Wir möchten Patricia Wadsworth für das Geschenk des Kinesin-5-Konstrukt danken. Diese Arbeit wurde von einer NIH Zuschusses (5 R01 GM107026) nach TJM und Research Grant No. 5-FY13-205 vom March of Dimes Foundation nach TJM, sowie die Unterstützung von der Charles H. Hood Foundation, Inc. unterstützt, Boston, MA. nach TJM

1. Transfektion von S2-Zellen <ol><li> Aus einer zuvor gezüchteten 25 cm 2 -Kolben, fügen GFP-α-Tubulin-exprimierenden S2-Zellen 10 bis zu einem Endvolumen von 2 ml zu 100% Konfluenz und ihnen erlauben, halb haften an den Boden eines 35 mm-Gewebekulturschale für ca. 1 Std. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus dem Gericht. Transfizieren 2 ug der Eg5-mCherry konstruieren 11 mit 1 ml Schneiders Medium mit 10% FBS (bezeichnet als Schneiders Medien bezeichnet) und Transfektionsreagenz nach dem Protokoll des Herstellers. Dichten Sie das Gericht mit Parafilm und inkubieren Zellen bei 25 ° C für 16-18 Stunden. </li><li> 1 ml der Schneider Medien. Zurückzukehren Zellen auf 25 ° C Inkubator. </li><li> Am Tag 3 nach der Transfektion übertragen 500 ul transfizierter Zellen in eine neue 35-mm-Gewebekulturschale, enthaltend 1,5 ml des Schneiders Medien für eine Test Induktion. Induzieren die Expression von Eg5-mCherry durch Zugabe von CuSO 4 </sub&gt;, um eine Endkonzentration von 500 uM. Dichten Sie das Gericht in Parafilm und Inkubation bei 25 ° CO / N. </li><li> Um Concanavalin A-beschichtete Deckgläser, Pipetten genug Volumen von Concanavalin A (0,5 mg / ml in H 2 O gelöst) zu beschichten, machen eine Säure gewaschen Deckglas, entfernen Sie das überschüssige, und lassen Sie das Deckglas an der Luft trocknen. </li><li> Platzieren eines 22 mm x 22 mm Concanavalin-A-beschichtete Deckgläschen in einer sauberen 35-mm-Gewebekulturschale, dann Samen 500 ul zu 100% Konfluenz der induzierten Zellen auf dem Deckglas und damit die Zellen für 1 h bei RT halten. </li><li> Um Eg5-mCherry Ausdruck zu überprüfen, montieren Sie die Deckgläschen in eine Rose Kammer (oder entsprechende Abbildungsgefäß) mit Medien für die Bildgebung bei RT auf einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie geeignete Lichtquellen und Filter-Sets, um die Zellen zu visualisieren. Beispielsweise das Mikroskop in dieser Studie verwendet wird, besitzt einen LED-Weißlichtquelle und EGFP (FITC / Cy2) und DsRed (TRITC / Cy3) Filterwürfel. Eg5-mCherry lokalisiert an Mikrotubuli und angereichert near Spindelpole. </li><li> Nachdem sichergestellt ist, dass die Zellen, die sowohl Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin, übertragen den Rest der transfizierten, nicht-induzierten Zellen auf eine 25 cm2 Zellkulturflasche mit 4 ml Schneiders Medien. </li><li> In Blasticidin S HCL in einer Endkonzentration von 25 ug / ml in den Kolben von transfizierten Zellen und weiter Aufteilen in Gegenwart von 25 ug / ml Blasticidin S HCl bis zum Zelltod nicht mehr sicher zu sein, um für die Expression von Eg5-mCherry in regelmäßigen Abständen überprüfen. Inkubieren Zelllinien in 25 ° C-Inkubator. HINWEIS: Der Prozentsatz von Zellen, die Eg5-mCherry Zeit zunimmt. </li><li> Sobald Zellen stabil transfizierten, weiterhin in der Abwesenheit von Arzneimittel aufgeteilt und gefrier 12 Zellen für zukünftige Verwendung. </li></ol> 2. RNA-Interferenz <ol><li> PCR zu amplifizieren ein ~ 500 bp Region Klp61F von cDNA (LD15641) unter Verwendung des Primers mit Mehr T7-Promotorsequenz (Sequenz in der Materialliste zur Verfügung gestellt) zu sein,als Matrize für dsRNA-Synthese eingesetzt. <ol><li> Vier PCR-Reaktionen, die jeweils 50 ul, enthaltend 100 ng Template-DNA, 25 &amp; mgr; M von jedem Primer, geeignete Puffer und Polymerase eingestellt. Stellen Sie den PCR-Protokoll auf dem Thermocycler nach der Polymerase Herstellerprotokoll. </li><li> Pool und sauber vier PCR-Reaktionen unter Verwendung eines PCR bereinigen Kit gemäß Herstellerprotokoll. Bewahren Sie die saubere Vorlage bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Bereiten doppelsträngige RNA (dsRNA) aus Vorlage unter Verwendung eines T7-RNA-Transkription-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Erwarten Sie ~ 5-15 mg / ml Konzentration der dsRNA. Speichern dsRNA bei -20 ° C. </li><li> Um Klp61F mit dsRNA Knockdown, ermöglichen S2-Zellen, die Eg5-mCherry bei 25% Konfluenz auf halb haften an den Boden eines 35 mm-Gewebekulturschale für 1 h. </li><li> Entfernen Sie die Medien aus den Schalen und fügen Sie 5 ug dsRNA gegen Klp61F (Drosophila Kinesin-5) in 1 ml Serum-freien Schneider verdünnt &quot;s Medien. </li><li> Inkubation bei RT für 1 h, dann fügen Sie 1 ml Schneider-Medien mit 10% FBS. Inkubiere Zellen bei 25 ° C. </li><li> 24 h nach der dsRNA Behandlung induziert die Expression von Eg5-mCherry durch Zugabe von CuSO 4 bis zu einer Endkonzentration von 500 uM. Zellen inkubieren bei 25 ° C für weitere 24 Stunden. </li></ol> 3. Live Cell Imaging <ol><li> Legen Sie eine 22 mm x 22 mm Concanavalin A beschichtete Deckglas in eine saubere 35-mm-Gewebekulturschale. </li><li> Samen 500 ul der Zellen, die mit dsRNA behandelt worden und induzierte O / N auf die Concanavalin A beschichteten Deckglas und ihnen erlauben, für etwa 1 Stunde zu halten. </li><li> Montieren Sie die Deckgläschen in eine Rose Kammer (oder andere geeignete Behälter) für die Bildgebung. </li><li> Finden mitotischen Zellen, die sowohl Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin. HINWEIS: Mitotische Zellen nur GFP-α-Tubulin-ausdrücken sollte monopolare Spindeln seit Klp61F, die für Spindel Bipolarität erforderlich sind, wird zu Boden geworfen 10,13. </li><li> Sammeln Sie Zeitrafferbilder von bipolarer Spindeln (zB 1 Frame pro Minute) in Zellen, die sowohl Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin. </li><li> Während Bildgebung, entfernen Sie die Medien aus dem Rosenkammer, und ersetzen Sie es mit Schneider-Medium, das 1 &amp; mgr; M STLC über 3 aufeinanderfolgende Medienaustausch (~ 5 ml insgesamt) in die Kammer, um Spindel Zusammenbruch zu visualisieren. </li><li> Um das Medikament Auswaschen und umgekehrt die Spindel Kollaps, entfernen Sie vorsichtig die STLC haltigen Medien aus dem Rosenkammer, und waschen in Schneiders Medien 4x (6-8 ml gesamt) vor dem Nachfüllen der Rose Kammer ein letztes Mal durch frische Medien. Weiter Bildgebung. </li></ol> 4. Error Correction Assay <ol><li> Legen Sie eine 22 mm x 22 mm Concanavalin A beschichtete Deckgläser in saubere 35-mm-Gewebekulturschalen. </li><li> Samen 500 ul Zellen, die mit Klp61F dsRNA auf die Concanavalin A beschichteten Deckglas behandelt wurden und es ihnen zu haften. </li><li> Nachdem die Zellen ADHERed, fügen Sie 1,5 ml Schneider Medien zu jeder Schale, um das endgültige Volumen auf 2 ml zu bringen. </li><li> Um Zellen zu verhaften in der Mitose, fügen MG132 bis zu einer Endkonzentration von 10 uM zu jedem der Gerichte, und Inkubation für 1 Std. </li><li> 1 &amp; mgr; M STLC und Inkubation für 1 Stunde, damit Monopole zu bilden. </li><li> Auswaschen des STLC durch Spülen Deck 3x mit 2 ml frischem Schneiders Medien jedes Mal. </li><li> Deckgläser mit Schneiders Medien inkubieren zusätzlich zu pharmakologischen Medikamente (zB Aurora-Kinase-Inhibitoren) oder DMSO als Kontrolle. Hinweis: Inhibitorkonzentrationen variieren und ordnungsgemäße Endkonzentrationen muss vom Versuchsleiter bestimmt werden. Stammlösungen werden in der Regel so getroffen, daß der Inhibitor, verdünnt 1: 1.000 in Medien. In diesem Fall wird eine 1: 1000 Verdünnung dient DMSO (oder geeigneten Lösemittel), wie der Fahrzeugsteuerung. Wir verwenden den Aurora-B-Hemmstoff Binucleine 2 bei einer Endkonzentration von 40 uM. </li><li> Fixieren Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten to beobachten, das Fortschreiten der bipolaren Spindelbildung und Kinetochor Befestigungsstaaten zu beurteilen. Reparieren: <ol><li> Schnell spülen Sie die Deckgläser mit 2 ml 1x BRB-80. </li><li> Fixieren Zellen durch Zugabe von 2 ml von 10% igem Paraformaldehyd in 1x BRB-80 für 10 min verdünnt. Pipet Para sorgfältig in einer chemischen Abzugshaube. </li><li> Permeabilisieren Zellen mit 2 ml 1X PBS + 1% Triton-X für 8 min. </li><li> Wasch gleitet 3mal mit 2 ml 1X PBS + 0,1% Triton-X. </li><li> Überdeckgläser Zell-Seite nach oben auf ein Blatt Parafilm (verwenden Sie eine Markierung, um Parafilm beschriften angemessen, den Überblick über die Objektträger zu halten) in einer 150 mm Petrischale. </li><li> Decken Sie die Deckgläser mit 150 ul gekocht Eselserum (BDS) und Inkubation bei RT für 1 h auf nicht-spezifischen Antikörper zu blockieren verbindlich. Hinweis: Hier kann die Fixierung Protokoll angehalten, um zu einem späteren Zeitpunkt fortgesetzt werden kann. Deckgläser in einer feuchten Kammer bei 4 ° C für bis zu 24 Stunden gelagert werden. Um den Feuchtigkeitskammer stellen, säumen den Rand eines 150 mm-Schalemit einem feuchten Labortuch geben und mit der Petrischale Deckel. </li><li> Entfernen Block und inkubiere die Deckgläser für 1 h bei RT mit 150 &amp; mgr; l primärer Antikörper in geeigneter Weise in BDS verdünnt, um Haftstellen und Mikrotubuli zu Endkonzentrationen von 2 ug / ml-Abstrichen (oder entsprechend den Empfehlungen des Herstellers) und 1 &amp; mgr; g / ml . Hinweis: Hier kann die Fixierung Protokoll angehalten, um zu einem späteren Zeitpunkt fortgesetzt werden kann. Deckgläser in einer feuchten Kammer bei 4 ° C für bis zu 24 Stunden gelagert werden. </li><li> Waschdeckgläser 3x mit 500 ul 1x PBS + 0,1% Triton-X. </li><li> Deck Inkubieren für 30-60 min bei RT mit den entsprechenden fluorophorkonjugierten Sekundärantikörper in BDS verdünnt. </li><li> Waschdeckgläser 3x mit 500 ul 1x PBS + 0,1% Triton-X. </li><li> Inkubieren Deckgläser mit 150 ul BDS, enthaltend 1 ug / ml DAPI Endkonzentration 5 min. </li><li> Waschen Sie Deckgläschen 2x mit 1x PBS + 0,1% Triton-X, und montieren coverslips Zellenseite nach unten auf eine 3x1 &quot;Objektträger mit 8 ul Montage Medien. Malen Sie die Ecken mit Nagellack, um die Deckgläser auf Objektträger zu immobilisieren. </li></ol></li><li> Bildzellen mit bipolarer Spindeln, die zum Ausdruck bringen Eg5-mCherry werden. Werfen Sie einen Z-Serie, bestehend aus 30 Flugzeugen bei 0,2 &amp; mgr; m Abständen in allen Kanälen mit einem 100x Objektiv. Sorgfältig zu analysieren, die Kinetochoren und Mikrotubuli, die Befestigungszustände (biorientierte oder syntelic Anhänge) zu bestimmen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Visualisierung von Fehlerkorrektur ist eine wertvolle Technik, um die Schritte in diesem wichtigen und komplexen zellulären Prozess beteiligt zu studieren. Um dies zu tun, werden fehlerhafte Anhänge mit reversible Inhibitoren erzeugt und die Fehlerkorrektur nach Auswaschen des Arzneimittels beobachtet. Dieser Test wurde ursprünglich unter Verwendung von Säugetier-Gewebekulturzellen 5 entwickelt. Jedoch ist die Anwesenheit einer großen Anzahl von Haftstellen in vielen Modellsäugetierzelltypen stellt eine Herausforderung bei der Beobachtung einzelner Fehlerkorrekturereignisse. Drosophila S2 Zellen besitzen so wenige wie 4 Paare von Haftstellen, so dass sie eine mehr bevorzugte Zelllinie zur Beobachtung der Fehlerkorrektur. Jedoch ist ein großer Nachteil, dass viele Inhibitoren unwirksam Drosophila S2 Zellen. Somit stellt die Fähigkeit, eine humanisierte Drosophila S2 Zelllinie zu generieren, die menschliche Kinesin-5 ein wertvolles Werkzeug, um eine Fehlerkorrektur zu studieren. Obwohl Drosophila S2 Zellen sein kannbessere Zelllinie, um eine Fehlerkorrektur zu studieren, die mehrere Schritte bei der Erlangung der Zelllinie und umzuwerfen essentielle Gene beteiligt wirft einige Herausforderungen dieser Technik. Zum Beispiel, kann die Transfektionseffizienz ziemlich niedrig sein. Bei weniger als 20% der Zellen exprimieren die Eg5-mCherry sollte die Transfektion wiederholt werden, wie der Auswahlvorgang dauert länger. Auch kann der Anteil der Zellen, die sowohl fluoreszierende Proteine ​​mit der Zeit ab. Dies kann durch die Spaltung von Zellen in Gegenwart von Blasticidin S HCl und Hygromycin B, um Zellen, die Eg5-mCherry und GFP-α-Tubulin jeweils auszuwählen, überwunden werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Drosophila S2 Zellen Orthologe viele humane Proteine ​​und; daher ist es wichtig, die Zuschlagsbedingungen für die endogenen Proteine ​​zu optimieren. Zuschlags optimalen Bedingungen können in der Menge von dsRNA und die Behandlungsdauer variieren. Angesichts der Entstehung und rasche Verbesserung CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, Erzeugung eines Drosophila-Zelllinie mit der Klp61F Gens durch menschliche Eg5 ersetzt präsentiert eine leistungsfähige Alternative, die die Grenzen der Transfektion und Zuschlags Ansatz zu überwinden wäre. Unsere Arbeit zeigt, dass Fly-zu-Mensch-Gen-Ersatz sollte ein gangbarer Weg ist in diesem Fall, obwohl die notwendigen Reagenzien, um so in Drosophila S2-Zellen tun, werden derzeit entwickelt. Dieses Verfahren ist nicht auf Eg5 beschränkt, sondern kann angewendet, um die Funktion anderer Proteine ​​von Interesse zu untersuchen. Bei der Verwendung von Inhibitoren, die zuvor festgelegt wurden unwirksam in Drosophila S2-Zellen zu sein, kann dieses Protokoll geändert werden, um die unmittelbare Wirkung von Inhibitoren in lebenden Zellen, ohne Bedenken bezüglich vorbei Effekte zu studieren. Die Verwendung dieses Protokolls produziert Zelllinie könnte auch im Hochdurchsatz-Screening verwendet werden analysiert, um potenzielle Medikamente gegen Proteine, die in Fehlerkorrektur beteiligt sind.

Equal Segregation des Genoms während der Zellteilung erfordert korrekte Wechselwirkungen zwischen den DNA repliziert und Spindel Mikrotubuli. Mikrotubuli physisch Chromosomen zu interagieren durch ein Ensemble von Proteinen, die an Zentromeren als Kinetochor 1 bekannt versammelt. Korrekte Verteilung der Chromosomen erfordert Schwester Kinetochore sind biorientierte, wobei jede Schwester mit Mikrotubuli von gegenüberliegenden Spindelpole Ursprung verbunden. Kinetochor Mikrotubuli (kt-MT) Anlagen, die in der biorientierten Konformation nicht schnell und effizient destabilisiert, die Gelegenheit zu Biorientierung in einem Prozess als Fehlerkorrektur bekannt zu etablieren ist. Eine Fehlerkorrektur-Assay, die zuvor in Säugetierzellen hergestellt wurde 5 erfordert die Montage monopolare Spindeln mit umkehrbarer niedermolekularen Inhibitoren gegen Eg5 (Kinesin-5). Die medikamentöse Behandlung erzeugt eine Vielzahl von fehlerhaften syntelic Anhänge, in denen Both Schwester Kinetochoren zu befestigen, um die gleiche Spindel-Pol. Eine nachfolgende Auswaschung des Wirkstoffs ermöglicht die Visualisierung der dem Fehlerkorrekturverfahren. Die Fehlerkorrektur-Assay kann in Anwesenheit von Kleinmolekül-Inhibitoren oder Niederschlägen durchgeführt, um den Beitrag von Kandidatenproteinen auf die Korrektur fehlerhafter kt-MT-Anhänge zu untersuchen. Die Fähigkeit zur Fehlerkorrektur in lebenden Zellen sichtbar zu machen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen in diesem komplexen Prozess beteiligten weiter zu verstehen. Die große Anzahl von in den meisten Zelllinien vorhanden Chromosomen stellt jedoch eine Herausforderung bei der Beobachtung einzelner kt-MT-Anhänge. Drosophila S2 Zellen wäre ideal für die Anwendung des Fehlerkorrektur Assay, da sie so wenig wie 4 Chromosomen 6, aber kleine Molekülinhibitoren enthalten von Kinesin-5, wie etwa S-Trityl-L-cystein (STLC) und Monastrol 7-9 nicht beeinträchtigen Spindelanordnung oder Kinesin-5 Motorik in Drosophila-Zellen. Deshalb Gattungented ein Drosophila S2-Zelllinie menschlichen Kinesin-5 unter einem induzierbaren Promotor, die empfindlich auf Kinesin-5-Hemmer ist, zum Ausdruck bringen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die endogenen Drosophila Kinesin-5-Homologen, Klp61F Knockdown, und verwenden Sie diese Zelllinie in der zellbasierten Assay-Fehlerkorrektur.

<table><tbody><tr><td>Effectine Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomic Resource Center</td><td>13690</td><td>Gene Name LD15641</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>Heat Inactivated, US origin</td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate (CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&amp;nbsp;mM stock</td></tr><tr><td>S-trityl-L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&amp;nbsp;mM stock in DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&amp;nbsp;mg/ml stock in 1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 Large scale RNA Production System</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15&amp;nbsp;&amp;micro;g/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td></tr><tr><td>PCR clean-up kit</td><td>Mo Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0.5&amp;nbsp;mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS.</td></tr><tr><td>Boiled Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td></td><td></td><td>20&amp;nbsp;mM Tris pH 8.0,&amp;nbsp; 0.5% &lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1x BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 mM PIPES pH 6.9; 1&amp;nbsp;mM EGTA; 1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>White Light Source</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>anti-NDC80 antibody&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Custom made by the Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1&amp;alpha; (anti-&amp;alpha;-tubulin)</td><td>Sigma</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td>anti-CID antibody</td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

generating a &#34;humanized&#34; drosophila s2 cell line sensitive to pharmacological inhibition of kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.

Klp61F erforderlich ist, um bipolare Spindeln zu bilden. Der menschliche Kinesin-5, Eg5, kann die Funktion des Klp61F in Drosophila S2-Zellen (1A und D) zu retten. Nach Zugabe des Kinesin-5-Inhibitor (STLC), Mikrotubuli-assoziierten Niveaus des Kraftabfall (1B und E) und die Spindel zusammenbricht, was in einer Monopol (1C und F) in Zellen, denen endogene Klp61F bei erfolgreicher RNAi (Supplemental Film 1). Es ist bemerkenswert, dass die bipolare Spindeln bei Zugabe von STLC in den humanisierten S2-Zellen zusammenbrechen, weil Kinesin-5-Aktivität ist nicht verpflichtet, Spindel Bipolarität in menschlichen Zellen zu erhalten. Diese interessante Diskrepanz kann eine Folge der Unterschiede in inter Mikrotubuli Überschneidungen und / oder Stabilität in den beiden Modellsystemen 14 zu sein. Kinesin-5-Hemmung (2A und E) können reve werden<html> durch Auswaschen des Arzneimittels und die Wiederherstellung einer bipolaren Spindel RSED kann im Laufe der Zeit folgen. Bei Entfernung des Inhibitors (2B und F) wieder assoziierten Eg5-mCherry mit den Mikrotubuli als bipolarer Spindel montiert (2C und G), und die Zellen können in einer bipolaren Anaphase (2D und H, Supplemental Film 2 Fortschritt ). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Zugabe von 1 uM STLC führt zu monopolaren Spindeln in Drosophila S2 Zellen. Repräsentative Bilder von Zeitraffer Bildgebung eines Drosophila S2 exprimierenden Zelle Eg5-mCherry (AC) und GFP-α-Tubulin (DF) während der Zugabe von 1 &amp; mgr; M STLC. Die Eg5-Inhibitor wurde nach 3 min zugegeben. Maßstabsbalken = 5 um. Timestamp = min: sec.<html> w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> Abbildung 2. Eine bipolare Spindel Reformen beim Entfernen STLC. Repräsentative Bilder von Zeitraffer-Bildgebung eines Drosophila 2 Zelle, die Eg5-mCherry (AD) und GFP-α-Tubulin (EH) während eines STLC Auswaschen Experiment. STLC wurde bei 5 min gewaschen. Eine bipolare Spindel Reformen innerhalb 1 Stunde zur Entfernung des STLC. Maßstabsbalken = 5 um. Zeitstempel: min: sec. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; STADT Film 1. (Rechtsklick zum Download). Widefield-Fluoreszenz-Bildgebung eines repräsentativen Beispiels eines Drosophila S2 Zelle, die Eg5-mCherry ( links) und GFP-α-Tubulin (rechts). 1 uM STLC wurde auf 2 min zugegeben und die Spindel bildet einen Monopol innerhalb 10 min nach Zugabe des Inhibitors. Bilder wurden alle 1 min gewonnen und spielte bei einer Rate von 10 Rahmen pro Sekunde. Maßstabsbalken = 5 um. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">STADT Film 2 (Rechtsklick zum Download).</a> Widefield-Fluoreszenz-Bildgebung eines repräsentativen Beispiels eines Drosophila S2 Zelle, die Eg5-mCherry (links) und GFP-α-Tubulin (rechts). Medien, die 1 &amp; mgr; M STLC wurde entfernt undin 5 min gespült. Eine bipolare Spindel Reformen innerhalb 1 Stunde zur Entfernung des Inhibitors. Bilder wurden alle 1 min erworben und spielte mit einer Rate von 10 Bildern pro Sekunde. Maßstabsbalken = 5 um.

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Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

Erzeugen eines &quot;humanisierte&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2-Zelllinie Sensitive pharmakologische Hemmung der Kinesin-5

This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

7.2K Aufrufe.  University of Massachusetts, Amherst. This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined. 

Serie: Generating a "Humanized" Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Forschung

Neurowissenschaften

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

Einsatz von Drosophila S2-Zellen für Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Genetik

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

Eine Screening-Methode zur Identifizierung von Heterochromatin-fördernden Medikamenten mit Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

Ex vivo Kultivierung von Whole, Entwickeln von Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted epithelial morphogen. In this assay, Fog is used as an agonist to activate Rho through a signaling cascade that includes a G-protein-coupled receptor (Mist), a G&#945;12/13 protein (Concertina/Cta), and a PDZ-domain-containing guanine nucleotide exchange factor (RhoGEF2). Fog signaling results in the rapid and dramatic reorganization of the actin cytoskeleton to form a contractile purse string. Soluble Fog is collected from a stable cell line and applied ectopically to S2R+ cells, leading to morphological changes like apical constriction, a process observed during developmental processes such as gastrulation. This assay is amenable to high-throughput screening and, using RNAi, can facilitate the identification of additional genes involved in this pathway.

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Here we describe a contractility assay using Drosophila S2R+ cells. The application of an exogenous ligand, folded gastrulation (Fog), leads to the activation of the Fog signaling pathway and cellular contractility. This assay can be used to investigate the regulation of cellular contractility proteins in the Fog signaling pathway.

Eine zellbasierte Assays-Muskel Myosin II Kontraktilität über die Gastrulation gefaltet Signalisierung Pathway in Drosophila S2R + Zellen untersuchen

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

Entwicklungsbiologie

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

Live-Präparation Drosophila Embryos: Optimierte Verfahren für das Screening Mutant Sammlungen von Antikörper-Färbung

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Biologie

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Vorbereitung der Drosophila S2-Zellen für Lichtmikroskopie

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität bei Drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at multiple length scales, such as cell division, cell migration, epithelial folding, and branching morphogenesis. An in-depth understanding of the role of actomyosin contractility in morphogenesis requires approaches that allow the rapid inactivation of actomyosin, which is difficult to achieve using conventional genetic or pharmacological approaches. The presented protocol demonstrates the use of a CRY2-CIBN based optogenetic dimerization system, Opto-Rho1DN, to inhibit actomyosin contractility in Drosophila embryos with precise temporal and spatial controls. In this system, CRY2 is fused to the dominant negative form of Rho1 (Rho1DN), whereas CIBN is anchored to the plasma membrane. Blue light-mediated dimerization of CRY2 and CIBN results in rapid translocation of Rho1DN from the cytoplasm to the plasma membrane, where it inactivates actomyosin by inhibiting endogenous Rho1. In addition, this article presents a detailed protocol for coupling Opto-Rho1DN-mediated inactivation of actomyosin with laser ablation to investigate the role of actomyosin in generating epithelial tension during Drosophila ventral furrow formation. This protocol can be applied to many other morphological processes that involve actomyosin contractility in Drosophila embryos with minimal modifications. Overall, this optogenetic tool is a powerful approach to dissect the function of actomyosin contractility in controlling tissue mechanics during dynamic tissue remodeling.

Autor im Rampenlicht: Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen  

Actomyosin contractility plays an important role in cell and tissue morphogenesis. However, it is challenging to manipulate actomyosin contractility in vivo acutely. This protocol describes an optogenetic system that rapidly inhibits Rho1-mediated actomyosin contractility in Drosophila embryos, revealing the immediate loss of epithelial tension after the inactivation of actomyosin in vivo.

Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Erzeugen eines "humanisierte"

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In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Einsatz von Drosophila S2-Zellen für Live Imaging of Cell Division

Eine Screening-Methode zur Identifizierung von Heterochromatin-fördernden Medikamenten mit Drosophila

Ex vivo Kultivierung von Whole, Entwickeln von Drosophila Brains

Eine zellbasierte Assays-Muskel Myosin II Kontraktilität über die Gastrulation gefaltet Signalisierung Pathway in Drosophila S2R + Zellen untersuchen

Live-Präparation Drosophila Embryos: Optimierte Verfahren für das Screening Mutant Sammlungen von Antikörper-Färbung

Vorbereitung der Drosophila S2-Zellen für Lichtmikroskopie

Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen

Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen

Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen