Name: quantitative analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos
Uploaded: 2016-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
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The authors would like to thank Stefano Di Talia, Alberto Puliafito, Venkatraman Seshan and Panagiotis Xenopoulos, for input on data handling, analysis and representation, Berenika Plusa for assistance in the design of the immunofluorescence protocol and antibody testing and members of the Hadjantonakis lab for comments on the manuscript and on the development of this protocol. Work in our lab is supported by the National Institutes of Health R01-HD052115 and R01-DK084391, and by NYSTEM N13G-236.

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	<li>Saiz, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cell+fate+decisions+in+the+mouse+embryo.">Early cell fate decisions in the mouse embryo.</a> Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).</li><li>Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+a+blastocyst:+cell+behaviors+driving+cell+fate+choice+and+morphogenesis+in+the+early+mouse+embryo.">Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo.</a> Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).</li><li>Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+cell+allocation+to+trophectoderm+and+inner+cell+mass+in+the+mouse+blastocyst.">A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst.</a> Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).</li><li>Dietrich, J. -. E., Hiiragi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+patterning+in+the+mouse+pre-implantation+embryo.">Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo.</a> Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).</li><li>Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -. 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A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+formation+of+the+first+two+distinct+cell+types+of+the+inner+cell+mass+in+the+mouse+embryo.">Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).</li><li>Artus, J., Panthier, J. -. J., Hadjantonakis, A. -. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF4+is+required+for+lineage+restriction+and+salt-and-pepper+distribution+of+primitive+endoderm+factors+but+not+their+initial+expression+in+the+mouse.">FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse.</a> Development. 140 (2), 267-279 (2013).</li><li>Bessonnard, S., De Mot, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata6,+Nanog+and+Erk+signaling+control+cell+fate+in+the+inner+cell+mass+through+a+tristable+regulatory+network.">Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network.</a> Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).</li><li>Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , (2014).</li><li>Czechanski, A., Byers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cell+lineage+specification+in+a+marsupial:+a+case+for+diverse+mechanisms+among+mammals.">Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals.</a> Development. 140, 965-975 (2013).</li><li>Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Fr&#246;din, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitotic+progression+and+preimplantation+lethality+in+mice+lacking+OMCG1,+a+new+evolutionarily+conserved+nuclear+protein.">Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein.</a> Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).</li><li>Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+protein+kinase+C+couples+cell+sorting+with+primitive+endoderm+maturation+in+the+mouse+blastocyst.">Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst.</a> Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode, um eine quantitative Analyse von Vollmontage Immunfluoreszenz auf Präimplantationsstadium Mausembryonen durchzuführen. Eine robuste Immunfluoreszenz-Protokoll 22 durch hochauflösende folgt, ganze-mount konfokaler Bildgebung und durch Bildsegmentierung ein maßgeschneidertes Stück Software 4 verwenden. Während die Wahl von Immunfluoreszenz-Protokoll nicht kritisch ist, finden wir das hier 22 präsentiert eine schnelle, zuverlässige, und wir getestet haben, für viele der Antikörper robust Signal zu liefern. Andere Protokolle eingehalten werden können, sofern ihre Anwendung konsistent Äquivalent Experimente ist. Während viele Faktoren, die das Ergebnis eines jeden Versuchs, und einen direkten Vergleich zwischen den Experimenten ist nicht unbedingt möglich beeinflussen, haben wir, dass über Wiederholungen für Konsistenz Streben gefunden und ausreichende technische Replikate stark reduziert Variabilität durchführen. Sobald daher optimiert, Fixierung und immunolabeling Reagenzien und Protokolle sowie Abbildungsbedingungen sollte konstant zwischen äquivalenten Experimenten gehalten werden. Die Hauptprobleme, die bei der Anwendung dieses Protokolls lassen sich in zwei Gruppen auftreten: 1) schlechte Qualität der Färbung mit schwachem Signal, und 2) suboptimal Segmentierung, mit vielen Fehlern (dh Über- und Untersegmentierung). Niedrige Qualität Immunfluoreszenz ist in der Regel durch unsachgemäße Fixierung der Proben oder die Antikörper nicht geeignet ist für ganze-mount Immunfluoreszenz. Stellen Sie sicher, PFA ist frisch (entweder frisch zubereitet oder aufgetaut RT von -20 ° C nicht mehr als eine Woche vor). Angesichts der geringen Größe der Präimplantationsembryonen, 10-Minuten-Fixierung in PFA sollte ausreichen. Allerdings haben wir bestimmte Antikörper zu ergeben ein stärkeres Signal mit mehr Fixationszeiten (siehe Materialien) gefunden. Wenn ein Antikörper, der vorher getestet wurde schwaches Signal liefert, versuchen verschiedene Fixierung Protokolle. Nicht alle Antikörper führen kräftig auf Vollmontage immunofluorescence und die Auswahl des primären Antikörpers ist für das Ergebnis des Experimentes kritisch. Neue Antikörper sollte empirisch an Embryonen und die optimale Konzentration bestimmt getestet werden. In der Material Grafik stellen wir Details aus einer Anzahl Antikörpern wir getestet haben und routinemäßig verwenden. Finden Sie auf der veröffentlichten Literatur und den Angaben des Herstellers, wenn neue Antikörper berücksichtigen. Beachten Sie, dass nicht alle Antikörper für Western-Blot-Arbeit in der Immunfluoreszenz ganze Montage und die Konzentrationen, die für Immunfluoreszenz kann bis zu eine Größenordnung höher. Kommerzielle Sekundärantikörper arbeiten in der Regel gut aus der Box, aber bei der Verwendung von Primär-Sekundär-Antikörper-Kombinationen in ganz gleichwertig Experimente im Einklang stehen, die im Vergleich zu gehen. Die Qualität der Bildsegmentierung hängt sowohl von der Qualität des Kernfärbung und auf der Kerndichte in der ICM des Embryos. Immer bestrebt, für helle,scharfen Kerne und mit einem hochauflösenden Objektiv (40X oder mehr). Wenn die Kernfärbung Signal niedrig ist, verwenden Sie einen aliquoten Teil oder eine neue Charge. Solange die Kernfärbung nicht für die Quantifizierung verwendet wird, können die Aufnahmeparameter für jeden Embryo eingestellt werden, um scharfe, helle Kerne zu erfassen. Ebenso, wenn ein anderer Kanal als der Kernfärbung für die Segmentierung verwendet wird, das Signal-zu-Rauschverhältnis des jeweiligen Kanals werden die Qualität der Segmentierung bestimmen. Spätstadium Blastozysten (E4.0 an) stellen eine sehr hohe Keimdichte innerhalb des ICM. Daher ist es bei dieser Stufen, die qualitativ hochwertige Färbung kritischsten ist. Dennoch Segmentierung Fehler findet meistens in diesen Phasen. Führen Sie die geschätzte Kerndurchmesser und das Bildrauschen Ebene auf der MIN-Pipeline, zu erforschen, die Ergebnisse jeder Schritt mit der &quot;Ansicht&quot; Taste und stellen Sie die Parameter, bis ein zufriedenstellendes Ergebnis erzielt wird. Mit den Parametern, die die beste Segmentierung erzeugenund manuell korrigieren Fehler bei der Datenverarbeitung. Beachten Sie, dass die späten Stadium Embryonen (~ E4.5) eine hohe Zellzahl und der manuellen Datenkorrektur wird sehr zeitaufwendig sein. Die Grenzen dieses Protokolls werden von dem konfokalen Mikroskopsystem für die Bilderfassung verwendet wird, bestimmt. Wie diskutiert, eine hohe Vergrößerung Ziel verwenden, mit einem Arbeitsabstand, der Z-Achsen-Bildgebung des gesamten Embryos (preimplantation Mausembryonen erreichen kann auf 150 - 160 um im Durchmesser) ermöglicht. In ähnlicher Weise wird die Anzahl der Epitope, die erkannt werden kann, kann das Mikroskop sofort erwerben durch die Anzahl der Kanäle bestimmt werden. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden drei verschiedene Epitope neben der DNA (4 Kanäle insgesamt) auf jeder Probe gleichzeitig markiert werden. Sicherstellen, dass das Gerät für jeden Fluoreszenzkanal kalibriert wird, wird das Gating optimiert und daß die Laserausgangsleistung entspricht. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen die Analyse von Zell Position entlang derXYZ-Achsen sowie die Quantifizierung der Proteinexpressionsniveaus in situ für jede einzelne Zelle in Maus-Blastozysten. Nach unserer Erfahrung können alternative Verfahren jede andere verfügbare Software, die nicht die Höhe der Auflösung liefern, die die Pipeline in diesem Protokoll angewandt (4 für einen direkten Vergleich mit anderen Werkzeugen zu sehen). Die hohe Keimdichte in der ICM der Blastozyste gefunden verursacht andere Werkzeuge so viele Fehler zu erzeugen, die das Ausmaß der erforderlichen manuellen Korrektur macht ihre Verwendung unpraktisch. Alternativ wurden manuelle Zellzählung und Fluoreszenzmessungen zuvor für Teilmengen von Zellen oder bestimmten Regionen des Embryos 10,11,18,19,24 verwendet. Jedoch manuellen Zählung und Messung aller Fluoreszenzkanäle und die Zellposition, in allen XYZ Achsen, für die Zehn Zellen in jedem Embryo wäre so zeitraubend, dass es nicht für die Hochdurchsatzanalyse, für die unsere Protokoll erlauben würde, entwickelt wurde . Außerdem Handbuch einBEWERTUNG Fluoreszenzniveaus ist anfällig für Verzerrungen, während eine Rohrleitung, wie beispielsweise die hier beschriebenen für die nachfolgende Bestimmung der Zellenidentität, eine objektive Messung der Fluoreszenzintensitäten erlaubt. Um Zell Identitäten zuweisen, sollte der Prüfer einen Standard-Kriterium festzulegen, in allen Proben für einen bestimmten Versuchsaufbau angewendet werden. Angesichts der unterschiedlichen Faktoren - biologischen und technischen -, die das Ergebnis der Immunmarkierung beeinflussen kann, sollte dieses Kriterium entsprechende Kontrollexperimente mit bestimmt werden und zuvor veröffentlichten Daten, wo immer möglich. Wir stellen uns eine nahe Zukunft, in der ein Algorithmus kann unabhängig von dem Experiment zur automatischen Bestimmung der Zellidentität entworfen werden. Allerdings ist ein solches Werkzeug wird nur von umfassenderen Anwendung und Verbesserung der derzeitigen Verfahren kommen, wahrscheinlich in Verbindung mit Algorithmen des maschinellen Lernens. Schließlich die Einfachheit dieser Pipeline und die stereotype Morphol gegebenlogie der Maus Präimplantationsembryonen ist dieses Protokoll einfach skalierbar für die Analyse einer großen Zahl von Embryonen, so Hochdurchsatz-Analyse von null Phänotypen 5,6 oder andere experimentelle Manipulation 7 ermöglicht. Schließlich, während die aktuelle Protokoll wurde für die Analyse von preimplantation Mausembryonen und ESC Kolonien und optimiert ausgelegt, sehen wir keinen Grund, von vornherein, warum es nicht auf andere Systeme mit ähnlichen Merkmalen angewendet werden könnte - nämlich hohe Keimdichte. Wir ermutigen andere dieses Protokoll auf andere Szenarien zu experimentieren und sich anpassen und Feedback für die künftige Verbesserung bieten.

Die Maus preimplantation Embryo ist ein Paradigma die Entstehung und Aufrechterhaltung von Pluripotenz in vivo zu untersuchen, sowie ein Modell für die Untersuchung von Zellschicksal Spezifikation und de novo Epithelisierung in Säugetieren. Die preimplantation Stadien der Entwicklung von Säugetieren sind für die Errichtung der drei Zelllinien her, die zur Blastozyste ausmachen, nämlich die pluripotenten Epiblasten -, die zu den meisten somatischen Geweben und Keimzellen gibt - und zwei extraAbstammungsLinien, die Trophektoderm (TE) und der primitive Endoderm (PRE) (1A) 1,2. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren (1) Ernte und Präimplantationsstadium Mausembryonen zu beheben, (2) durchführen Immunfluoreszenz-Proteine ​​von Interesse zu kennzeichnen, (3) durchzuführen ganze-mount-Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop mit z-Schnittfunktionen verwenden und (4) Kern Segmentierung von konfokalen Bildern durchführen und die anschließende quantitative Bildanalysen. Diese Pipeline erlaubt ter unvoreingenommene Messung der Proteinspiegel für die Zuordnung von Zellidentitäten Subpopulationen von Zellen in situ zu charakterisieren. Für einen einzigen Wurf (in der Regel bis zu 10 Maus-Embryonen) vor 4 Tagen, von Embryo-Entnahme zur Datenanalyse (Abbildung 1B) - Dieses Protokoll kann in weniger als 3 durchgeführt werden. Die gleichzeitige Analyse mehrerer Würfe würde die Bildgebung und Datenanalysezeit Belastung erhöhen, wodurch die Gesamtlänge des Protokolls erstreckt. Die Präimplantationsstadium Mausembryo ist ein experimentell handhabbar System, das aufgrund seiner geringen Größe und stereotypen Morphologie 3, geeignet ist, auch für in toto Imaging von zellulären Prozessen mit Einzelzellauflösung. Um eine unvoreingenommene, Systemebene Analyse einer statistisch relevanten Anzahl von Embryonen durchgeführt werden, eine automatisierte, ist die quantitative Analyse Pipeline wünschenswert. Aufgrund der hohen Kerndichte von der inneren Zellmasse (ICM) von Blastozysten ( <stRong&gt; 1A, 2A), versagen herkömmliche Bildsegmentierung Plattformen ausreichender Genauigkeit, um eine automatische oder halbautomatische Arbeitsablauf zu schaffen. Auf der anderen Seite, manuelle Segmentierung, während genau, erlaubt es nicht, die Verarbeitung großer Kohorten von Zellen und Embryonen, noch ist es geeignet für eine reproduzierbare, objektive Bestimmung von Zellidentitäten - was besonders wichtig ist, wenn Entwicklungsstadien studiert, wo Muster von Marker Ausdruck noch nicht vollständig gelöst (zB keine binäre Distribution über eine Bevölkerung aufweisen). Wir haben vor kurzem ein Bild Segmentierungsverfahren zugeschnitten für Maus Präimplantationsstadium Embryonen und embryonalen Stammzellen der Maus (ES-Zellen), die eine hohe Genauigkeit erreicht, während erfordert nur minimalen Benutzereingaben 8.4 entwickelt und validiert. Die Analyse Pipeline hier vorgestellten dreht sich um die MATLAB-basierte Bildsegmentierung Werkzeug Modular Interactive Kernsegmentierung (MIN) 4. MINS performs unbeaufsichtigt Kernsegmentierung auf große Chargen von konfokalen Z-Stapel, nachdem der Benutzer eine minimale Anzahl von Bildeigenschaften hergestellt ist, eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) (Tabelle 1) 4 verwendet wird. Diese Pipeline effizient zur Erzeugung von Hochdurchsatz-Daten auf die Proteinexpression und Zellortung sowohl in Wildtyp erwiesen hat, experimentell behandelt und genetisch Embryonen und WSR 7.5 geändert. Im vorliegenden Protokoll beschreiben wir die Anwendung von Minuten, um die Segmentierung von preimplantation stufigen Embryo Bilder. Beispiele für MINS Leistung auf WSR verweisen wir auf 4,7. Die automatisierte Kernsegmentierungsschritt reduziert die zeitliche Belastung der Zelle Identifikationsprozess, während die räumlichen und Fluoreszenzintensitätsmessungen eine unvoreingenommene Bestimmung von Zellidentitäten und die Erzeugung von dreidimensionalen Karten der Genexpression Domänen und Zellenposition in dem Embryo (Abbildung ermöglichen 1C </strong&gt;). Darüber hinaus ermöglicht die Skalierbarkeit dieses Workflows anwendbar es um die Analyse der einzelnen Würfe durch die großen Kohorten von experimentell behandelten Embryonen oder Embryonen von unterschiedlichen genetischen Hintergründe 5,6. MIN ist bei http://katlab-tools.org (die Software erfordert eine MATLAB Lizenz) frei verfügbar. Kein Ansatz bis heute entwickelt erlaubt die Erzeugung solche eingehende Daten auf die Proteinexpression und Zellortung in Maus Präimplantationsembryonen. Alle Versuche, die bisher in dieser Art von Daten zu quantifizieren sind für verschiedene Bevölkerungsgruppen in den Embryo (entweder völlig manuell oder softwaregestützt) 9-19 auf die manuelle Ermittlung und Quantifizierung von Zellzahlen beschränkt. Dieser Ansatz (unter Einbeziehung der MIN-Software) wurde auf Maus Präimplantationsembryonen und WSR zugeschnitten für und getestet; trotzdem seine Leistung auf anderen Systemen mit hoher Atomdichte, obwohl noch nicht erprobt, wird voraussichtlich gleichwertig zu sein.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Embryo collection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunt probe for plug checking</td><td>Roboz</td><td>RS-9580</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>Surgery scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipettes</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Pre-assembled aspirator tube &amp;amp; mouthpiece</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Longer rubber tubing</td><td>Fisher</td><td>14-178-2AA&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>M2</td><td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>FHM</td><td>Millipore</td><td>MR-024-D</td><td></td></tr><tr><td>Acid Tyrode&#039;s solution</td><td>Millipore</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>4-well plates</td><td>Nunc/Thermo-Fisher</td><td>12-566-300&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunofluorescence&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom plates</td><td>Fisher</td><td>14-245-73</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Sigma</td><td>H0146</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;strong&gt;Concentration&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CDX2</td><td>Biogenex</td><td>AM392-5M</td><td>1:200</td></tr><tr><td>GATA6</td><td>R&amp;amp;D</td><td>AF1700</td><td>1:100</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9053</td><td>1:100, 10 min fixation</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1237</td><td>1:100, O/N fixation</td></tr><tr><td>SOX17</td><td>R&amp;amp;D</td><td>AF1924</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>1:500</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:100, 10 min to O/N fixation</td></tr><tr><td>DAB2</td><td>BD</td><td>BD-610464</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td>Life Technologies</td><td>Various</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Imaging&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Segmentation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer running 64-bit Windows OS</td><td></td><td>n/a</td><td>Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports</td></tr><tr><td>MATLAB (software)</td><td>Mathworks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MINS (software)</td><td>Free</td><td>n/a</td><td>http://katlab-tools.org</td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos

Dieses Protokoll stellt ein Verfahren, in situ quantitative Einzelzellexpressionsanalysen von Protein durchzuführen Abstammung Spezifikation zu studieren in Maus Präimplantationsembryonen. Die Verfahren, die für die Embryo-Entnahme, Immunfluoreszenz-Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop und Bildsegmentierung und Analyse beschrieben. Dieses Verfahren erlaubt die Quantifizierung der Expression von mehreren Kernmarken und die räumliche (XYZ) Koordinaten aller Zellen im Embryo. Es nutzt MINS, einer Bildsegmentierung Software-Tool speziell für die Analyse von konfokalen Bildern von Präimplantationsembryonen entwickelt und embryonalen Stammzellen (ESC) Kolonien. MINS trägt über den X, Y unbeaufsichtigt Kernsegmentierung und Z Abmessungen und erzeugt Informationen über die Zellposition im dreidimensionalen Raum sowie Kernfluoreszenz Ebenen für alle Kanäle mit minimalem Benutzereingabe. Während dieses Protokoll wurde für die Analyse der Bilder optimiertein gutes Signal-Rausch-Verhältnis und bei denen eine hohe Keimdichte stellt eine Hürde für die Bildsegmentierung von Präimplantationsstadium Maus-Embryonen, kann es leicht auf die Analyse von allen anderen Proben angepasst werden ausstellenden (z. B. Expressionsanalyse von embryonalen Stammzellen (ESC ) Kolonien, Zellen in Kultur, Embryonen von anderen Arten oder Stadien, etc.) zu differenzieren.

Zur Interpretation der Daten und Präsentation zu erleichtern, sollte darauf geachtet werden, nicht die Embryonen während der Entnahme und Manipulation zu beschädigen, so dass alle Zellen und ihre relative Position analysiert werden 2A -. D zeigt Beispiele von intakten Blastozysten in unterschiedlichen Stadien mit einem erweiterten Hohlraum. Sollten Schäden auftreten, sollte besonders darauf geachtet werden, bei der Analyse und Interpretation der Ergebnisse. Die Qualität und Zuverlässigkeit der dieses Protokoll erzeugten Daten ist abhängig von der Qualität der Fixierung und auf dem Signal-zu-Rausch-Verhältnis der verwendeten Antikörper die Proteine ​​von Interesse zu detektieren. Immer frisch Fixiermittel verwenden und neue Antikörper zu testen, mit den entsprechenden positiven und negativen Kontrollen, bevor sie eine Reihe von Experimenten beginnen. 2A zeigt Beispiele guter Antikörper für eine Reihe von Kernproteinen. 2B zeigt eine example eine gute Antikörpers nach einem cytoplasmatischen Protein (DAB2). 2C zeigt ein Beispiel für eine schlechte Färbung mit niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis, wo die Probe für 10 min fixiert. In diesem Fall ist das verwendete Antikörper für GATA4 (Santa Cruz, sc-1237) erfordert O / N Fixierung ein starkes Signal zur Verfügung zu stellen (siehe 24 für Fälle von Embryonen fixiert O / N und gefärbt mit diesem Antikörper). Eine Erhöhung der Signalpegel während der Nachbearbeitung zeigt eine sehr laut Bild. Im Gegensatz dazu stellt die anti-GATA4 verwendet für 2A (sc-9053) hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis nach 10-min Fixierung. Details für diese und andere robuste Antikörper werden in dem Abschnitt Materialien zur Verfügung gestellt. Die begrenzenden Faktoren für eine gute MINS Segmentierung sind a) die Vergrößerung des Objektivs zur Bilderzeugung verwendet wird, b) die Z-Auflösung und c) die Qualität des Kernfärbung. 2D Beispiele von Embryonen mit einem oi abgebildet zeigtl Tauch 40X-Objektiv mit einer NA von 1,30 und einer 0,21 mm WD. Mittelplatten zeigen Vergrößerungen der ICMs wo einzelne Kerne und die Grenze zwischen ihnen unterschieden werden kann. Ist dies nicht der DNA-Färbung mit (dh., Hoechst, DAPI, TO-PRO3, YO-YO1, etc.) Fluoreszenzwerte für die Quantifizierung, Aufnahmeparameter können individuell eingestellt werden, um das beste Signal zu erhalten. Bodenplatten zeigen, wie die weitere, den Embryo fortgeschritten, desto höher die Kerndichte und damit je höher die Wahrscheinlichkeit des Segmentierungsfehler (Pfeilspitze und Pfeil), Fig. 3 Beispiele von Fehlern zeigt, die MINS kann, wie beispielsweise Nachweis apoptotischer Kerne als lebende Zellen commit ( Sternchen in Platten in Abbildung 3Aa, Ab, Ad), über~~POS=TRUNC (Pfeil und Pfeilspitzen in Abbildung 3Ac) oder unter-Segmentierung (Pfeil in Bild 3Ad). 3B zeigt eine Folge von Z-Scheiben einer unter-Segmentierung Ereignis, wo zwei Zellen wurden als eine identifizierte. Man beachte, wie MINS Segmentierung der Z-Achse Rechnung zu Segment nimmt ein Volumen, das alle Scheiben umfasst, wo eine gegebene Zelle vorhanden ist. Schließlich werden die Einzelheiten der Datenanalyse auf die Frage untersucht abhängen wird daher Leitlinien für den Analyseprozess kann hier nicht gegeben werden. Wir haben jedoch bestimmte Anfangsdatentransformationen gefunden nützlich sein 4B -.. D zeigt Plots der Fluoreszenzwerte für die Marker NANOG und GATA6 in der ICM des Embryos in 4A gezeigt 4B zeigt die rohen Fluoreszenzwerte erhalten aus MINS (nach manueller Korrektur von Unter- und über~~POS=TRUNC). 4C die gleichen Daten nach einer logarithmischen Transformation zeigt, die die Werte vom Grundstück trennt Achsen (a Quadratwurzel Transformation auch möglich und führt zu einem ähnlichen Grundstück). 4d zeigt die gleichen Daten nach automatisch correcting die Werte für den Z-assoziierten Dämpfung der Fluoreszenz, wie in Schritt 4.5.2.2 des Protokolls erläutert. Beispiele dieser Z-assoziierten Fluoreszenzabklingzeit sind in der Abbildung in 4E gegeben und der Stellplätze in 4F. 4G zeigt die Wirkung der Datentransformation in 4.5.2.2 beschrieben. Farben, die entweder Epiblasten (rot, NANOG +, GATA6-) oder vorge (blau, NANOG-, GATA6 +) Identität haben für die Handlung als eine Funktion der NANOG und GATA6 Werte hinzugefügt. In diesem speziellen Beispiel, Zellen, in denen das Verhältnis von log [GATA6] / log [NANOG]&gt; 1,25 wurden als Pre, Zellen, in denen das Verhältnis von log [GATA6] / log [NANOG] &lt;1 EPI wurden geprüft und Zellen mit einem Zwischen Verhältnis wurden nicht festgeschriebene (in diesem Fall keiner) betrachtet. Alle Datentransformationen und Plots sind in Rstudio jedoch geschehen ist, ist die Wahl der Software nicht kritisch und hängt von der Endbenutzer abhängen. <img alt= &quot;1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53654 / 53654fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1. Embryo Ort, Timeline und Analyse Pipeline. (A) Schematische Darstellung einer (von zwei) Maus Uterushorn und die Stufen der Präimplantationsentwicklung, ausgerichtet mit der Region des Horns, wo sie gefunden werden sollte. (B) Versuchszeitachse mit Timing für jeden Schritt. Schritte des Protokolls und Pausenpunkte (blau) angedeutet. (C) Zusammenfassung der Bildaufnahme und Analyse-Pipeline MIN. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53654/53654fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53654/53654fig2.jpg" /> Abbildung 2. Beispiele für Immunfluoreszenz und Atomdichte. (A) Beispiele für gute Immunfluoreszenz Ergebnisse mit getesteten Antikörper für Nuklear transcription Faktoren. Anti-CDX2 mit einem AlexaFluor 488 Esel sekundären Antikörper, Anti-GATA6 Anti-Maus mit einem AlexaFluor 568 Esel-Anti-Ziegen, Anti-NANOG mit einem AlexaFluor 647 Esel-Anti-Kaninchen, Anti-GATA4 (Santa Cruz, sc-9053 erkannt wurde ) mit einem AlexaFluor 488 Esel-Anti-Kaninchen und anti-OCT4 mit einem AlexaFluor 647 Esel anti-Maus. Alle primären Antikörper sind in der Werkstoff-Tabelle aufgeführt. Zytoplasmatischen GATA4 Kernfärbung ist nicht-spezifisch und scheint auch in Gata4 null Embryonen (nicht gezeigt). (B) Beispiel für gute Immunfluoreszenz für eine zytoplasmatische Protein, DAB2. Es wurde unter Verwendung eines AlexaFluor 488 Esel anti-Maus erkannt. (C) Beispiel für schlechte Immunfluoreszenz mit einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis für einen Kernfaktor. Und einer AlexaFluor 568 Esel anti-Ziege; GATA4 hat mit einer Anti-GATA4 aufgewachsen in Ziegen (während SC-9053 (Kaninchen anti-GATA4) verwendet in (A) Santa Cruz, sc-1237) festgestellt worden. ( <strong&gt; D) Beispiele für intakte Embryonen mit guten Kernfärbung zeigt, wie Kerndichte steigt mit Embryo Alter und wie diese Fehler in Min Segmentierung (Pfeilspitze erhöht - Übersegmentierung - und Pfeil - undersegmentation). Maßstab = 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53654/53654fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/53654/53654fig3.jpg" /> Abbildung 3. Beispiele für MINS Errors. (A) Folge von einzelnen Z-Abschnitte von einem Embryo Beispiele MINS Segmentierungsfehler zeigt. Apoptotische Zellen, die dennoch die als Kerne sind mit einem Stern (*) in Platten a, b und d. In Feld B, ID # 39 (Pfeilspitze), wenn auch sehr klein, die entsprechende Kern ist identifizieren und somit unkorrigiert gelassen werden kann. In Feld C, ID # 66 (Pfeil) erstreckt sich über zwei unterschiedliche nuclei, was wiederum wurden getrennt ausgewiesen (Pfeilspitzen, IDs 65 # # 54 und # 53). In Panel d, zwei Zellen (ID # 63) wurden als ein einziges identifiziert (siehe Pfeilmarkierung die dünne Grenze) und diese Platte sollte daher zur Zellzählung Zwecke vervielfältigt werden. (B) MINS erkennt Zellen entlang der Z-Achse. Die Abbildungen zeigen eine Abfolge von Z-Scheiben von zwei Zellen, die irrtümlicherweise als ein einziges (# 123) erzielt wurden. Beachten Sie, wie der blaue Bereich begrenzen die Kerne entlang Z. kontinuierlich ist <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53654/53654fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53654/53654fig4.jpg" /> Abbildung 4. Beispiel einer Segmentierung und Transformieren von Daten. (A) Bilder von ICM-Zellen der Blastozyste gefärbt NANOG und GATA6 und Momentaufnahme der Atom Segmentierung des gleichenEmbryo mit Hilfe Minuten mit der Kernfärbung Kanal (Hoechst 33342). (BD) NANOG und GATA6 Fluoreszenzwerte in ICM-Zellen durch MINS gemessen aufgetragen als Rohdaten (B), nach logarithmischer Transformation Durchführung (C) und nach der Werte für die Fluoreszenzabklingzeit entlang der Z-Achse zu korrigieren und automatisch die Zuordnung Zelle Identitäten auf der Grundlage der korrigierten Werte (D). (E - G) Beispiele für Datenkorrektur für Fluoreszenzabklingkurve entlang der Z-Achse. (E) Bilder einer Blastozyste mit Hoechst beschriftet und anti-CDX2 + AlexaFluor 488 (AF488), Fluoreszenz-Abnahme entlang der Z-Achse zeigt. (F) Streudiagramme von Fluoreszenzwerte entlang der Z-Achse für Hoechst und AF488 für einen Pool von Embryonen einschließlich der in (E) gezeigt. Graue Linie stellt für jeden Satz der Werte der Regressionskurve. (G) Gleiche Daten wie in F nach für jede Zelle Fluoreszenzabklingkurve Ausgleichsmit dem folgenden Faktor: Z-Koordinate * die Steigung des linearen Modells (Schritt 4.5.2.2 im Protokoll sehen). Panels E - G wurden ursprünglich von den Autoren in der Knoten veröffentlicht (http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/) Jeder Punkt steht für eine Zelle. Maßstab = 20 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53654/53654fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Benutzereingabe </td></tr><tr><td> Helligkeitsschwelle * (erleichtert Kernerkennung bei schwachem Bilder) </td></tr><tr><td> Relative X / YZ Auflösung </td></tr><tr><td> Kanal zu segmentieren </td></tr><tr><td> Kerndurchmesser </td></tr><tr><td> Das Bildrauschen Ebene </td></tr><tr><td> MIN Output </td></tr><tr><td> Segmentierung Z-Stapel mit nuclei-IDs </td></tr><tr><td> Kernvolumen </td></tr><tr><td> XYZ-Koordinaten für jeden Kern </td></tr><tr><td> Durchschnittliche und Summation der Fluoreszenzwerte für jeden Fluoreszenzkanal und Kern </td></tr><tr><td> Vorteile </td></tr><tr><td> Genaue Segmentierung (&gt; 85%) der Kerne im ganzen Stapel - erkennt alle Vorkommen eines Kerns in benachbarte Z-Profile </td></tr><tr><td> Einzelzellauflösung </td></tr><tr><td> Unüberwachten Segmentierung von Chargen von Embryonen </td></tr><tr><td> Segmentierung Pipelines kann entweder gespeichert und wiederverwendet oder angepasst für jeden einzelnen Embryo </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 MINS Eigenschaften <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="3"> Bild laden </td><td> An der Eingabeaufforderung einzuführen, um die Z relative Auflösung für dieImage. X (oder Y) Auflösung / Z-Auflösung (alle in &amp; mgr; m): Es kann aus den Metadaten der Datei mit dem Standard-Lesegerät oder Anwendung der folgenden Formel erhalten werden. </td></tr><tr><td> Geben Sie die Sequenznummer (1 - 5) für die Kanal segmentiert werden. Unter Verwendung des DNA-Färbung Kanal für die Segmentierung werden alle Zellen in dem Bild erkennen, jedoch können andere Kanäle separat zu segmentiert werden. </td></tr><tr><td> Geben Sie den Rahmen zu beginnen Segmentierung an (standardmäßig 1). Gilt nur für Dateien mit mehreren Zeitrahmen. </td></tr><tr><td> Verbessern Bild (optional) </td><td> Die weißen und schwarzen Bildpunkt kann eingestellt werden den Nachweis zu erleichtern. Im Allgemeinen den Weißpunkt zu senken und Re-Skalierung 0 - 255 (für 8-Bit-Bilder) oder 0 bis 4096 (für 12-Bit-Bilder) wird das Bild heller und erleichtern Nachweis von dim Kerne machen. </td></tr><tr><td rowspan="2"> erkennen Kerne </td><td> Wählen Sie die geschätzte Kerndurchmesser (in der Regel zwischen 30 und 40 Pixel in Blastozysten). </td></tr><tr><td> Für verrauschten Bildern kann der Rauschpegel eingestellt werden. Andernfalls wird der Standardwert angewendet werden. </td></tr><tr><td> Segment Kerne </td><td> Verwenden Sie Standard-Parameter. </td></tr><tr><td> Classify Kerne </td><td> MIN kann Trophektoderm (TE) von der inneren Zellmasse (ICM) Zellen in Präimplantationsembryonen basierend auf Position unterscheiden. Dies kann auch manuell oder basierend auf Fluoreszenz Ebenen erfolgen, wenn ein TE-Marker verwendet wird. </td></tr><tr><td rowspan="5"> Ergebnisse exportieren </td><td> Wählen Sie die Dateien erzeugt werden: </td></tr><tr><td> - Segmentierung überlagert über den Kanal verwendet (TIFF-Sequenz-Datei), </td></tr><tr><td> - Segmentierung nur (TIFF-Sequenz-Datei), </td></tr><tr><td> - Tabelle mit IDs für alle Zellen nachgewiesen, XYZ-Koordinaten und Fluoreszenzwerte (Mittelwert und Summe) für alle Kanäle für jede Zelle (CSV-Datei). </td></tr><tr><td> Alle Dateien werden standardmäßig exportiert. Die Dateien werden in der s gespeichertame Verzeichnis, in dem Bilder befinden. </td></tr></tbody></table> Tabelle 2 MINUTEN Segmentierung Pipeline

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Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

Dieses Protokoll stellt eine Methode quantitative, single-cell in situ Analyse der Proteinexpression durchzuführen lineage in mouse Spezifikation Präimplantationsembryonen zu studieren. Die Verfahren, die für die Sammlung von Blastozysten, Vollmontage Immunfluoreszenz-Nachweis von Proteinen, Imaging von Proben auf einem konfokalen Mikroskop und Kern Segmentierung und Bildanalyse beschrieben.

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

quantitative-analysis-protein-expression-to-study-lineage

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.8K Aufrufe.  Sloan Kettering Institute.  Dieses Protokoll stellt eine Methode quantitative, single-cell in situ Analyse der Proteinexpression durchzuführen lineage in mouse Spezifikation Präimplantationsembryonen zu studieren. Die Verfahren, die für die Sammlung von Blastozysten, Vollmontage Immunfluoreszenz-Nachweis von Proteinen, Imaging von Proben auf einem konfokalen Mikroskop und Kern Segmentierung und Bildanalyse beschrieben. 

Serie: Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Zeitliche Reihenfolge der dynamischen Ausdruck von Daten aus Detaillierte Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

Robuste Vergleich der Proteingehalte in Gewebe und in der gesamten Entwicklung mit standardisierten quantitativen Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Biochemie

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

Tracing Genexpression durch Nachweis der Aktivität der β-Galaktosidase in ganze Mausembryonen

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design efficient remedies for diseases. Technologies enabling accurate identification and quantification of diverse types and large numbers of proteins would provide still missing information on molecular mechanisms orchestrating tissue and organism development in space and time. Here, we present a mass spectrometry-based protocol that enables the measurement of thousands of proteins in identified cell lineages in Xenopus laevis (frog) embryos. The approach builds on reproducible cell-fate maps and established methods to identify, fluorescently label, track, and sample cells and their progeny (clones) from this model of vertebrate development. After collecting cellular contents using microsampling or isolating cells by dissection or fluorescence-activated cell sorting, proteins are extracted and processed for bottom-up proteomic analysis. Liquid chromatography and capillary electrophoresis are used to provide scalable separation for protein detection and quantification with high-resolution mass spectrometry (HRMS). Representative examples are provided for the proteomic characterization of neural-tissue fated cells. Cell-lineage-guided HRMS proteomics is adaptable to different tissues and organisms. It is sufficiently sensitive, specific, and quantitative to peer into the spatio-temporal dynamics of the proteome during vertebrate development.

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Here we describe a mass spectrometry-based proteomic characterization of cell lineages with known tissue fates in the vertebrate Xenopus laevis embryo.

Zellliniengesteuerte Massenspektrometrie-Proteomik im sich entwickelnden (Frosch-)Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Chemie

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...