1. Ändern Polymere Oberflächen mit recCD47 HINWEIS:. Das Protokoll ist in 1 schematisch zusammengefaßt 1A zeigt Generation von Thiol-reaktiven polymeren Oberflächen 1B zeigt Generation von Thiol-reaktiven recCD47.. <ol><li> Tag 1 <ol><li> Eine Lösung von PDT-BzPh (1 mg / ml) und Kaliumhydrogencarbonat (KHCO 3) (0,7 mg / ml) in sterilem Wasser. Rühren über Nacht bei 4 ° C (vor Licht schützen). </li></ol></li><li> Tag 2 <ol><li> Geschnitten polymeren Schlauch in 40 cm lange Stücke (lange genug, um rotierende Räder passen herum). </li><li> Einweichen Rohre in einer 0,1% igen wässrigen Lösung von hexacylpyridinium für 90 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler oder Chandler Kreisvorrichtung. Spülen Sie die Rohre mit sterilem Wasser 3x nach der 90 Minuten einweichen. </li><li> Säure die Lösung von PDT-BzPh von Tag 1 durch Zugabe von 15% iger wässriger Kaliumphosphat einbasischen (KH 2 </sub&gt; PO 4). Fügen Sie 50 ul KH 2 PO 4 pro ml PDT-BzPh und bildet eine trübe Mizellarlösung. </li><li> Weichen Sie die Rohre in der angesäuerten PDT-BzPh Lösung für 40 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler oder auf das Gerät. </li><li> Spülen Sie die Rohre mit verdünnter Essigsäure (1: 1000) einmal. </li><li> Setzen die Röhren UV-Bestrahlung mit einer Gesamtdauer von 60 min. Rohre drehen ¼ Umdrehung alle 15 min, um die gesamte Fläche zu bestrahlen. </li><li> Einweichen der Rohre in einer Lösung von 20 mg / ml Kaliumbicarbonat (KHCO 3) für 20 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler oder Vorrichtung. </li><li> Die Röhrchen mit sterilem Wasser spülen und zu speichern 3x bei 4 ° C in sterilem Wasser. </li></ol></li><li> Tag 3 <ol><li> Aufzulösen 5 mg Sulfo-SMCC in 200 ul Dimethylformamid (DMF) (Achtung: Führen in Abzug). </li><li> Dann werden 50 ul der Sulfo-SMCC-Lösung in Schritt 1 bis 0,1 mg / ml recCD47 Poly-Lysin-Lösung, zugegeben und 60 min bei room Temperatur. </li><li> Während 60 min rühren, Degas sterile Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) und beiseite stellen. </li><li> Reinigen Sulfo-SMCC reagiert recCD47 mit einem Molekulargewicht 7K Cut-off-Spin-Entsalzungssäule den Anweisungen des Herstellers. Sammeln abschließenden Durchfluss (hochwertige thiolreaktive recCD47) und verdünnt auf eine notwendige Beschichtung des Inneren des Rohres mit DPBS Volumen. </li><li> Die Rohre von Tag 2 mit sterilem spülen, entgast DPBS 3x. </li><li> Reagieren der modifizierten Oberfläche der Rohre mit einer Lösung von 20 mg / ml mit Tris (2-carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP) in entgastem DPBS für weniger als 2 min. Spülen Sie die Rohre mit sterilem DPBS 4x entgast. </li><li> Fügen Sie den Sulfo-SMCC reagierten recCD47 zu den Rohren und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler oder auf das Gerät. </li></ol></li></ol> 2. Immunoassay Quantifizierung der recCD47 auf modifizierte Oberflächen <ol><li> Geändert Rohre spülen, um von Tag 3 wit quantifiziert werdenh DPBS 3x. Die Röhrchen nicht zur Quantifizierung in DPBS bei 4 ° C verwendet. </li><li> Verwenden Sie ein 4 mm Biopsie Punch, um doppelte Rohrproben in Vertiefungen einer 96-Well-Platte zu machen und legen Biopsie Schläge. </li><li> Bereiten Sie eine Negativkontrolle, bestehend aus einem nicht modifizierten Rohr Probe nicht mit dem Detektionsantikörper behandelt. Bereiten Sie eine Antikörperkontrolle, bestehend aus einem nicht modifizierten Rohrprobe mit dem Detektionsantikörper behandelt. Bereiten Sie die mit dem Detektionsantikörper behandelt geändert Rohr-Testproben. </li><li> Block Proben mit 0,4% Rinderserumalbumin (BSA) in DPBS für 60 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. </li><li> Nach der Blockierung absaugen BSA und spülen mit Tris-gepufferte Kochsalzlösung plus 1% Tween-20 (TBST) 3x, jeweils 10 Minuten auf einem Schüttler. </li><li> Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung des Antikörpers in 0,4% BSA nach Hersteller empfohlenen Verdünnung für Immunoassays. Verdünnte menschliche CD47-Antikörper-FITC B6H12 1: 100 in 0,4% BSA. </li><li> Fügen Sie 200 ul Antikörper Verdünnung auf die entsprechenden Wells. Incubate negative Kontrollen mit nur 0,4% BSA. Inkubieren bei Raumtemperatur für 60 min auf einem Schüttler (vor Licht schützen). </li><li> Spülen mit TBST 3x, jeweils auf einem Schüttler 10 min. Saugen Sie den letzten TBST spülen und mit 200 ul DPBS auf Rohrprobenvertiefungen. </li><li> Sammeln Sie die letzte Durchfluss, die hochwertige thiolreaktive rekombinanten CD47 ist und zu verdünnen, um eine notwendige Beschichtung der Innenseite der Rohre mit DPBS Lautstärke. </li><li> Lesen FITC Signalintensität mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader mit FITC-Anregung (485 nm) und Emission (538 nm)-Einstellungen. </li><li> Berechnen recCD47 polymere Oberfläche gebunden basierend auf Standardwerte, auf die Autofluoreszenz und unspezifische Bindung des Antikörpers Kontrollprobe. </li></ol> 3. Chandler Loop-Gerät Protokoll Suchen Institutional Review Board (IRB) Genehmigung der Blutentnahme Protokoll und informierte Zustimmung Papierkram vor Beginn der Sammlung von menschlichen Blutproben. Infos zu erhaltenRmed Zustimmung von einem menschlichen Blutspender. HINWEIS: Ein Diagramm, das die Vorrichtung ist in Figur 2 gezeigt. <ol><li> Füllen Wasserbad mit destilliertem Wasser bis ca. 02.01 der Durchmesser Räder sind untergetaucht. Fügen Sie genug Bleichmittel auf dem Wasserbad auf 10% Bleichmittel-Lösung zu machen. Eingestellt Wasserbad auf 37 ° C und ermöglichen Temperatur äquilibrieren. </li><li> Sammeln Metalladapter (in 1B gezeigt), unmodifizierten und modifizierten Rohrschlauch und der Umgebung zusammenVorrichtung Räder, wie in 1C gezeigt. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch passt eng um das Rad mit dem Metallteil an Ort und Stelle. </li><li> Erhalten 30 ml Blutprobe unter Verwendung eines IRB-genehmigten Protokoll, in einer Ampulle mit 2 ml Citrat oder anderen Antikoagulans vorgefüllt und Mischen durch Inversion der Gerinnung zu verhindern, sobald die Probe gesammelt wurde. </li><li> Etwa 10 ml Blut zu jedem Röhrchen unter Verwendung der Metallventil und Spritze, so dass etwas Luft in dem Rohr. Befestigen Sie die Ventilkappe und rOtate für 3 Stunden. </li><li> Lassen Sie das Blut in einen Abfallbecherglas mit einer 10% Bleichmittel-Lösung (oder, wie von institutionellen Politik erforderlich). </li><li> Rohrinnen sanft spülen mit DPBS um alle Spuren von Blut zu entfernen. Sammeln Durchströmung in der Abfallbecherglas. Entsorgen von Blut im Einklang mit den institutionellen Politik. </li><li> Desinfizieren Sie das Gerät und den Blutkontaktflächen mit einem 10% igen Bleichlösung oder nach institutionellen Politik. </li><li> Verfahren Proben für Fluoreszenzmikroskopie oder Rasterelektronenmikroskopie, wie unten beschrieben. </li></ol> 4. Fluoreszenz-Mikroskopie und Zellzählung <ol><li> Bereiten Sie eine 4% Paraformaldehyd (PFA)-Lösung (Achtung: Führen in Abzug). </li><li> Schlauch inkubieren in 4% PFA-Lösung über Nacht bei 4 ° C ist. </li><li> Nach Inkubation über Nacht entfernen 4% PFA und spülen Filme sehr vorsichtig mit DPBS. </li><li> Schneiden Sie den Schlauch in Abschnitte, um die Lumenoberfläche für die Färbung aus. </li><li> Fleckein Abschnitt der Rohrleitung mit einigen Tropfen Befestigungsmittel 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 30 min bei Raumtemperatur (vor Licht schützen). Nach der Färbung, spülen Sie den Schlauch sehr vorsichtig mit DPBS, um Hintergrund DAPI Signal zu reduzieren. </li><li> Bild unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit einem DAPI-Filter und Digitalkamera ausgestattet die Anzahl der Zellen in 9 blind ausgewählten Sichtfeldern unter 200facher Vergrößerung zu zählen. </li><li> Rekordzelle zählt pro Gesichtsfeld und führen Sie die entsprechenden statistischen Analysen, statistische Signifikanz der Ergebnisse zu bestimmen. </li></ol> 5. Rasterelektronenmikroskopie <ol><li> Bereiten Sie eine 2% Glutaraldehyd-Lösung (Achtung: Führen in Abzug). </li><li> Schlauch in einer 2% igen Glutaraldehyd-Lösung beimpft und über Nacht bei 4 ° C ist. </li><li> Nach Inkubation über Nacht, sanft spülen Sie den Schlauch 3x mit DPBS. </li><li> Bereiten Sie eine 1% ige Lösung von Osmiumtetroxid (Achtung: Schwere Gefährdung durch Einatmen! Verwenden Sie in Abzug). </li><li> Schlauch inkubieren in einer 1% igen Lösung von Osmiumtetroxid 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> Sanft spülen Sie den Schlauch 3x mit DPBS. </li><li> Vorbereiten einer Reihe von Ethanol-Konzentrationen (25%, 50%, 75%, 95% und 100% Ethanol). </li><li> Dehydratisierung der Schlauch durch Inkubation in einer Reihe von Ethanolkonzentrationen. Inkubieren in 25%, 50%, 75% und 95% Ethanol für jeweils 20 min. Inkubieren in 100% Ethanol für 30 min. </li><li> Überkritischen Punkt trocknen die Schläuche mit CO 2 für 45 Minuten, um alle Feuchtigkeit zu entfernen. </li><li> Mount Rohrabschnitte auf einer Probe mit Stummelsilberpaste oder Graphit. </li><li> Mantel Rohrabschnitte mit 12,5 nm Gold-Palladium. </li><li> Untersuchen in einem Rasterelektronenmikroskop. </li></ol>

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	<li>Bruck, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+applications+of+polymeric+materials.">Medical applications of polymeric materials.</a> Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).</li><li>Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreign+body+reaction+to+biomaterials.">Foreign body reaction to biomaterials.</a> Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).</li><li>Levy, J. H., Tanaka, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+response+to+cardiopulmonary+bypass.">Inflammatory response to cardiopulmonary bypass.</a> Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).</li><li>Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+blood+reactivity+to+hydroxylated+and+non-hydroxylated+polymer+surfaces.">In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces.</a> Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).</li><li>Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+of+self-assembled+monolayers+displaying+various+functional+groups.">In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups.</a> Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).</li><li>Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+biomaterials+for+tissue+engineering+applications:+surface+modification+of+polymers.">Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers.</a> Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).</li><li>Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+cell+type-specific+interactions+between+CD47+and+human+SIRPalpha.">Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha.</a> Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).</li><li>Tsai, R. K., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+'self'+engulfment+through+deactivation+of+myosin-II+at+the+phagocytic+synapse+between+human+cells.">Inhibition of 'self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells.</a> J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).</li><li>Berg, T. K., vander Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+'self'+recognition:+a+role+for+CD47-SIRPalpha+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).</li><li>Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD47+as+a+marker+of+self+on+red+blood+cells.">Role of CD47 as a marker of self on red blood cells.</a> Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).</li><li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation.">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).</li><li>Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces.">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).</li><li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces.">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).</li><li>Ravetch, J. V., Lanier, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+inhibitory+receptors.">Immune inhibitory receptors.</a> Science. 290, 84-89 (2000).</li><li>Chandler, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+thrombotic+coagulation+of+blood:+a+method+for+producing+a+thrombus.">In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus.</a> Lab Invest. 7, 110-114 (1958).</li><li>Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bubble-induced+aggregation+of+platelets:+effects+of+gas+species,+proteins,+and+decompression.">Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression.</a> Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).</li><li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platlet+accumulations+around+&#8220;air+bubbles&#8221;+in+blood+after+venous+air+embolism.">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around &#8220;air bubbles&#8221; in blood after venous air embolism.</a> Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).</li><li>Miller, R., Fainerman, V. B., W&#252;stneck, R., Kr&#228;gel, J., Trukhin, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques.">Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).</li><li>Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+modified+chandler,+roller+pump,+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions:+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications.">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> Int J Biomater. 2012, (2012).</li></ol>

Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde vom National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, unter Verleihungsnummer R21 EB015612 (SJS) und dem National Heart, Lung, and Blood Institute unter Verleihungsnummer T32 HL007915 (JBS und RJL) unterstützt, der National Institut für Gesundheit.

Die Photochemie (in Figur 1 zusammengefaßt) erlaubt die Änderung der praktisch jedem Polymeroberfläche, die ausreichend ist, um Kohlenwasserstoffe PDT-BzPh Befestigung und anschließenden UV-Bestrahlung zu erleichtern Photo aktivieren PDT-BzPh. Funktionalisierung der Polymeroberfläche mit reaktiven Thiolgruppen erlaubt die nachträgliche Montage einer Reihe von testbaren Moleküle von Interesse. In unserem speziellen Studien wählten wir rekombinanten CD47 11-13. Die besondere Konjugationschemie die wir früher umfasste die Reaktion von Amingruppen des Proteins mit dem bifunktionellen Vernetzer SMCC 11-13. Dies lieferte thiolreaktive recCD47 für die nachfolgende Reaktion mit dem thiolierten Polymeroberfläche. Das Endprodukt war eine Monosulfidbindung kovalent Binden des recCD47 auf das Polymer. Um sicherzustellen, daß die Amingruppen von den Aminosäuren in CD47 wurden nicht für die Reaktion verwendet wird, und dadurch die Wirksamkeit Milderungdes immobilisierten CD47 wir weiter modifiziert die recCD47 indem ein Poly-Lysin-Tag an das Protein die C-Terminus. Es wäre denkbar, dass eine ähnliche molekulare Strategie kann mit anderen Proteinen verwendet werden. So ist die Konjugation Chemie präsentiert hier und anderswo 11-13 bietet eine wichtige Gelegenheit, um die Fähigkeit von potentiell therapeutischen Molekülen zu Biokompatibilität auf Kunststoffoberflächen verleihen bewerten. Ein Nachteil dieses Protokolls ist, dass Aussetzen bestimmter Arten von Polymeren, wie Polyurethan, zu längerer UV-Bestrahlung zu Verfärbungen führen. Dies kann durch Anordnen des Polymers in Polystyrol-Schalen (üblicherweise in Gewebekultur verwendet werden), um eine Verfärbung des Polymers ohne Beeinträchtigung der Photoaktivierung der PDT-BzPh verhindern vermieden werden. Die Wellenlänge von UV-Licht in diesem Protokoll verwendet wird, ist 302 nm; Abweichung von dieser Wellenlänge kann in ineffizienten Photoaktivierung der PDT-BzPh führen. Wenn mit einer anderen WellenlängeUV-Licht, ist die Optimierung der Bestrahlungszeit nötig, signifikante Photoaktivierung zu gewährleisten. Nach diesem Protokoll ermöglicht die Befestigung recCD47 auf polymeren Oberflächen, zum Zweck der Immunumgehung und Förderzustand &quot;Selbst&quot; zu der Polymeroberfläche, um die Fremdkörperreaktion zu verhindern. Quantifizierung der recCD47 zur Oberfläche beigefügten abgeschlossen mit einem FITC-markierten Antikörpers an die Ig-Domäne von CD47 unter Verwendung eines Immuntests und Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 3). Diese Methode könnte auch auf andere Proteine ​​an Polymeroberflächen unter der Annahme, Antikörper angehängt Verfügbarkeit angepasst werden. Nicht signifikante Anhängsel recCD47 (oder ein anderes Protein) zu erhalten, kann aufgrund einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich Nicht PDT-BzPh photoaktivieren, nicht genügend Kohlenwasserstoffe auf der Polymeroberfläche, die Hydrophobie der Polymeroberfläche, oder das Polymer kann zu dick sein oder undurchsichtig, damit Licht durch angemessene quantific gebenation. Alle diese Variablen können experimentell getestet und für ein bestimmtes Polymer optimiert werden. Die Chandler Loop-Gerät ist ein einzigartiges Werkzeug für die Ex-vivo-Analyse von menschlichem Vollblut Exposition auf polymere Oberflächen. Dieses System ähnelt der Perfusion von Blut durch klinische Blutleitungen in verschiedenen medizinischen Prozeduren verwendet, so dass die Analyse von vielen physiologischen Endpunkten mit Blut Kontaktflächen verbunden. Physiologische Endpunkte der Anhängsel recCD47 auf Polymeroberflächen wurden Zellzählungen unter Verwendung von DAPI-Färbung (4) und Rasterelektronenmikroskopie (Figur 5) eingesetzt. Andere Endpunkte können auch verwendet werden, je nach Verfügbarkeit der Hardware, beispielsweise Zellzahl vor und nach der Blutperfusion durch polymere Blutleitungen können ebenfalls verwendet werden. Im Vergleich zu nicht modifizierten Steuerflächen unabhängig, recCD47-modifizierten Oberflächen deutlich weniger eingehalten ausgestellt Zellen. Diese data legen nahe, dass recCD47 vermittelt Biokompatibilität auf polymere Oberflächen und könnte verwendet werden, um die FBR in klinischen Verfahren unter Verwendung von polymeren Blutleitungen zu verhindern. Obwohl dies eine weit in vitro-Modell für die Durchblutung Studien verwendet, ist es in gewisser Hinsicht begrenzt. Die beiden großen Nachteile dieser Methode ergeben sich aus der Anforderung, Luft in der Röhre mit der Blutprobe enthalten. Die häufige Blut Interaktion mit Luft Leukozyten-und Thrombozytenaggregation und Protein-Denaturierung 16-18, die mit bestimmten Endpunkten beeinträchtigen kann. Zweitens bleibt die Luft an der höchsten Stelle der Schaltung, wodurch die Geschwindigkeit des Blutkreislaufs 19. Trotz der offensichtlichen Grenzen dieser Methode induziert weniger Blutschädigung als Konkurrenzverfahren 19 und dient als eine Art von Screening der Biokompatibilität Potential Biomolekülen auf Polymerblutleitungen. Sobald Kandidat Biomoleküle durch identifiziertDieses Verfahren kann die weitere Analyse durch In-vivo-Tiermodellen erhalten werden. Letztlich ist die Biokompatibilität der modifizierten Polymere ist mittels einer geeigneten in-vivo-Modellsystem bestätigt werden.

Viele klinische Verfahren, wie beispielsweise Herz-Lungen-und Nierendialyse, erfordern die Verwendung von polymeren Blutleitungen und sind oft mit postoperativen Komplikationen 1 verbunden. Wenn sie mit Blut durchströmt, diese Polymere unerlaubt die Fremdkörperreaktion (FBR), was bei der Adsorption von Blutproteinen und Thrombozyten, Monozyten / Makrophagen-Haftung, und die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen, die alle zu post-prozeduralen Komplikationen und tragen / oder Geräteausfall 2,3. So, Strategien zur Lösung dieses Problems vor ein wichtiges und laufende Bereich der Biomaterialien Forschung. Forscher haben versucht, dieses Problem durch Änderung Blutkontaktflächen mit bioaktiven Molekülen oder bioinert 4-6 anzugehen. Forschung in unserem Labor hat sich auf das Anhängen rekombinanten CD47 (recCD47) zu polymeren Biomaterialien als eine Strategie, um den FBR mildern und erhöhen die Wirksamkeit dieser Materialien. CD47 ist ein ubiquitär exprimiert transmembrane Protein mit einer bekannten Rolle in der Immun Steuerhinterziehung, verleiht Status &quot;Selbst&quot; auf exprimierenden Zellen 7-10 und Shows versprechen bei Übertragung der Biokompatibilität, wenn auf polymere Oberflächen 11-13 angehängt. Signal-Regulationsprotein alpha (SIRPα), der zugehörigen Rezeptor für CD47, und ein Mitglied der Immunrezeptor Tyrosin-basierte inhibitorische (ITIM) enthaltenden Familie von Transmembranproteinen, auf Zellen myeloiden Ursprungs 14 ausgedrückt. Wir haben zuvor gezeigt, dass CD47, über SIRPα-vermittelten Zellsignalisierung nach unten reguliert die Immunantworten auf Polyurethan (PU) und Polyvinylchlorid (PVC) in in vitro, ex vivo und in vivo-Modellen 11-13. Zentral unseren Untersuchungen ist eine relativ neue Photochemie, die hier beschrieben ist, in dem chemisch reaktive Thiolgruppen, die kovalent an Polymerschlauch durch Umsetzung der Schlauch mit einem multifunktionellen Polymers (PDT-Bz fügtenPh), 2-pyridyldithio (PDT) besteht, die photoreaktive Benzophenon (BzPh) und einem carboxy-modifizierten Polyallylamin 11-13. Reduzieren der kovalent angehängt PDT Gruppen mit Tris (2-carboxyethyl) phosphin-Hydrochlorid (TCEP) 11 liefert eine Oberfläche, die anschließend thiolierten sein kann mit therapeutischen Gruppierungen umgesetzt. Und hierin vorher beschrieben 12,13, recCD47, ferner mit der Zugabe eines C-terminalen Poly-Lysin 12,13 Schwanz modifiziert mit Sulfosuccinimidyl-4-[N -maleimidomethyl] cyclohexan-1-carboxylat umgesetzt (Sulfo-SMCC) für 1 h auf Thiol-reaktive Gruppen zu erzeugen, was eine Monosulfid-Bindungen zwischen dem Schlauch und recCD47 11. Die entzündungshemmende Fähigkeit der CD47 funktionalisierten Oberflächen getestet, ex viv o, mit der Chandler-Loop Vorrichtung mit menschlichem Vollblut, das ursprünglich im Jahr 1958 beschrieben wurde als ein in vitro-Modell der Thrombose Koagulation 15. Die Vorrichtung beruht auf einergeschlossenes Rohr, das teilweise mit Luft und einen Drehmotor, um das Blut durch den Schlauch 15 zirkulieren gefüllt. Dieses Versuchsmodell bietet die Möglichkeit, die Wirkung der Blutexposition auf modifizierten und unmodifizierten Oberflächen sowie die Auswirkungen dieser Oberflächenmodifizierungen auf die Physiologie der Zellen des Blutes zu untersuchen. recCD47 kann auf eine Vielzahl von polymeren Oberflächen mit diesen Photochemie angefügt werden, und seine entzündungshemmende Kapazität kann durch Verwendung eines klinisch relevanten ex vivo-Modell imitiert Blutperfusion auf polymeren Oberflächen 11,12 beurteilen. Klinischer Qualität Blutleitungen mit recCD47 verändert zeigen deutlich weniger Blutplättchen und Entzündungszellhaftung im Vergleich zu nicht modifizierten Polymeren, wann menschliches Blut in dem Gerät ausgesetzt. Eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung dieses Änderungsprozess wird im Folgenden aufgeführt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:107px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">16% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:107px;">58906</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">25% Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">AAA17876-AP&#160;</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH)</td>
			<td style="width:175px;">Synthesized in lab</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Citrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">S5770-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:107px;">DC500</td>
			<td>Out of production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">270547-100ML</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:175px;">Gibco/Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon</td>
			<td style="width:107px;">TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">A38-212</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Human CD47 (B6H12) &#8211; FITC Antibody</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:107px;">SC-12730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:175px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:107px;">197450050</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Potassium Bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">237205-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit)</td>
			<td style="width:175px;">Terumo Cardiovascular Systems</td>
			<td style="width:107px;">60050</td>
			<td>Most clinical-grade tubing will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JSM-T330A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:269px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:269px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:107px;">Spectramax Gemini EM&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sulfo-SMCC</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M6035-10MG</td>
			<td>Moisture Sensitive!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:107px;">20491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:269px;">Tris Base</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>T1503-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:269px;">Tween-20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">H-1200</td>
			<td>Light sensitive!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Zeba Spin Desalt Columns &#8211; 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:107px;">89891</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the ex vivo chandler loop apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits

Die Fremdkörperreaktion tritt auf, wenn eine Kunststoffoberfläche ist mit dem Körper eingeführt. Es wird durch die Adsorption von Blutproteinen und die anschließende Bindung und Aktivierung von Blutplättchen, Monocyten / Makrophagen-Adhäsion und entzündliche Zellsignalisierungsereignisse gekennzeichnet, was zu postoperativen Komplikationen. Chandler-Loop Vorrichtung ist ein experimentelles System, das die Forscher die molekularen und zellulären Wechselwirkungen, wenn große Blutvolumina werden über Leitungen polymeren perfundiert auftreten studieren kann. Zu diesem Zweck ist diese Vorrichtung als Ex-vivo-Modell ermöglicht die Beurteilung der entzündungshemmenden Eigenschaften der verschiedenen Polymeroberflächenmodifikationen verwendet. Unser Labor hat gezeigt, dass Blutleitungen, kovalent über Photochemie mit rekombinanten CD47 geändert können Biokompatibilität auf polymeren Oberflächen verleihen. Anhängen von CD47 auf polymeren Oberflächen könnte ein wirksames Mittel, um die Wirksamkeit der polymeren Blutleitungen zu fördern. SieEin ist die Detaillierung der Methodik der Photochemie verwendet, um rekombinantes CD47 klinisch relevante polymeren Blutleitungen und der Verwendung der Chandler-Loop als Ex-vivo-Versuchsmodell hängen, um Blut CD47-Wechselwirkungen mit den modifizierten und Steuerleitungen zu untersuchen.

Erzeugen Thiol-reaktiven polymeren Oberflächen durch die Verwendung von PDT-BzPh und TCEP mit Thiol-reaktiven recCD47 Poly-Lysin unter Verwendung von SMCC ermöglicht die Befestigung recCD47 auf polymeren Oberflächen. Das Modifizierungsverfahren ist schematisch in Abbildung 1 zusammengestellt. Die Bequemlichkeit des Modifikationsprozesses ist, dass sie auf viele verschiedene Proteine ​​und viele verschiedene Polymeroberflächen aufgebracht werden, vorausgesetzt, das Protein mit genügend chemisch reaktiven Gruppen, wie Amin-enthaltenden Lysine und modifiziert werden daß das Polymer ausreichend vorhanden Kohlenwasserstoffe. Es ist zuvor gezeigt worden, daß recCD47 können auf polymere Oberflächen unter Verwendung dieses Protokolls 11-13 hängt. Wie in 3A gezeigt ist, ist bezeichnend für FITC-Färbung sichtbar recCD47 mit einem FITC-konjugierten Antikörpers an die extrazelluläre Ig-Domäne von CD47, die spezifisch an den Film lokalisiert ist, wie durch DIC-Bildgebung dargestellt(3B). Diese Ergebnisse zeigen, dass recCD47 kovalent an Polyurethanfolien angebracht werden. Messen der Fluoreszenzeinheiten und Vergleichen mit einer Standardkurve bestimmt die Konzentration der oberflächengebundenen recCD47. Wir haben gezeigt, dass recCD47 kann auf polymere Oberflächen auf einem Niveau von mehr als 500 ng / cm 2,11-13 angehängt werden. Diese Ergebnisse bestätigen, daß diese Thiol-basierte Polymermodifikation Protokoll kann verwendet werden, um Polylysin-modifizierte rekombinante Proteine, polymere Oberflächen angehängt werden. CD47 wurde gezeigt, dass ein Marker &quot;selbst&quot; Verhütung von entzündlichen Zellhaftung und Aktivierung des Immunsystems 7-13. In vivo-Bedingungen so nahe wie möglich in einem ex-vivo-Situation nachahmt, kann menschliches Vollblut durch einfache und modifizierte Polymerrohrleitung im Chandler-Loop Vorrichtung perfundiert werden (in 2 gezeigt). Zellbindung an den Schlauch über DAPI-Färbung (beurteilen <sTrong&gt; 4) und SEM (Abbildung 5). Zellzählungen durch DAPI-Färbung erhalten zeigen, dass beigefügten recCD47 signifikant (p = 0,004) hemmt die Zellhaftung im Vergleich zu nicht modifizierten Oberflächen (4A und 4B). Die DAPI-Zellzahlen wurden durch SEM bestätigt, zeigt ein ähnliches Niveau der Zellbindung an unmodifizierten und modifizierten Oberflächen recCD47 (Abbildung 5). Diese Daten zeigen, dass die Anhängsel recCD47, unter Verwendung des hierin beschriebenen Protokolls, entzündliche Zellhaftung in einem ex vivo Modell der Durchblutung signifikant inhibiert. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Oberflächenmodifikation. A) Thiolierte Polymeroberflächen wurden durch Inkubation der Polymeroberfläche mit dem Vernetzer photoaktivierbares PDT-BzPh und anschließende Reduktion mit TCEP. B) erzeugt &lt;/ Strong&gt; SMCC wurde verwendet, um thiolreaktive recCD47, die dann mit der Kunststoffoberfläche zu thiolierte recCD47 funktionalisierten Oberflächen ergeben reagiert wurde zu produzieren. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Chandler Loop-Gerät. A) Die Apparatur besteht aus einem Wasserbad auf 37 ° C, an einer Metallstange mit einem Drehmotor befestigt festen Drehräder erhitzt. Dieser Aufbau ermöglicht den Drehmotor, um die Räder zu drehen, wodurch das Eintauchen Abschnitte des Schlauchs in das 37 ° C Wasserbad und Perfusion von Blut durch den Schlauch. B) Metalladapter verwendet werden, um die Enden der Rohrleitung eine Schleife bildet, zu verbinden um eine der drehenden Räder. Blut wird in den Rohren durch die Metallventilöffnung aufgenommen und mit dem Ventilkappe. C) begrenzt Einmal montiert, ist der Schlauch und Metallventil kuscheligen ar passenound das Drehrad, wie hier mit einem Leerrohr gezeigt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Quantisierung recCD47 auf Polyurethan-Filme. Antikörper gegen das äußere Ig-Domäne von CD47 gerichtet wurden verwendet, um die Menge an recCD47 Polyurethanfolien gebunden quantifizieren. Fluoreszenzmikroskop Bilder unter 200-facher Vergrößerung mit geeigneter Filtersätze, die Detektion von FITC recCD47 Polyurethan (A) angehängt genommen. (B) DIC-Bilder zeigen, dass FITC Signal spezifisch für die Polyurethan-Film ist. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Zelladhäsion an unmodifizierten und modifizierten Polyurethan-recCD47. Menschliches Vollblut wurde gesammelt und über perfundiert unmodifiziert oder recCD47 modifiziertenPU-Folien für 3 Stunden. Nach 3 Stunden Perfusion wurden Filme mit DPBS gewaschen und die anhaftenden Zellen wurden mit 4% PFA über Nacht bei 4 ° C fixiert und DAPI für 30 Minuten bei Raumtemperatur gefärbt. DAPI-gefärbten Zellen wurden mit einem Fluoreszenz-Mikroskop unter 200-facher Vergrößerung und entsprechenden Filtersätzen gezählt. (A) 9 zufällig ausgewählte Gesichtsfelder wurden für jede Änderung gezählt. (B) die Daten repräsentativ für 9 Sehfelder und ist als Mittelwert ± Standardabweichung (p = 0,004) ausgedrückt. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/51871/51871fig5highres.jpg" /> Abbildung 5. REM-Analyse von recCD47 modifiziert und Steuerflächen infolge der Ex-vivo-Analyse. Menschliches Vollblut wurde gesammelt und über unmodifiziert oder recCD47 modifizierten PVC-Schlauch für 3 h durchströmt. Repräsentative Bilder zeigen deutliche Zellbindung an unmodified Flächen während recCD47-modifizierten Oberflächen zeigen nur gelegentlich angebracht Zelle.

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The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

Die Verwendung der<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Chandler Loop-Gerät, um die Biokompatibilität von modifizierten polymeren Blutleitungen beurteilen

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

the-use-ex-vivo-chandler-loop-apparatus-to-assess-biocompatibility

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

11.5K Aufrufe.  The Children's Hospital of Philadelphia. Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits. 

Serie: The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Forschung

Biotechnik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menschliche Plazentaperfusion Modell

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Gentransfektion in Richtung Spheroid Zellen auf mikrostrukturierten Kulturplatten für genetisch veränderte Zelltransplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential to establish an ex vivo model that can evaluate SIM performance accurately, for developing high-performance SIMs. In our previous study, we developed a new ex vivo model that can be used to evaluate the performance of various SIMs in detail by applying constant tension to the specimen&#39;s ends. We also confirmed that the proposed new ex vivo model allows accurate submucosal elevation height (SEH) measurement under uniform conditions and detailed comparisons of the performances of various types of SIMs. Here, we describe the new ex vivo model and explain the detailed setup methodology of this model. Since all parts of the new model were easy to obtain, the setup of the new model could be completed quickly. SEH of various SIMs could be measured more accurately by using the new model. The critical factor that determines SIM performance can be identified using the new model. SIM development speed will drastically increase after the factor has been identified.

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

We developed a new ex vivo model that applies constant tension to the porcine gastric specimen. This development made it possible to evaluate the performance (the height and duration of the submucosal elevation) of various SIMs accurately.&#160; The detailed setup methodology of this new model is explained.

Ein neues Ex Vivo Modell für die Bewertung der endoskopischen Submucosal Einspritzung Materialverhalten

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Intrakardialer Side-Firing Light Katheter zur Überwachung des Zellstoffwechsels mit transmuraaler Absorptionsspektroskopie von perfundierten Säugetierherzen

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, improving the biocompatibility of metal stents remains a significant challenge. The goal of this protocol is to describe a robust technique of metal surface modification by biologically active peptides to increase biocompatibility of blood contacting medical implants, including endovascular stents. CD47 is an immunological species-specific marker of self and has anti-inflammatory properties. Studies have shown that a 22 amino acid peptide corresponding to the Ig domain of CD47 in the extracellular region (pepCD47), has anti-inflammatory properties like the full-length protein. In vivo studies in rats, and ex vivo studies in rabbit and human blood experimental systems from our lab have demonstrated that pepCD47 immobilization on metals improves their biocompatibility by preventing inflammatory cell attachment and activation. This paper describes the step-by step protocol for the functionalization of metal surfaces and peptide attachment. The metal surfaces are modified using polyallylamine bisphosphate with latent thiol groups (PABT) followed by deprotection of thiols and amplification of thiol-reactive sites via reaction with polyethyleneimine installed with pyridyldithio groups (PEI-PDT). Finally, pepCD47, incorporating terminal cysteine residues connected to the core peptide sequence through a dual 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl spacer, are attached to the metal surface via disulfide bonds. This methodology of peptide attachment to metal surface is efficient and relatively inexpensive and thus can be applied to improve biocompatibility of several metallic biomaterials.

Presented here is a protocol for appending peptide CD47 (pepCD47) to metal stents using polybisphosphonate chemistry. Functionalization of metal stents using pepCD47 prevents the attachment and activation of inflammatory cells thus improving their biocompatibility.

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Blutfluss-Bildgebung mit ultraschnellem Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...