Die Autoren bedanken sich für die künstlerischen Beiträge der Hyewon Cooper.

<ol>
	<li>Whitear, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chordotonal+organs+in+Crustacea.">Chordotonal organs in Crustacea.</a> Nature. 187, 522-523 (1038).</li><li>Alexandrowicz, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comparative+anatomy+of+leg+propriocetors+in+some+decapod+Crustacea.">The comparative anatomy of leg propriocetors in some decapod Crustacea.</a> J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 52 (3), 605-634 (1972).</li><li>Hartman, H. B., Boettiger, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+organization+of+the+propys-dactylus+organ+in+Cancer+irroratus+Say.">The functional organization of the propys-dactylus organ in Cancer irroratus Say.</a> Comp. Biochem. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Potentials,+Synaptic+Responses,+Neuronal+Circuitry,+Neuromodulation+and+Muscle+Histology+Using+the+Crayfish:+Student+Laboratory+Exercises.">Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises.</a> J. Vis. Exp. (47), e2322 (2011).</li><li>Delaney, K., Gelperin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+interneurons+controlling+fictive+feeding+in+Limaxmaximus;+I.+Anatomy+and+criteria+for+re-identification.">Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limaxmaximus; I. Anatomy and criteria for re-identification.</a> J. Comp. Physiol. A. 166, 297-310 (1990).</li><li>Hartman, H. B., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+molting+effects+on+a+proprioceptor+organ+in+the+Dungeness+crab,+Cancer+magister.">Regeneration and molting effects on a proprioceptor organ in the Dungeness crab, Cancer magister.</a> J. Neurobiol. 25 (5), 461-471 (1994).</li><li>Hartman, H. B., Austin, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proprioceptor+organs+in+the+antennae+of+Decapoda+Crustacea.">Proprioceptor organs in the antennae of Decapoda Crustacea.</a> J. Comp. Physiol. 81 (2), 187-202 (1972).</li><li>Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sensory+processes+during+limb+regeneration+in+adult+crayfish.">Development of sensory processes during limb regeneration in adult crayfish.</a> J. Exp. Biol. 201 (Pt 11), 1745-1752 (1998).</li><li>Chung, Y. -. S., Cooper, R. M., Graff, J., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+and+chronic+effect+of+low+temperature+on+survival,+heart+rate+and+neural+function+in+crayfish+(Procambarus+clarkii)+and+prawn+(Macrobrachium+rosenbergii)+species.">The acute and chronic effect of low temperature on survival, heart rate and neural function in crayfish (Procambarus clarkii) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) species.</a> Open J. Mol. Int. Physiol. 2 (3), 75-86 (2012).</li><li>Blundon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+and+thermal+history+on+neuromuscular+properties+of+two+crustacean+species.">Effects of temperature and thermal history on neuromuscular properties of two crustacean species.</a> J. Comp. Physiol. B. 158 (6), 689-696 (1989).</li><li>Cooper, R. M., Schapker, H., Adami, H., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+and+ventilatory+measures+in+crayfish+during+copulation.">Heart and ventilatory measures in crayfish during copulation.</a> Open J. Mol. Int. Physiol. 1 (3), 36-42 (2011).</li><li>Bierbower, S. M., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanistic+action+of+carbon+dioxide+on+a+neural+circuit+and+NMJ+communication.">The mechanistic action of carbon dioxide on a neural circuit and NMJ communication.</a> Journal of Experimental Zoology. , (2013).</li><li>Bierbower, S. M., Shuranova, Z. P., Viele, K., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+systems+and+environmental+change+on+behavior+during+social+interactions.">Sensory systems and environmental change on behavior during social interactions.</a> Brain Behav. 3 (1), 4-13 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Der Zweck dieser Versuchsreihe 1) von einer identifizierbaren propriozeptiven Nervenspannorgan und lehren und zeigen die Grundprinzipien der extrazellulären Aufzeichnungen und 2) die Bedeutung von anatomischen Karten für die physiologische Funktion von bestimmten sensorischen Systeme streichen. Dieser experimentelle Ansatz und die Tiermodelle verwendet werden, sind preiswert und relativ einfach in der Neurophysiologie Lehrlabors durchzuführen. Die Neuronen Chordotonalorgane sind von zwei spezifischen Funktionstypen, die, die auf Bewegungen und die Reaktion auf statische Positionen. Einzelzellaufnahmen aus einer Vielfalt von Chordotonalorgane, egal welche gemeinsamen untersucht wird, haben gezeigt, dass dies der Fall 3,5 sein. Tatsächlich Chordotonalorgane mit den Antennenverbindungen von Hummer verbunden zeigen die gleichen zwei Sinnestypen und grundlegende Anatomie 27. Zusätzlich zu, dass es zwei Neuronentypen (Bewegung und position), die Neuronen die gleiche anatomische Anordnung an ihren jeweiligen elastischen Fäden. Die große Somata proximal am Strang befindet eher auf die dynamische Bewegung sensiblen Neuronen gehören. Neuronen, die statischen Positionen signalisiert haben kleine Zellkörper und distal entfernt. Diese Zellen sind tonisch aktiv. Der PD-Joint enthält nur einen einzigen chordotonal Orgel, während es zwei Chordotonalorgane in der Handwurzel-propodus (CP) und merus-Handwurzel (MC) Gelenke. Die Präparation auf propriozeptiven Strukturen in Blaukrabben (C. sapidus) für elektrophysiologische Aufnahme aussetzen erfordert eine Strategie, die Gelenkbewegungen statt in den Natur Positionen zu nehmen, während der Aufnahme von sensorischen Neuronen ermöglicht. Die Spannung, Nerven für den Opener Muskel im Bein Walking ist eine sehr feine Nerven aus mehreren Neuronen. Sofern darauf geachtet wird, die Spannung Nerven sowie der motorischen Nerven innervieren die Muskeln stimuliert werden, können in dieser Präparation beschädigt werden. Füroptimale Aufnahmen Saugelektroden müssen auf die Größe des Nervs angepasst werden. Aufnahmen sind in einem Schülerlabor mit einer 30-40-facher Vergrößerung Binokular-und Low-End-Mikromanipulatoren leicht zugänglich. Zukünftige Experimente, das wäre interessant, mit den gemeinsamen Chordotonalorgane verfolgen wäre, die strukturellen und physiologischen Beinprofile während der Regeneration bei verschiedenen Spezies in verschiedenen Phasen des Lebenszyklus zu untersuchen, wie eine Folgemaßnahme zu einer ersten Studie, die Cancer magister 19,26 verwendet . Fragen noch zu richten sind: 1) hat die Verteilung und Organisation von Nervenzellen regeneriert hängen vom Alter des Tieres beim Regenerieren ein Glied, 2) sind die axonalen Projektionen des ZNS (Bauchmark) in einem Regenerations Gliedmaßen Funktions oder tut es nehmen Sie sich Zeit und die gemeinsame Nutzung zu funktionellen Verbindungen herzustellen, und 3), was passiert mit den abgetrennten Axone proximal der Autotomie Ebene, wenn das Glied autotomized? 28 Krebstiere entsprechen den Umweltbedingungen und ihrer Umgebungstemperatur, aber es ist unklar, wie sie Koordination zu erhalten in einem neuronalen Schaltkreis, wie Nervenzellen ändern ihre Aktivität in Reaktion auf Temperaturänderungen. Eine langsame Geschwindigkeit der Änderung könnte dem Tier einige Zeit zur Akklimatisierung zu ermöglichen, während eine schnelle Änderung kann not29, 30. Physiologische Veränderungen im pH-Wert oder Osmolarität durch Stoffwechsel, Verhalten 31 oder Auswirkungen auf die Umwelt können ähnliche Herausforderungen zu neuronalen Schaltkreise in Propriozeption beteiligt zu präsentieren. Diese Krustentierpräparate sind ideal für die Lösung dieser Art von Problemen, weil ihre Funktion auch bei einer Einzelzellebene aus. In diesem Protokoll haben wir die physiologische Bedeutung der Spannung Neuronen bei der Überwachung der Kraft, die von dem Opener Muskel erzeugt demonstriert. Diese Spannung Rezeptoren können, um ihre Position innerhalb der apodeme mithilfe Färbeverfahren zurückverfolgt werden. DieseNeuronen, wie in Säugetieren, erkennen Kraft auf verschiedenen Ebenen und zu rekrutieren zusätzliche Neuronen wie die Kraft steigt. Die Frequenz der Aktivität hängt mit der Anregungsfrequenz des Motors Neuron bis zur Sättigung in Empfang erreicht wird. Mit einem Schnellverschluss-Protokoll mit dem gebogenen dactylus Gelenk, schnell verschwindet Spannung Aktivität, sondern kehrt auf die Wiedererlangung Spannung in einer vollständig ausge Joint dann. Dies ist ein klassisches experimentelles Verfahren, um die Kraft auf Zug-Rezeptoren gemessen illustrieren. Verschiedene Neuromodulatoren können sich auf die Herstellung angewendet werden, um zu sehen, wie sie die Entwicklung der Kraft und der neuronalen Reaktion bewirkt. Einer der wichtigsten Aspekte ist, wie die neuronalen Antworten werden verarbeitet und im Zentralnervensystem und ihr Einfluss auf die Aktivität von Motoneuronen integriert. Die Techniken, die wir gezeigt haben, erlauben es, zu starten, um mehr Informationen über die Spannung (sensorischen) Nerven Motor Neuron Schaltungsfunktion, dh das Signal in einem intakten Bein zum Ganglion und Rücken Adresseauf den Muskel. Die Färbung Verfahren nachgewiesen sind der Schlüssel zum Verständnis der Physiologie der Sinnesnervenzellen, die propriozeptiven Organe innervieren. Anatomische Anordnung der Neuronen basierend auf der Funktion und der Größe des Soma sind ähnlich in den verschiedenen Chordotonalorgane innerhalb der Krabben Beine. Es ist nicht bekannt, ob ähnliche neuronale Arrangements sind auch in anderen Schalentierarten und Insekten gefunden. Die Kombination von physiologischen Aufnahmen von Einzelzellen und Kartierung der Lage ermöglicht direkten Strukturfunktionsbeziehungen. Die langfristige Erhaltung der anatomischen Anordnung mit CoCl 2-Färbung und Fixierung ermöglicht es, wiederholt zu Maßnahmen und Bewertung der strukturellen Anordnung. Propriozeption und Spannung Empfang der Skelettmuskeln sind Sinnesmodalitäten, die koordinierte Verhaltensweisen und Reaktionen auf externe und interne Umfeld für Gelenktiere in einer Vielzahl von Skelettmuskel-Konfiguration zu aktivierens. Der Muskel-Rezeptor-Orgel in der Bauch der Krebse ist eine weitere gut dokumentierte Vorbereitung (siehe Crawdad Projekt; <a href="http://www.crawdad.cornell.edu/">http://www.crawdad.cornell.edu/</a> ) für Lehrzwecke der Propriozeption mit nur zwei Neuronen pro Bauch Hemi-Segment 23 . Die Möglichkeit, von einzelnen Nervenzellen auf sensorische Nervenbündel aufnehmen weitere Einzelheiten, dass die Hilfe für das Verständnis der grundlegenden Prinzipien der sensorischen Rezeption. Diese relativ einfache Krustentierpräparate erlauben es, grundlegende Aspekte der Propriozeption und Spannungsüberwachung anzugehen, mit dem Potenzial, die neuronalen Schaltkreise, die zentrale Integration von propriozeptiven und andere sensorische Eingänge 9-12, 32, 33 ermöglichen zu bestimmen.

Propriozeption ist die Empfindung von Gliedmaßen Position und Bewegung, die koordinierte Verhalten des Motors ermöglicht. Propriozeptoren aus Position (statisch) und Bewegung (kinästhetischen)-Rezeptoren. Bei Insekten und Krebstiere, Chordotonalorgane sind die Strukturen, die diese Informationen an das ZNS 1 vorzusehen. Nicht alle Chordotonalorgane spannen einen gemeinsamen, aber sie können immer noch Gelenkbewegungen aufgrund ihrer Befestigung auf den apodemes (Sehnen-Strukturen), die das Gelenk überspannen und sich in Verbindung mit der Skelettmuskulatur und Gelenkbewegung zu überwachen. Crab Beine haben sechs Gelenke, die jeweils mit einem oder zwei Chordotonalorgane 2. Typischerweise wird eine chordotonal Orgel hat 60 bis 100 oder mehr sensorischen Neuronen innerhalb eines elastischen Strang eingebettet ist, Neuronen, die statische gemeinsame Position, Richtung und Geschwindigkeit der Bewegung 06.03 signalisieren. Die Eingabe von Chordotonalorgane an jedem Gelenk-und Bein wird dann zentral verarbeitet so dass koordinierte Bewegungen durch das Tier. <p class="jove_content"&gt; Die Kräfte, die Beinmuskulatur während isometrischer und isotonische Kontraktionen werden durch Spannung Rezeptoren mit Muskelfasern und deren Anhänge zu apodemes7-9 zugeordnet erkannt. In den Krebstieren Laufbein Protokolle, präsentieren wir Methodik für die Aufnahmen von primären sensorischen Neuronen, die Propriozeption überwachen und den Neuronen, die Kräfte, die durch Muskelfaser erzeugt reagieren zu folgen. Eine Technik zum Aktivieren Beinbewegungen und Quantifizierung Krafterzeugung wird ebenfalls vorgestellt sowie anatomische Techniken, die verwendet werden können, um die Anordnung dieser peripheren Nervensystemstrukturen zu charakterisieren. Die unten demonstriert Verfahren ermöglichen strukturelle und funktionelle Analyse der Neuronen, die beide Arten von Rezeptoren relativ zu ihrer Lage auf einem chordotonal elastischen Strang und apodeme innervieren. Um zu veranschaulichen, verwenden wir die propodite-dactylopodite (PD) chordotonal Organ, das Organ, das den meisten distalen Segment der Krabbenbein 3 überspannt.Obwohl detaillierte elektrophysiologische Studien begann in den 1930er Jahren und werden noch heute aus durchgeführt wird, haben einige Aspekte werden über die Segmentverbindungen von Propriozeptoren in den verschiedenen Gelenken und ihre Rollen in der koordinierten Steuerung muscles10-16 bekannt. Festlegung der Struktur-Funktions-Beziehung zwischen den propriozeptiven Organe, Muskeln und das Nervensystem wird dazu beitragen, diese Rollen zu definieren. Zum Beispiel wird die Beschriftung der Somata und distalen Enden der Spannung in den Neuronen apodeme eingefügt ihrer Lage relativ zu Muskelfasern 8,17-21 offenbaren. Wir präsentieren drei Färbetechniken für Krustentier Beine, die in der Forschung und akademischen Labors verwendet werden kann. Methylenblau-Färbung bietet geeigneten Kontrast für Muskeln und Nerven und wird als eine einfache Technik für Studenten, um Anatomie zu lernen empfohlen. Labs, die Fluoreszenzmikroskopie Setups können selektiver neuronaler Färbung durch kurzes Aussetzen des Nerven erreichens an den Vitalfarbstoff 4-Di-2-ASP. Die dritte Alternative ist CoCl 2 Hinterfüllung, die die Nervenzellen färbt und fixiert, und keine Fluoreszenz-Bildgebung erforderlich. Obwohl es Arbeit und Zeit intensiv, diese Färbung verleiht hohen Kontrast und Spezifität für die Nerven, die gefüllt sind. Zusammen können diese Techniken für den Vergleich verschiedener Chordotonalorgane nicht nur innerhalb einer Extremität oder zwischen den Gliedern, sondern auch bei anderen Krebstier-und Insektenarten 20-22, verwendet werden. Blaue Krabben (C. sapidus) in physiologischen und anatomischen Aufnahmen Färbung verwendet werden, sind in der ganzen Süd-und Südostgrenze der Vereinigten Staaten zur Verfügung stehen. Diese Art dient als Vertreter der chordotonal und Spannung Nerven Regelungen in den meisten Krebse gefunden. Laboratories an der Westküste wird es vorziehen, die viel größer Dungeness Crab (Cancer magister) für diese Experimente zu verwenden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sylgard</td>
			<td style="width:184px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">182 silicone kit</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:184px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:184px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:184px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5670</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES acid</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3375</td>
			<td style="width:167px;">Free acid, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES base</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M2643</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">Na2SO4&#8226;10H2O</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">246980</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bouin&#8217;s solution fixative</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT10-1-32</td>
			<td style="width:167px;">Caution: Hazardous material (Special shipping cost required)</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">CoCl2</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methylene blue chloride</td>
			<td style="width:184px;">Matheson Co., Inc</td>
			<td style="width:119px;">Basic Blue 9, C.I. 52015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">4-Di-2-ASP</td>
			<td style="width:184px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bleach</td>
			<td style="width:184px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">To chloride silver wire</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:184px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221465</td>
			<td style="width:167px;">To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCl</td>
			<td style="width:184px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H1758</td>
			<td style="width:167px;">To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Materials</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting tools</td>
			<td style="width:184px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">assortment</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Intracellular electrode probe</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Faraday cage</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insect Pins</td>
			<td style="width:184px;">Fine Science Tools, Inc</td>
			<td style="width:119px;">26001-60</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting microscope (100X)</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fiber optic lamp</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Small adjustable mirror</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">To direct light beam toward the preparation.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass electrodes</td>
			<td style="width:184px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS7095B5X</td>
			<td style="width:167px;">Box of 200, suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:184px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MD4-M3-R</td>
			<td style="width:167px;">Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Raised preparation stand</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td style="width:184px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:119px;">782500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Computer</td>
			<td style="width:184px;">Any company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AC/DC differential amplifier</td>
			<td style="width:184px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:119px;">Model 3000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PowerLab 26T</td>
			<td style="width:184px;">AD Instruments</td>
			<td style="width:119px;">27T</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Force transducer</td>
			<td style="width:184px;">AD Instruments</td>
			<td style="width:119px;">0-50g</td>
			<td style="width:167px;">MLTF050/ST</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Head stage</td>
			<td style="width:184px;">AD Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LabChart7</td>
			<td style="width:184px;">AD Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Electrical leads</td>
			<td style="width:184px;">Any company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass tools</td>
			<td style="width:184px;">Make yourself</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cable and connectors</td>
			<td style="width:184px;">Any company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipettes with bulbs</td>
			<td style="width:184px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7</td>
			<td style="width:167px;">Box of 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beakers</td>
			<td style="width:184px;">Any company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wax or modeling clay</td>
			<td style="width:184px;">Any company or local stores</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stimulator</td>
			<td style="width:184px;">Grass Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SD9 or S88</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:216px;">Plastic tip for suction electrode</td>
			<td rowspan="2" style="width:184px;">Local hardware store (Watt&#8217;s brand)</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td style="width:167px;">Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proprioception and tension receptors in crab limbs: student laboratory exercises

Das primäre Ziel dieser Verfahren ist es, Lehre und Forschung zeigen, wie die Aktivität der lebenden primären sensorischen Neuronen für Propriozeption verantwortlich, da sie gemeinsame Erfassung Position und Bewegung und Muskelspannung aufzeichnen. Die elektrische Aktivität von Krebstier Propriozeptoren und Spannung Rezeptoren wird durch neurophysiologische Grundlagen Instrumentierung aufgezeichnet und ein Wandler wird verwendet, um gleichzeitig die Kraft, die durch Stimulation eines motorischen Nerven erzeugt wird. Außerdem zeigen wir, wie man die Neuronen für eine schnelle Beurteilung ihrer anatomischen Anordnung oder zur dauerhaften Fixierung färben. Die Färbung zeigt anatomische Organisation, die Vertreter der Chordotonalorgane in den meisten Krebstieren ist. Vergleichen der Spannung Nervenreaktionen auf die propriozeptive Antwort ist ein wirksames Werkzeug für die Lehre, wie diese sensorischen Neuronen funktional definiert und wie die Anatomie der Funktion korreliert. Drei Färbetechnikenpräsentiert so dass die Forscher und Dozenten, eine Methode, die sich ideal für ihre Labor ist zu wählen.

Wenn die PD Organ wird durch die gemeinsame, die sich voll gestreckt, ist Aktivität in der PD Nerven während der Bewegung wie bei der ersten Sekunde in Abbildung 10 dargestellt robust. Einige Aktivität bleibt, während es noch in der geöffneten Position gehalten wird. Diese Tätigkeit ist von den statischen positionsempfindlichen Neuronen (zweite Hälfte des in Abbildung 10 dargestellt Aufnahme). Bewegung ruft eine Reaktion während der Verschiebung, und die Brenn ist vor allem während der Streckung der chordotonal Strang (Abbildung 11) vorhanden ist. Eine weitere Analyse der Spitzen können leicht durch Sortieren der relativen Amplituden fahren werden. Dies ist ein Ansatz, um verschiedene Populationen von sensorischen Neuronen, die für Positionen oder Arten von Bewegungen 5 rekrutiert demonstrieren. Typische Amplituden reichen von 0,25 bis 1,5 mV, aber diese Werte sind abhängig von dem Widerstand (dh Dichtigkeit) der Saugelektrode Dichtung. Häufigkeit der Spitzen in ter verschiedene Größenbereiche können auch zur Analyse grafisch dargestellt werden. Kräfte, die durch den Öffner Muskel bezüglich der Stimulationsfrequenz erzeugt wird, kann durch Überlagerung der jeweiligen Spannung-Zeit-Spuren auf der jeweils anderen (13A und B) verglichen werden. Dies kann auch für jedes gemeinsame Position zu jedem gegebenen Stimulationsfrequenz durchgeführt werden. Aktivität des Nerven Spannung kann dann mit dem Betrag der relativen Kraft an jedem Stimulationsfrequenz erzeugt korreliert werden, und für jede gemeinsame Position. Wie in der PD Nerven werden eine Vielzahl von Spitzenamplituden entsprechend der Kontraktion des Muskels Öffner (Fig. 13C) gesehen. Anatomische Anordnung der Neuronen in der Laufbein ist eindeutig mit Methylenblaufärbung (Fig. 14) beobachtet. Beachten Sie die elastischen chordotonal Strang und Spannung Neuron, das in der Nähe des apodeme ist. Mehrere Zellkörper mit unterschiedlichen Durchmessern eind bestimmten Orten sind auch in dieser Figur sichtbar. Der gesamte Verlauf der Spannung und Nerven Trage motorischen Nerven sind in Abbildung 15 dargestellt. Einzelne Neuronen des Nerven PD mit höheren Kontrast mit 4-Di-2-ASP (Abbildung 16) und CoCl 2 (Abbildung 17) Hinterfüllung Techniken gezeigt. Bei hoher Vergrößerung die sensorischen Endungen kann innerhalb der unterstütz scolopales (16B) 21,22,26 gesehen werden. <img alt="10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig10.jpg" width="500px" /> Abbildung 10. Bewegen und halten bei 0 °. Die dynamischen Neuronen sind robust in Brand während der Bewegung und Spitzen von elektrostatisch empfindlichen Neuronen vorhanden sind, während die Verbindung offen gehalten. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51050/51050fig10highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht &lt;</a>/ A&gt;. <img alt="11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig11.jpg" width="500px" /> Abbildung 11. Schneller und Schließen von offenen voll ausgebaut (90-0 °) Position gebogen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51050/51050fig11highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="12" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig12.jpg" width="500px" /> Abbildung 12. Extrazelluläre Spikes von der PD Nerven aufgezeichnet. Das Gelenk ist voll ausgefahren und dann schnell bewegt, um einen ½ Beugestellung und dann ruhig halten. Beachten Sie die Aktivität während der Bewegung und verminderte Aktivität, wenn statisch. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51050/51050fig12highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um größere ima ansehen</a>ge. <img alt="13" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig13.jpg" width="500px" /> Abbildung 13. Die relativen Kräfte, die mit der gemeinsamen Entwicklung sind komplett gebogen und an den verschiedenen Frequenzen stimuliert. (A) Spannung-Zeitspuren aus dem Kraftaufnehmer sind mit jedem Stimulationsfrequenz gezeigt. (B) Die Spuren in Feld A sind in verschiedenen Farben für Leichtigkeit im Vergleich überlagert. (C) Spannung-Zeitverläufe der elektrischen Aktivität von Nerven der Spannung aufgezeichnet, wenn die motorischen Nerven wurde bei 80 Hz stimuliert. Beachten Sie die regelmäßigen Muster der Reizartefakten im Vergleich zu der neuronalen Aktivität. Beachten Sie auch, die verschiedenen Amplituden der neuronalen Antworten. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51050/51050fig13highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . Abbildung 14. Methylenblau-Färbung des Laufbein Vorbereitung. Individuelle Somen sind mit ihren sensorischen Endungen in den elastischen Strang vorstehenden gezeigt. In der Nähe des apodeme eine Spannung Neuron gezeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51050/51050fig14highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="15" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig15.jpg" width="500px" /> Abbildung 15. Nerven Die Spannung, die sich aus distalen Ende (rote Pfeile) und Verbinden der motorischen Nerven (grüner Pfeil). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51050/51050fig15highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . Abbildung 16. (A) Ein Back-Füllung des PD Nerven in Cancer magister mit 4-Di-2-ASP. (B) Höhere Vergrößerung von sensorischen Endungen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51050/51050fig16highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="17" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51050/51050fig17.jpg" width="500px" /> Abbildung 17. Neuronen, die mit CoCl 2 befüllt und verarbeitet wurden (A). Traced Umriss der Vorbereitung gezeigt gefärbt (B). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51050/51050fig17highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <table border="0" cellpadding="0" cellspacIng. = &quot;0&quot; width = &quot;392&quot;&gt; <colgroup><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:235px;"> Salzig </td><td style="width:157px;"> g / L </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:235px;"> NaCl </td><td style="width:157px;"> 27.29 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:235px;"> KCl </td><td style="width:157px;"> 0,81 </td></tr><tr height="26"><td height="26" style="height:26px;width:235px;"> MgSO 4 • 7H 2 O </td><td style="width:157px;"> 4,81 </td></tr><tr height="26"><td height="26" style="height:26px;width:235px;"> CaCl 2 • 2H 2 O </td><td style="width:157px;"> 1,85 </td></tr><tr height="26"><td height="26" style="height:26px;width:235px;"> Na 2 SO 4 • 10H 2 O </td><td style="width:157px;"> 0,97 </td></tr><tr height=&quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;width:235px;"> Dextrose (D-Glucose) </td><td style="width:157px;"> 1.982 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:235px;"> HEPES Säure </td><td style="width:157px;"> 0.476 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:235px;"> HEPES Salz </td><td style="width:157px;"> 2,08 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:235px;"> Auf pH 8,1 mit NaOH oder HCl </td><td style="width:157px;"></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Krabben Rezepte für Kochsalzlösung.

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Propriozeption und Spannungsrezeptoren in Krabbengliedern | Neurowissenschaften | Video

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

Physiologischen und anatomischen Techniken werden gezeigt, Funktion und Struktur für die gemeinsame Propriozeptoren und Muskelspannung Rezeptoren in Krebstier Fuß Gliedmaßen zu adressieren.

Propriozeption und Spannungsrezeptoren in Crab Gliedmassen: Schülerlabor Übungen

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...

proprioception-tension-receptors-crab-limbs-student-laboratory

Nanyang Technological University

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25.1K Aufrufe.  University of Kentucky.  Physiologischen und anatomischen Techniken werden gezeigt, Funktion und Struktur für die gemeinsame Propriozeptoren und Muskelspannung Rezeptoren in Krebstier Fuß Gliedmaßen zu adressieren. 

Serie: Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in rodents have shown a direct link between testosterone and aggressive behavior1 and folk wisdom adapts these findings to humans, suggesting that testosterone induces antisocial, egoistic or even aggressive behavior2. However, many researchers doubt a direct testosterone-aggression link in humans, arguing instead that testosterone is primarily involved in status-related behavior3,4. As a high status can also be achieved by aggressive and antisocial means it can be difficult to distinguish between anti-social and status seeking behavior.
We therefore set up an experimental environment, in which status can only be achieved by prosocial means. In a double-blind and placebo-controlled experiment, we administered a single sublingual dose of 0.5 mg of testosterone (with a hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin carrier) to 121 women and investigated their social interaction behavior in an economic bargaining paradigm. Real monetary incentives are at stake in this paradigm; every player A receives a certain amount of money and has to make an offer to another player B on how to share the money. If B accepts, she gets what was offered and player A keeps the rest. If B refuses the offer, nobody gets anything. A status seeking player A is expected to avoid being rejected by behaving in a prosocial way, i.e. by making higher offers.
The results show that if expectations about the hormone are controlled for, testosterone administration leads to a significant increase in fair bargaining offers compared to placebo. The role of expectations is reflected in the fact that subjects who report that they believe to have received testosterone make lower offers than those who say they believe that they were treated with a placebo. These findings suggest that the experimental economics approach is sensitive for detecting neurobiological effects as subtle as those achieved by administration of hormones. Moreover, the findings point towards the importance of both psychosocial as well as neuroendocrine factors in determining the influence of testosterone on human social behavior.

The procedure described in this protocol shows that testosterone administration and folk beliefs about testosterone may be associated with directly opposed social behaviors.

Die Kombination Behavioral Endokrinologie und Experimentelle Wirtschaftsforschung: Testosteron und Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Forschung

Neurowissenschaften

Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that influence a cell's membrane potential and which we address in these experiments are: (1) Ion concentration of K+ on the outside of the membrane, and (2) the permeability of the membrane to specific ions. The crayfish abdominal extensor muscles are in groupings with some being tonic (slow) and others phasic (fast) in their biochemical and physiological phenotypes, as well as in their structure; the motor neurons that innervate these muscles are correspondingly different in functional characteristics. We use these muscles as well as the superficial, tonic abdominal flexor muscle to demonstrate properties in synaptic transmission. In addition, we introduce a sensory-CNS-motor neuron-muscle circuit to demonstrate the effect of cuticular sensory stimulation as well as the influence of neuromodulators on certain aspects of the circuit. With the techniques obtained in this exercise, one can begin to answer many questions remaining in other experimental preparations as well as in physiological applications related to medicine and health. We have demonstrated the usefulness of model invertebrate preparations to address fundamental questions pertinent to all animals.

The experiments demonstrate an easy approach for students to gain experience in examining muscle structure, synaptic responses, the effects of ion gradients and permeability on membrane potentials. Also, a sensory-CNS-motor-muscle circuit is presented to show a means to test effects of compounds on a neuronal circuit.

Membranpotentiale, Synaptic Responses, neuronalen, Neuromodulation und Muscle Histologie Mit dem Crayfish: Schülerlabor Übungen

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that ...

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this experiment is to learn anatomy of the preparation by staining, dissection and viewing of neurons and sensory structures under a dissecting microscope. This is performed by using basic neurophysiological equipment to record the electrical activity from a joint receptor organ and staining techniques. The muscle receptor organ (MRO) system in the crayfish is analogous to the intrafusal muscle spindle in mammals, which aids in serving as a comparative model that is more readily accessible for electrophysiological recordings. In addition, these are identifiable sensory neurons among preparations. The preparation is viable in a minimal saline for hours which is amenable for student laboratory exercises. The MRO is also susceptible to neuromodulation which encourages intriguing questions in the sites of modulatory action and integration of dynamic signals of movements and static position along with a gain that can be changed in the system.

The primary purpose of this experiment is to understand how primary sensory neurons convey information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this report is present the anatomy of the preparation by dissection and viewing of neurons under a dissecting microscope.

Muscle-Rezeptor-Organe in der Crayfish Abdomen: Ein Schülerlabor Übung in Propriozeption

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive ...

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings with a force transducer to monitor the strength of contraction. In addition, we demonstrate how to visually monitor peristaltic activity, which can be used as a bioassay for various peptides, biogenic amines and neurotransmitters. This preparation is amenable to student laboratories in physiology and for demonstrating pharmacological concepts to students. This preparation has been in use for over 100 years, and it still offers much as a model for investigating the generation and regulation of peristaltic rhythms and for describing the mechanisms underlying their modulation. The pharmacological assays and receptor sub-typing that were started over 50 years ago on the hindgut still contribute to research today. This robust preparation is well suited to training students in physiology and pharmacology.

In this report we demonstrate techniques that can be used to investigate the biology of the crayfish hindgut. We show how to dissect a crayfish abdomen and study the associated anatomy, physiology and modulation of activity. The peristaltic activity and strength of contractions are measured using a force transducer.

Physiologische Experimente mit den Crayfish Enddarm: Ein Schülerlabor Übung

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings ...

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

The vivid world of odors is recognized by the sense of olfaction. Olfaction in mice is mediated by a repertoire of about 1200 G Protein Coupled Receptors (GPCRs) 1 that are postulated to bind volatile odorant molecules and converting the extracellular signal into an intracellular signal by coupling with G protein G&alpha;olf. Binding of the odorants to the receptors is thought to follow a combinatorial rule, that is, one odorant may bind several receptors and one receptor may bind several odorants to varying degrees 2. Biochemical, signaling and ligand binding studies have been conveniently carried out for most GPCRs using heterologous cells. However use of heterologous cells for study of odorant receptors, was precluded for a long time since on transfection they failed to export to the surface. Saito et al have demonstrated single membrane pass Receptor Transporting Protein (RTP) family chaperones show enhanced expression in the olfactory sensory neurons and act as chaperones to traffic odorant receptors to the surface in heterologous cells, when co transfected together 3. To carry out biochemical assays for receptors using heterologous cells, one must first determine if the receptor shows robust surface expression in the cell line. This can be assayed by overexpressing the receptors with the chaperone RTP1S followed by live cell staining to fluorescently label the extracellular domain or a tag in the extracellular domain exclusively. Here we demonstrate a protocol to carry out live cell staining that can be used to detect odorant receptors on the surface of HEK293T cells conveniently. In addition, it may also be used to assay for surface expression of other chemosensory receptors or GPCRs.

Here we demonstrate a protocol to carry out live cell staining that can be used to detect odorant receptors on the surface of HEK293T cells conveniently. In addition, it may also be used to assay for surface expression of other chemosensory receptors or GPCRs.

Assaying Oberfläche Expression von Chemosensoren in heterologen Zellen

The vivid world of odors is recognized by the sense of olfaction. Olfaction in mice is mediated by a repertoire of about 1200 G Protein Coupled Receptors ...

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Optical Imaging von Neuronen im Crab stomatogastrischen Ganglion mit spannungsabhängigen Farbstoffen

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences. For instance, addiction to nicotine via tobacco smoking is a leading cause of premature death worldwide (World Health Organization) and is likely caused by an alteration of ion channel distribution in the brain1. Chronic nicotine exposure in both rodents and humans results in increased numbers of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in brain tissue1-3. Similarly, alterations in the glutamatergic GluN1 or GluA1 channels have been implicated in triggering sensitization to other addictive drugs such as cocaine, amphetamines and opiates4-6.

Consequently, the ability to map and quantify distribution and expression patterns of specific ion channels is critically important to understanding the mechanisms of addiction. The study of brain region-specific effects of individual drugs was advanced by the advent of techniques such as radioactive ligands. However, the low spatial resolution of radioactive ligand binding prevents the ability to quantify ligand-gated ion channels in specific subtypes of neurons. 

Genetically encoded fluorescent reporters, such as green fluorescent protein (GFP) and its many color variants, have revolutionized the field of biology7.By genetically tagging a fluorescent reporter to an endogenous protein one can visualize proteins in vivo7-10. One advantage of fluorescently tagging proteins with a probe is the elimination of antibody use, which have issues of nonspecificity and accessibility to the target protein. We have used this strategy to fluorescently label nAChRs, which enabled the study of receptor assembly using F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) in transfected cultured cells11.More recently, we have used the knock-in approach to engineer mice with yellow fluorescent protein tagged &alpha;4 nAChR subunits (&alpha;4YFP), enabling precise quantification of the receptor ex vivo at submicrometer resolution in CNS neurons via spectral confocal microscopy12. The targeted fluorescent knock-in mutation is incorporated in the endogenous locus and under control of its native promoter, producing normal levels of expression and regulation of the receptor when compared to untagged receptors in wildtype mice. This knock-in approach can be extended to fluorescently tag other ion channels and offers a powerful approach of visualizing and quantifying receptors in the CNS.

In this paper we describe a methodology to quantify changes in nAChR expression in specific CNS neurons after exposure to chronic nicotine. Our methods include mini-osmotic pump implantation, intracardiac perfusion fixation, imaging and analysis of fluorescently tagged nicotinic receptor subunits from &alpha;4YFP knock-in mice (Fig. 1). We have optimized the fixation technique to minimize autofluorescence from fixed brain tissue.We describe in detail our imaging methodology using a spectral confocal microscope in conjunction with a linear spectral unmixing algorithm to subtract autofluoresent signal in order to accurately obtain &alpha;4YFP fluorescence signal. Finally, we show results of chronic nicotine-induced upregulation of &alpha;4YFP receptors in the medial perforant path of the hippocampus.

We have developed a novel technique of quantifying nicotinic acetylcholine receptor changes within subcellular regions of specific subtypes of CNS neurons to better understand the mechanisms of nicotine addiction by using a combination of approaches including fluorescent protein tagging of the receptor using the knock-in approach and spectral confocal imaging.

Spectral konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Nikotinrezeptoren in Knock-in Mäusen mit chronischer Gabe von Nikotin

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

Verwendung von pHluorin zur Bewertung der Dynamik von Axon-Leitrezeptoren in der Zellkultur und im Küken-Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...