlere Fluoreszenzintensität und die lineare Gleichung verwendet werden kann Organoide auf die Zellzahl zu normieren. Die Standardkurve in Abbildung 4 beginnt die Sättigungsgrenze über 30.000 Zellen pro Vertiefung zu erreichen. Eine Titration von Zellen über 30.000 Zellen pro Vertiefung wurde in 4 umfassen die Sättigungsbereich der Kernfärbung Farbstoff gezeigt. Erhöhte Genauigkeit der Normalisierung wird mit einer Zellzahl erhalten werden, die den linearen Bereich der Kernfärbung Farbstoff reflektiert, bevor die Sättigungsgrenze erreicht ist. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54033/54033fig1.jpg" /> Abb . 1: Kleine Intestinale organoiden Wachstum Zeit Wachstumskurs für Maus - Dünndarm abgeleitet Organoiden nach der Isolierung. (A) 1. Tag (B) 2. Tag (C) 4. Tag (D) 5. Tag (E) 6. Tag (F) 14. Tag : Bilder repräsentativ für jeden bestimmten Tag von organoiden Wachstum. Maßstabsbalken gleich 200 &amp; mgr; m im linken Bild für A, B, C, D und E. Maßstabsbalken gleich 100 &amp; mgr; m im rechten Bild für A, B, C, D und E. Maßstabsbalken gleich 1000 um und 200 um für linke und rechte Bilder für F sind. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54033/54033fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54033/54033fig2.jpg" /> Abbildung 2: mRNA Expression von inflammatorischen Zytokinen Nach 24 Stunden PAMP Herausforderung Relative mRNA - Expression von Wildtyp - Darm-Organoiden für 24 Stunden in Frage gestellt mit PAMPs und Hitze getötet Listeria monocytogenes (A - C) darstellen fache Änderung des i..<html> nflammatory Zytokine IL-18, IL-6 und TNF &amp; agr; sind. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichung (SD) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54033/54033fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54033/54033fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54033/54033fig3.jpg" /> Abbildung 3: Relative Fluorescent Anfärbung von Organoide für Normalisierungskernfärbung von Organoiden mit Fixierung folgen.. (A) Hellfeld von Organoiden. (B) Fluoreszenzfärbung von Organoiden mit Kernfärbung Farbstoff. (C) zusammengefügte Bild von Hellfeld und Fluoreszenzfärbung. Maßstabsbalken gleich 400 &amp; mgr; m in allen Bildern. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54033/54033fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54033/54033fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> &quot;&gt; <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54033/54033fig4.jpg" /> Abbildung 4: Standardkurve erzeugt von Caco-2 - Zellen Standardkurve aus drei Vertiefungen erzeugt.. Zellaussaat hatte eine Reichweite bei 60.000 Zellen pro Vertiefung beginnend mit Verdünnungen bis zu 2500 Zellen pro Vertiefung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54033/54033fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54033/54033fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54033/54033fig5.jpg" /> Abbildung 5:. Übersicht des Protokolls Diagramm 1-Top Panel der Figur zeigt die R-spondin1 konditionierten Medien Ernte. 2-mittlere Platte der Figur zeigt Aspekte des Protokolls zu ernten und Kultur Maus kleine Darm-Organoiden. 3-Unterseite der Figur zeigt: (A) Die Plattierung einer 14 Tage kultiviert Organoiden. (B) Herausforderung mit PAMPs / L.monocytogenes und verlassen unbesetztes Vertiefungen einer Standardkurve. (C) Nach der PAMP Herausforderung, das Plattieren von Caco-2 - Zellen in den vorher unbesetztes Vertiefungen zu erzeugen , um eine Standardkurve zu erzeugen. (D) Nach der Fixierung und Zugabe eines Kernfärbung Farbstoff, Messung der Anregung / Emission der Vertiefungen und Normalisierung gegen eine Standardkurve. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54033/54033fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54033/54033fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Hier wird ein Protokoll zu ernten, zu pflegen und zu behandeln Maus kleine Darm-Organoide mit pathogen associated molecular patterns (PAMPs) und Listeria monocytogenes beschrieben, sowie Betonung auf die Genexpression und die richtige Normalisierungstechniken für Protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

13.5K Aufrufe.  Virginia Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Tech.  Hier wird ein Protokoll zu ernten, zu pflegen und zu behandeln Maus kleine Darm-Organoide mit pathogen associated molecular patterns (PAMPs) und Listeria monocytogenes beschrieben, sowie Betonung auf die Genexpression und die richtige Normalisierungstechniken für Protein. 

Serie: The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

In-vitro-Kultur von Organoide Primäre Maus Kolontumoren

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Forschung

Medizin

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Krebsforschung

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. Adult intestinal stem cells reside at the bottom of the crypts of Lieberk&#252;hn, are earmarked by expression of the Lgr5 gene, and preserve homeostasis through their characteristic high proliferative rate1. Throughout the small intestine, Lgr5+ stem cells are intermingled with specialized secretory cells called Paneth cells. Paneth cells secrete antibacterial compounds (i.e., lysozyme and cryptdins/defensins) and exert a controlling role on the intestinal flora. More recently, a novel function has been discovered for Paneth cells, namely their capacity to provide niche support to Lgr5+ stem cells through several key ligands as Wnt3, EGF, and Dll12.
When isolated ex vivo and cultured in the presence of specific growth factors and extracellular matrix components, whole intestinal crypts give rise to long-lived and self-renewing 3D structures called organoids that highly resemble the crypt-villus epithelial architecture of the adult small intestine3. Organoid cultures, when established from whole crypts, allow the study of self-renewal and differentiation of the intestinal stem cell niche, though without addressing the contribution of its individual components, namely the Lgr5+ and Paneth cells.
Here, we describe a novel approach to the organoid assay that takes advantage of the ability of Paneth and Lgr5+ cells to associate and form organoids when co-cultured. This approach, here referred to as &#34;organoid reconstitution assay&#34; (ORA), allows the genetic and biochemical modification of Paneth or Lgr5+ stem cells, followed by reconstitution into organoids. As such, it allows the functional analysis of the two main components of the intestinal stem cell niche.

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Intestinal organoid cultures are established from whole crypts and do not allow the analysis of self-renewal and differentiation in a cell-specific fashion. This protocol describes reconstitution of sorted stem (Lgr5+) and niche (Paneth) cells, which give rise to organoids while enabling their prior biochemical and genetic modification and functional analysis.

Die organoide Rekonstitution Assay (ORA) für die funktionelle Analyse von intestinale Stammzellen und Nische Zellen

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Biotechnik

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune cells, and stroma. All of these heterogeneous cells contribute to intestinal homeostasis and participate in antimicrobial host defense. Therefore, identifying a surrogate model for studying immune response and antimicrobial activity of the intestine in an in vitro setting is extremely challenging. In vitro studies using immortalized intestinal epithelial cell lines or even primary crypt organoid culture do not represent the exact physiology of normal intestine and its microenvironment. Here, we discuss a method of culturing mouse colon tissue in a culture dish and how this ex vivo organ culture system can be implemented in studies related to antimicrobial host defense responses. In representative experiments, we showed that colons in organ culture express antimicrobial peptides in response to exogenous IL-1&#946; and IL-18. Further, the antimicrobial effector molecules produced by the colon tissues in the organ culture efficiently kill Escherichia coli in vitro. This approach, therefore, can be utilized to dissect the role of pathogen- and danger-associated molecular patterns and their cellular receptors in regulating intestinal innate immune responses and antimicrobial host defense responses.

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Culture und seine Verwendung in Antimicrobial-Host Defense Studies

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

Immunologie und Infektion

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Biologie

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Kulturmethoden zur Untersuchung apikal-spezifischer Wechselwirkungen mit intestinalen Organoidmodellen

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

3D-Kultur von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einzelnen Stammzellen

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

Autor im Rampenlicht: Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

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