We thank the Dictyostelium Stock Center for strains and reagents. This study was financed by grants from the Swiss National Science Foundation and the Canton of Basel.

<ol><li> Beachten Sie die frühen Hunger Reaktion von Dictyostelium discoideum durch Zeitraffer-Mikroskopie. <ol><li> Wachsen DH1.10 Zellen oder CORA - defizienten Zellen in einem Erlenmeyerkolben, der HL-5 - Medium (für 1 L: 5 g Proteosepepton, 5 g thiotone E Pepton, 10 g Glucose, 5 g Hefeextrakt, 0,35 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 g KH 2 PO 4, 0,05 g Dihydrostreptomycin-Sulfat, pH 6,6) bei 22 ° C in einem Schüttelinkubator mit einer Rotation von 160 Umdrehungen pro Minute. Halten Zellen mit einer Dichte zwischen 0,01 x 10 6 Zellen / ml und 2 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Untersuchen Zellaggregation durch Ernte log-Phase wachsende Zellen DH1.10 21 oder CORA - defizienten Zellen 10 im Hintergrund DH1.10 erzeugt wird , bei 22 ° C in Schüttelkultur mit HL-5 - Medium gezüchtet. Um dies zu tun, nehmen Sie entsprechende Menge an Zellen (in der Regel zwischen 10 und 50 ml), Zentrifuge 3 min bei 400 xg und waschen Sie die zweimal Zellen in BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, pH 6.5). </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Anschließend Platten Zellen bei einer Dichte von (5, 10, 20 oder 40) x 10 4 Zellen / cm 2 in eine 24-Well - Platte. Damit sie für 1 h bei 22 ° C in BSS zu haften. </li><li> Visualisieren Sie die Aggregation von Zeitraffer-Mikroskopie wie vor 10 beschrieben, Bilder alle 135 sec nehmen. unter Verwendung der entsprechenden Software automatisiert eine Live - Cell - Imaging eingerichtet , ausgestattet mit 5X Objektiv und einer Elektronenvervielfachungs charge-coupled device - Kamera (siehe Materialien Tabelle). </li></ol></li><li> cAMP Pulsieren von Dictyostelium discoideum Zellen während der Hungertod. <ol><li> Untersuchen die Wirkung von außen aufgebrachten cAMP Impulse auf die Entwicklung von Zellen DH1.10 21 oder DH1.10 CORA - defizienten Zellen 10, durch die Zellen zu ernten. Um dies zu tun, nehmen Sie entsprechende Menge an Zellen (in der Regel zwischen 10 und 50 ml), Zentrifuge 3 min bei 400 xg und waschen zweimal in BSS. </li><li> count - Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Resuspendieren der Zellen zu einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml in BSS. Schütteln der Kulturen (160 rpm) bei 22 ° C für 2 Stunden vor der Anwendung von Impulsen. In cAMP Impulse mit einer Zeitschaltuhr gesteuert peristaltische Pumpe. alle 6,5 Minuten von 15 ul 50 nM cAMP (Endkonzentration) über einen Zeitraum von 5 Stunden zu liefern Programmieren Sie die Pumpe mit einem 5 s Puls. </li><li> Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Anschließend wird die Platte , die Zellen in einer Dichte von (5, 10, 20 oder 40) x 10 4 Zellen / cm 2 in eine 24-Well - Platte. Lassen Sie für 1 Stunde in BSS einzuhalten. </li><li> Visualisieren Aggregation nach 16 Stunden bei 22 ° C von Hellfeld-Mikroskopie ein 5fach Ziel verwenden. </li></ol></li><li> Die Induktion von Dictyostelium discoideum Entwicklung durch den Zugang zu konditionierten Medium. <ol><li> Bereiten Sie frisch konditioniertes Medium als 22 beschrieben. Sammeln Sie log-Phase DH1.10 Zellen 21 oder DH1.10 CORA - defizienten Zellen 10, von Kult Schüttelnmen mit HL-5 - Medium bei 22 ° C mit einer Pipette, Zentrifuge für 3 min bei 400 xg und wasche die Zellen dreimal in PBM (0,02 M Kaliumphosphat, 10 &amp; mgr; M CaCl 2 und 1 mM MgCl 2, pH 6.1) verwendet wird . </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers resuspendieren diese in PBM in einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml und schüttle 20 Stunden bei 110 rpm / 22 ° C. </li><li> Sammeln konditionierten Medium nach der Zentrifugation bei 400 × g für 3 min und Klärung durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Filter konditionierte Medium durch ein 0,45 - um - Filter (siehe Materialien Tabelle) und dreifach in PBM verdünnen. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Platte bei einer Dichte von (5, 10, 20 oder 40) x 10 4 Zellen / cm 2 in eine 24-Well - Platte. Damit sie für 1 h bei 22 ° C zu halten. </li><li> Wechselüberstand der Zellen mit dem vorher konditionierten Medium hergestellt. </li><li> Visualisieren Aggregation einN ach 16 Stunden von Hellfeld-Mikroskopie ein 5fach Ziel verwenden. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Weijer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+cell+movement+in+Dictyostelium.">Morphogenetic cell movement in Dictyostelium.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).</li><li>Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum:+a+model+system+for+cell-cell+interactions+in+development.">Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development.</a> Science. 245, 1054-1058 (1989).</li><li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+signal+transduction+pathways+regulating+development+of+Dictyostelium+discoideum.">cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum.</a> Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).</li><li>Clarke, M., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSF+and+CMF,+autocrine+factors+that+regulate+gene+expression+during+growth+and+early+development+of+Dictyostelium.">PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium.</a> Experientia. 51, 1124-1134 (1995).</li><li>Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Aggregation+in+Dictyostelium+discoideum+by+an+External+Periodic+Pulse+of+Cyclic+Adenosine+Monophosphate.">Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate.</a> Science. 175, 333-335 (1972).</li><li>Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cyclic+AMP+in+Dictyostelium+discoideum+and+Polysphondylium+pallidum.">Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum.</a> Nature. 224, 1211-1212 (1969).</li><li>Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+analyses+of+gene+regulation+during+early+development+of+Dictyostelium+discoideum.">Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum.</a> Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).</li><li>Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+signals+induce+cell+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum.">Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).</li><li>Mann, S. K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+regulation+of+early+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum:+mediation+via+the+cell+surface+cyclic+AMP+receptor.">Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor.</a> Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).</li><li>Vinet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+multicellular+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum+is+regulated+by+coronin+A.">Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A.</a> Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).</li><li>Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+holistic+phylogeny+of+the+coronin+gene+family+reveals+an+ancient+origin+of+the+tandem-coronin,+defines+a+new+subfamily,+and+predicts+protein+function.">A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function.</a> BMC Evol Biol. 11, 268 (2011).</li><li>Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+guard:+coronin+proteins+in+innate+and+adaptive+immunity.">On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity.</a> Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).</li><li>Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+Leukocyte+Plasma+Membrane+with+the+Actin+Cytoskeleton+through+Coiled+Coil-mediated+Trimeric+Coronin+1+Molecules.">Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules.</a> Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).</li><li>Kammerer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+trimerization+motif+controls+the+topology+of+short+coiled+coils.">A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).</li><li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronins:+the+return+of+the+crown.">Coronins: the return of the crown.</a> Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).</li><li>Jayachandran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronin+1+Regulates+Cognition+and+Behavior+through+Modulation+of+cAMP/Protein+Kinase+A+Signaling.">Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling.</a> PLoS Biol. 12, e1001820 (2014).</li><li>Suo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronin-1+is+a+neurotrophin+endosomal+effector+that+is+required+for+developmental+competition+for+survival.">Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival.</a> Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).</li><li>Mueller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+T+cell+survival+through+coronin-1-mediated+generation+of+inositol-1,4,5-trisphosphate+and+calcium+mobilization+after+T+cell+receptor+triggering.">Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering.</a> Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).</li><li>de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronin,+an+actin+binding+protein+of+Dictyostelium+discoideum+localized+to+cell+surface+projections,+has+sequence+similarities+to+G+protein+beta+subunits.">Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits.</a> EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).</li><li>Shina, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+and+unique+roles+of+coronin+proteins+in+Dictyostelium.">Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).</li><li>Cornillon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phg1p+is+a+nine-transmembrane+protein+superfamily+member+involved+in+dictyostelium+adhesion+and+phagocytosis.">Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).</li><li>Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+80+x+10(3)+Mr+protein+mediates+sensing+of+cell+density+and+the+onset+of+development+in+Dictyostelium.">A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium.</a> Development. (112), 269-278 (1991).</li><li>Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proteinous+factor+mediating+intercellular+communication+during+the+transition+of+Dictyostelium+cells+from+growth+to+differentiation.">A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation.</a> Zoological science. 12, 61-69 (1995).</li><li>Mehdy, M. C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+factor+and+cyclic+AMP+jointly+regulate+cell-type-specific+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum.">A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum.</a> Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).</li><li>Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+density-sensing+factor+controls+development+in+Dictyostelium.">A density-sensing factor controls development in Dictyostelium.</a> Genes Dev. 6, 390-400 (1992).</li><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium.">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Dev Biol. 391, 1-16 (2014).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Die Coronin Proteine ​​werden in den meisten Taxa der eukaryotischen Klade. Dictyostelium discoideum Coronin A, das Homolog von Säuger Coronin 1, gefunden wird im frühen Verhungern Antwort beteiligt, da Coronin A-defizienten Zellen Aggregationsstellen nicht in der Lage sind , während der frühen Entwicklungs zu bilden Zyklus 10. Um in der Lage sein, um quantitativ und genau die Verzögerung in der Entwicklung zwischen den Stämmen beurteilen zu können, ein Mikroskop Live Cell Imaging Set-up mit dem automatisierten Stufensteuerung ist ein wichtiges Instrument. D. discoideum nutzt cAMP als wesentliche Signalmolekül während mehrerer Phasen des Lebenszyklus 1-4. Einer der Prüfpunkte, während der cAMP erforderlich ist, ist der Übergang von einer Zelle zur Bildung von vielzelligen Strukturen. Der Beginn der cAMP - Wellen nach ~ 6 Stunden von Hunger durch die Zellen gemessen wird und stellt die chemotaktischen Signal hin zu einem Aggregationszentrum 5 zu bewegen. Diese cAMPWellen können durch Pulsieren am Verhungern D. experimentell nachgeahmt werden discoideum Zellen mit cAMP alle 6,5 min über einen Zeitraum von 5 Stunden 8,9. Mit diesem Verfahren ist es wichtig, die Zellen zu verhungern bis die cAMP-Pulse bis 2h vor der Anwendung, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Unter Verwendung dieser Versuchsanordnung wir konnten zeigen, dass Coronin A zu zeigen , ist stromaufwärts von cAMP - Signalisierung wirkt, da diese extern angelegten Impulse die Entwicklung in CORA - defizienten Zellen gerettet (Abbildung 3 und 5). Diese Ergebnisse zeigen auch , dass während Coronin A erscheint in Abfühlen der frühen Verhungern Reaktion eine wesentliche Rolle zu spielen, ist es entbehrlich , für Prozesse wie Chemotaxis und Zellaggregation per se 10. Der Aggregationstest selbst ist ein robustes Verfahren für die frühe Entwicklung von Dictyostelium discoideum zu studieren. Es gibt jedoch mehrere Fallen, die die Reproduzierbarkeit dieser e beeinflussenXperiments, und es ist daher wichtig , dass mehrere Faktoren berücksichtigt werden: das Alter der Zellen eine wichtige Rolle spielt , wenn CORA - defizienten Zellen zu analysieren. Diese Zellen sind in der Regel den Phänotyp und Re-Aggregat nach ca. 2 Wochen ab dem Punkt, den sie aufgetaut sind, zu kompensieren. Die Dichte der Zellen ist ein entscheidender Faktor, wie gut, wie Zellen, die eine Signaldefekt zeigen und kein chemotaktische Defekt bei höheren Dichten zu der erhöhten Konzentration der frühen Hunger Faktoren aufgrund aggregieren dazu neigen könnten. Die Bedeutung der genauen Zählen und Verdünnung der Zellen in diesen Assays kann nicht genug betont werden. Für verschiedene Stämme eine Anpassung mehrerer Variablen des Assays, wie beispielsweise Zelldichten, die Zeit der Anhaftung, die Zeit der Entwicklung, werden benötigt. Der Aggregationsassay, wie hier beschrieben, ist eine vielseitige Technik, die modifiziert werden können, verschiedene Anfragen zu entsprechen: Die Zellen ausgehungert werden kann, oder die Entwicklung kann unter Verwendung verschiedener Verbindungen stimuliert oder inhibiert werden, allaufgrund einer spezifischen Modulation der Aggregation. Die hier beschriebenen Set-up ermöglicht auch unvoreingenommene Ansätze Stämme mit frühen Entwicklungsfehler zu identifizieren, sowie für die Identifizierung von Genen oder Faktoren, die für die frühe Entwicklung von Bedeutung sind. Dies ist auch der Hauptnachteil der Methode: Der Aggregationstest eine reduzierte Version des vollständigen Entwicklungszyklus ist. Daher ist es nicht geeignet für die Analyse von Phänotypen späteren Phasen des Entwicklungszyklus zu beeinflussen. Der Hauptvorteil ist die Möglichkeit, den Aggregationstest zu einem großen Maßstab und automatisierten Format zu übernehmen: in 48-Well-Platten und mit 16 Stunden der Entwicklung während der automatisierten Bildgebung, die Aggregationsassay aufgenommen erweist sich mehr Zeit und ressourceneffizienter zu sein als die Entwicklung auf Agarplatten. In Experimenten, in denen wir die frühen Verhungern Reaktion umgangen, extern angelegten cAMP Impulsen haben wir gezeigt, dass Coronin A in der Erfassungs von sekretierten Faktoren von &lt;beteiligt istem&gt; Dictyostelium - Zellen nach Hunger. Der genaue Mechanismus der Coronin A-vermitteltes Signalisieren während der frühen Verhungern Antwort bleibt unklar. Mehrere Faktoren während dieser Phase der Entwicklung insbesondere konditionierten Medium Faktor (CMF) 25,26 studiert haben beteiligt. Ob jedoch CMF wirkt für sich allein oder mit Co-Faktoren, bleibt unklar und ihre Signalkaskade ist nur teilweise verstanden. Mit der Aggregationskapazität von Dictyostelium - Zellen unter hier unter Wasser Bedingungen als positive Auslese für die Entwicklung beschrieben ermöglicht große Screening-Experimente in einer zeiteffiziente Art und Weise durchzuführen, wie zum Aggregationsassays auf Agarflächen verglichen. Allerdings Aggregationstests unter submersen Bedingungen zu tun haben den Nachteil, nicht den kompletten Entwicklungszyklus erfüllen als Zellen in der Anfangsaggregationsstufe werden verhaftet werden. Daher beschriebene Technik ist hier nicht geeignet für die Prüfung der späteren Entwicklungs processe. Zusammenfassend dokumentiert Der experimentelle Ansatz hier erlauben kann die weitere Charakterisierung von potentiellen frühen Verhungern Faktor (en), die Coronin A-abhängigen Eintritt in den frühen Verhungern Antwort induzieren.

Die Coronin Familie von Proteinen ist stark in ganz Eukaryoten konserviert. Diese Proteine ​​werden durch die Gegenwart eines Amino-terminalen Tryptophan-aspartat (WD) wiederholen haltigen Bereich , gefolgt von einer einzigartigen Region verbunden mit einem carboxy-terminalen coiled-coil Domäne 13,14 (Figur 1) charakterisiert. Coronine wurden in einer Vielzahl von zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich der Zytoskelett - Regulation und Signaltransduktion 12. Bei Säugetieren bis zu sechs kurze Coronin Moleküle (Coronin 1-6) sowie ein &quot;Tandem&quot; Coronin 7 können coexprimiert 12,15 werden. Coronin 1 ist das am intensivsten untersuchten Familienmitglied und wurde pathogen Zerstörung, T-Zell-Überleben und die neuronalen Signalübertragung beteiligt werden gezeigt. Wie genau Coronin 1 trägt diese Aktivitäten aus, bleibt unklar. Während Coronin 1 wurde gezeigt , Ca 2+ und cAMP-abhängige Signalgebung sowie F-Aktin - Zytoskelett Modulation 16-18, das Potential co zu regulieren-Ausdruck von bis zu 7 Familienmitglieder in Säugetieren hat es schwierig, das Molekular Funktion Coronine in diesen Systemen zu untersuchen, aufgrund potentieller Redundanzen. Im Gegensatz zu Säugetierorganismen exprimiert die niederen Eukaryoten Dictyostelium discoideum nur zwei Coronin Familienmitglieder (Coronin A, das Ortholog von Säugetier Coronin 1 und Coronin B, das Ortholog von Säugetier Coronin 7) mit scheinbar nicht-redundante Funktionen 15,19,20. Diese Tatsache macht Dictyostelium discoideum ein starkes Modell , um die Funktion von Coronine zu studieren. Um die Rolle von Coronin A in Dictyostelium discoideum studieren, induziert wir den Entwicklungszyklus durch Verhungern in Gewebekulturplatten mit ausgeglichener Salzlösung (BSS) Puffer entweder Wildtyp - Zellen oder Zellen mit fehlenden A 10 Coronin. Wir fanden heraus, dass Zellen ohne Coronin A waren nicht in der Lage mehrzelligen Aggregate auf Hunger zu bilden. Für eine genaue quantitative Beurteilung dieser Phänotyp derautomatisierte Live Cell Imaging in diesem Protokoll beschrieben ist ein wichtiges Instrument. Der Defekt in der Einleitung des frühen Verhungern Reaktion in Zellen Coronin A fehlt, kann durch Zuführen von Pulsen von cAMP gerettet werden, was darauf hindeutet, dass eine Akte vor der cAMP-Kaskade Coronin. Die exogene Applikation von cAMP Impulse für die Einleitung der Entwicklung zu simulieren wurde von mehreren Laboratorien in der Vergangenheit 8,9 verwendet worden. Jedoch ist dieses Verfahren auch in hohem Maße von Zelldichten und den Zeitpunkt bekannt sein. Daher beschrieben das Protokoll hier zum Ziel, diese Variabilitäten zu reduzieren, um ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Zusammengenommen sind die verwendeten Techniken in diesen Studien liefern robuste Werkzeuge Funktionen von Proteinen während der frühen Phasen des Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum zu untersuchen und haben das Potenzial , zu identifizieren Up- sowie Downstream - Effektoren einer Funktion Coronin.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HL-5 media (for 1L: 5 g proteose peptone, 5 g thiotone E peptone, 10 g glucose, 5 g yeast extract, 0.35 g Na2HPO4&#8727;2H2O, 0.35 g KH2PO4, 0.05 g dihydrostreptomycin-sulfate, pH 6.6)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiotone E peptone</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>211684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8727;2H2O</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydrostreptomycin-sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1954000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBM (0.02 M potassium phosphate, 10 &#956;M CaCl2, and l mM MgCl2, pH 6.1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>self made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSS (10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, pH 6.5)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>self made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-&#956;m Filtropure S filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 24-well Tissue culture plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-tissue-culture-plates-23/087721h">08-772-1H</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellobserver microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>custom built</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioVision software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC Microprocessor&#8211;controlled dispensing pump</td>
			<td>ISMATEC</td>
			<td>ISM 931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 135M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>491237-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Shaker</td>
			<td>Inforst HT Minitron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the function of coronin a in the early starvation response of dictyostelium discoideum by aggregation assays

Dictyostelium discoideum Amöbe sind im Boden und ernähren sich von Bakterien gefunden. Wenn Nahrungsquellen knapp werden, sie Faktoren absondern einen vielzelligen Entwicklungsprogramm zu initiieren, in denen 1-4 einzelne Zellen chemotax zur Aggregation Zentren. Dieser Prozess ist abhängig von der Freisetzung von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) 5. cAMP wird in Wellen durch die konzertierte Aktion der Adenylatcyclase und Phosphodiesterasen produziert und bindet an G - Protein-gekoppelten Rezeptoren cAMP 6,7. Ein weit verbreiteter Test die Mechanismen in dem Entwicklungszyklus des niederen Eukaryoten Dictyostelium discoideum beteiligt zu analysieren ist in submersen Bedingungen 8,9 auf der Beobachtung der Zellaggregation basiert. Dieses Protokoll beschreibt die Analyse der Rolle von Coronin A im Entwicklungszyklus durch Verhungern in Gewebekulturplatten unter Wasser in ausgewogener Salzlösung (BSS) 10. Coronin A ist ein Mitglied der weitgehend konservierten protein Familie von Coronine , die 11,12 in einer Vielzahl von Aktivitäten eine Rolle spielen . Dictyostelium Zellen ohne A Coronin sind unfähig mehrzelligen Aggregate zu bilden, und dieser Fehler kann durch Zuführen von Pulsen von cAMP gerettet werden, was darauf hindeutet , dass eine Akte stromaufwärts von der Coronin cAMP Kaskade 10. Die Techniken , die in diesen Studien beschriebenen liefern robuste Werkzeuge Funktionen von Proteinen während der Anfangsstadien des Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum stromauf der cAMP - Kaskade zu untersuchen. Daher erlauben die weitere Untersuchung der Coronin Eine Funktion und unser Verständnis der Biologie Coronin kann diese Aggregation Assay verwendet.

Die Zellen einen Mangel an einer Show einen Defekt in der frühen Entwicklung Coronin (Abbildung 2). In Abwesenheit von A - Zellen nicht in der Lage Coronin mehrzellige Aggregate zu bilden, die der erste Schritt während des Entwicklungszyklus von Dictyostelium discoideum ist. Daher erscheint Coronin A eine Rolle während der frühen Hungerantwort und / oder cAMP-Signalisierung zu spielen. Tatsächlich ist das Fehlen von mehrzelligen Aggregatbildung in Abwesenheit von Coronin A durch verringerte cAMP - Signalisierungs 10 begleitet. Allerdings stellt die Anwendung von exogenen cAMP Impulse vollständig die Wildtyp - Phänotyp (Abbildung 3). Dies impliziert , dass A Coronin, anstatt direkt in cAMP - Signalisierung, Funktionen stromaufwärts der Kaskade cAMP beteiligt sind (Abbildung 5). Wenn Dictyostelium - Zellen hungern Bedingungen ausgesetzt sind , induzieren sie die Sekretion von frühen Hunger 22,23 Faktoren. Eines der besten characterized Faktoren im frühen Hungerantwort beteiligt ist mittel Faktor (CMF) 22 konditioniert. Basierend auf unseren Ergebnissen, die Hypothese aufgestellt, dass Coronin entweder A die Sekretion dieser frühen Hunger Faktoren oder in der Signaltransduktion durch diese Faktoren ausgelösten reguliert. Um zwischen diesen beiden Effekten zu unterscheiden zu können wir Medium Experimente Anlage durchgeführt. Wildtyp- oder CORA - defizienten Zellen wurden entweder starved Wildtyp- oder CORA - defizienten Zellen Überständen ausgesetzt 10 (Abbildung 4). Diese Überstände sind potente Initiatoren von mehrzelligen Aggregatbildung und damit Faktoren enthalten, die Downstream-Entwicklungs-Signalwege initiieren, einschließlich cAMP-Signalisierung. Unsere Ergebnisse zeigen , dass Überstand von CORA - defizienten Zellen war gleichermaßen in der Lage Entwicklung zu induzieren , wie der Fall für Überstand von Wildtyp - Zellen (Abbildung 4) war. Dies hat zur Folge , dass CORA -defizienten Zellen sind in der Lage zu produzieren und zu früh Verhungern Faktoren auf ähnlichem Niveau zu ihren Wildtyp-Kontrollen absondern. Jedoch sind CORA - defizienten Zellen weder in der Lage, ihre eigenen Überstand noch zur Überstand von Wildtyp - Zellen (Figur 4) vorgesehen , zu reagieren. Daher scheint Coronin A in Signalwege durch frühe Verhungern Faktoren, anstatt ihre Expression / Sekretion 10 (Figur 5) induziert beteiligt. Im allgemeinen Lage sein , die Signale , die durch Verhungern Dictyostelium Zellen sezerniert weiter zu untersuchen, die den Entwicklungszyklus, die Aggregationsassay unter submersen Bedingungen ist ein potenter Auslese induzieren. Zellen, die bei höheren Dichten ausgesät werden spontan Aggregat aufgrund einer Fülle aller erforderlichen Signale. Bei niedrigeren Dichten 22,24 nur jedoch die Zugabe von konditioniertem Medium induziert zelluläre Aggregation (Figur 4) </sup&gt;. Daher kann dieses Verfahren verwendet werden, konditioniertem Medium zu fraktionieren und verschiedene Komponenten auf ihre Aktivität während der frühen Verhungern Reaktion studieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig1.jpg" /> Abbildung 1: Coronin Proteine ​​, die in Säugetieren und Dictyostelium discoideum Die Coronin Familie durch die Anwesenheit von N-terminal-repeat WD Regionen , gefolgt von einer einzigartigen Domäne und eine C-terminale Coiled Coil - Region gekennzeichnet.. Während Säugetiere 7 Coronin Proteine ​​(A) exprimieren, nur Dictyostelium discoideum enthält zwei Familienmitglieder (B), das Risiko der Redundanz macht weniger wahrscheinlich , wenn ihre Funktion zu studieren. Coronin A ist die ortholog von Säugetier Coronin 1 und Coronin B zeigt eine ähnliche Domänenstruktur wie Coronin 7. Abkürzungen: CC, Coiled-Coil-Domäne; UD, einzigartige Domain; WD wiederholt, Tryptophan<html> -Aspartat wiederholt. Länge wird für Maus - Sequenzen (A) in Aminosäuren (aa) angegeben. Geändert von Pieters et al., 2013 12. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53972/53972fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53972/53972fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig2.jpg" /> Fig . 2: CORA - Dictyostelium discoideum sind nicht imstande , während des frühen Verhungern Antwort zu aggregieren Wildtyp (A) oder CORA defizienten (B) Dictyostelium Zellen wurden in Mikrotiterplatten in einer Dichte von 2 x 10 5 Zellen / cm 2, ausgehungert in BSS, und über einen Zeitraum von 20 Stunden abgebildet. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m..jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig3.jpg" /> Abbildung 3: Äußerlich angewendet cAMP - Impulse die frühe Entwicklungsstörung von CORA retten - Dictyostelium discoideum Vegetative Wildtyp (A und B) und CORA - defizienten Zellen (C und D) wurden gewaschen und für 2 Stunden ausgehungert , bevor sie mit gepulst (B. und D) oder ohne (A und C) 50 nM cAMP während 5 Stunden alle 6,5 min in Suspension. Die Zellen wurden dann gewaschen und in BSS resuspendiert und bei einer Dichte von 10 x 10 4 Zellen / cm 2 auf eine Petrischale gelegt. Bilder wurden 20 h nach dem Aussäen der Zellen genommen. Maßstabsbalken = 100<html> um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53972/53972fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53972/53972fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig4.jpg" /> Abbildung 4: CORA -Mangel Dictyostelium discoideum sind in der Lage , alle erforderlichen Faktoren für Entwicklungs Induktion zu erzeugen , sind aber nicht in der Lage, darauf zu reagieren Exponentiell wachsende Wildtyp und CORA - defizienten Zellen wurden in PBM gewaschen und entkernt in Multiwell - Platten mit einer Dichte von (. 5, 10, 20, oder 40) x 10 4 Zellen / cm 2, konditioniertes Medium aus Wildtyp (A) oder CORA - defizienten hungernde Zellen (B) erhalten inkubiert. Die Bilder wurden 16 h genommen, nachdem die Zellen der Aussaat. Maßstabsbalken = 100 &amp; mgr; m.tp_upload / 53972 / 53972fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53972/53972fig5.jpg" /> Abbildung 5:. Aktuelle Modell Coronin Eine Funktion in Dictyostelium discoideum Coronin A in der Signaltransduktion von Faktor beteiligt ist (n) während der frühen Hunger Reaktion abgesondert auf die Induktion der cAMP - Kaskade und die Progression durch den Entwicklungszyklus führt. Geändert von Vinet et al., 2014 10. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53972/53972fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53972/53972fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays at JoVE.com

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

Die Untersuchung der Funktion von Coronin A in der frühen Starvation Reaktion von<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Durch Aggregationstests

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

investigating-function-coronin-early-starvation-response

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

7.2K Aufrufe.  University of Basel. The social amoeba Dictyostelium discoideum undergoes a developmental transition into a multicellular organism when starved. The evolutionary conserved protein coronin A plays a crucial role in the initiation of development. Using aggregation assays as our main method, we aim to elucidate the role of coronin A in early development.

Serie: Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Investigating the Microbial Community in the Termite Hindgut - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes. The symbiotic relationship existing between the host insect and lignocellulose-degrading gut microbes is explained, as well as the industrial uses of these microbes for degrading plant biomass and generating biofuels.

Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft in der Termite Enddarm - Interview

Jared Leadbetter explains why the termite-gut microbial community is an excellent system for studying the complex interactions between microbes.     The ...

Forschung

Biologie

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Mit der optokinetischen Reaktion auf visuelle Funktion des Zebrafisch-Studie

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Tracking Morphogenetic Tissue Verformungen in der frühen Hühnerembryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Mess-Cation Transport von Na, K-und H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mittels Atomabsorptionsspektrometrie: Eine Alternative zu Radioisotopen Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

In-vitro-Assays mit Aggregation hyperphosphoryliertem Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...