Das Zählen von Zellen ist ein wichtiger Schritt in vielen auf Zellen basierenden Verfahren um die Zellzahl und die Lebendzellzahl zu bestimmen. Im Allgemeinen ist das Ziel des Zählens zu bestimmen wie viel einer Probe mit unbekannter Konzentration verdünnt werden soll. Das am häufigsten verwendete Laborgerät für das Zählen von Zellen ist die Zählkammer.
Die Zählkammer wurde ursprünglich entwickelt um Blutzellen zu zählen. In der Mitte der Zählkammer befinden sich zwei Kammern auf denen laserbeschriftete Liniennetzen aufgetragen sind.
Das Liniennetz besteht aus 9 Hauptquadranten. Die 4 Eckquadranten sind in 16 kleinere Quadranten unterteilt. Der mittige Quadrant ist in weitere 25 dieser kleineren Quadranten unterteilt, die wiederum in 16 Mikroquadranten unterteilt sind.
Am anderen Ende der Kammer ist ein Spalt, in welchen die zu zählende Probe pipettiert wird.
Auf jeweils beiden Seiten der Zählkammer befinden sich zwei Trägerstege, auf die das Quarzdeckglas gelegt wird, das normalerweise 0.1 mm über der Zählkammer liegt.
Da die Fläche von jedem großen Quadrant 1 mm2 beträgt, ist das Volumen das jeder Quadrant fasst 0.1 mm3, oder 1/10000 eines ml.
Bevor man anfängt zu zählen, sollte man sich einen Moment Zeit nehmen um Fusseln, Fingerabdrücke oder Wasserrückstände mit Ethanol und KimWipes von dem Deckglas und der Zählkammer zu entfernen.
Dann gibt man eine kleines bisschen Wasser auf die zwei äußeren Trägerstege, damit das Deckglas durch Oberflächenspannung festgehalten wird.
Nun sollte man die Zellsuspension langsam durch Pipettieren vermischen, um Zellklumpen zu zerstören. Dann benutzt man eine Mikropipette um ca. 10 l der Zellsuspension durch den Spalt in die Zählkammer zu pipettieren. Die Lösung wird durch die Kapillarkraft in den Zwischenraum gesaugt, woraufhin das ganze Liniennetz bedeckt sein sollte.
Während sich die Zellen absetzen, wählt man das richtige Objektiv aus. Dann legt man die Zählkammer auf den Objekttisch.
Nun schaut man sich die Zellen durch das Lichtmikroskop an. Wenn weniger als 5 Zellen in jedem der großen Quadranten vorhanden sind, sollte man die Probe nochmals zentrifugieren und das Pellet in einem kleineren Volumen resuspendieren. Wenn die Zellen übereinander liegen oder zu dicht beieinander sind um sie einfach voneinander zu unterscheiden, verdünnt man die Probe in einem größeren Volumen. Man sollte sicherstellen, dass man sich den Verdünnungsfaktor merkt, den man später für die Berechnung braucht.
Nun ist es Zeit die Zellen zu zählen.
Wie wir schon gesagt haben, ist auf die Zählkammer ein laserbeschriftetes Liniennetz aufgetragen. Die Linien der Quadranten machen es einfach sich beim Zählen zu orientieren. Man sollte die Größe des Quadranten nach der Zelldichte auswählen. Zum Beispiel zählt man bei kleinerer Zellzahl alle Zellen in einem der Eckquadranten. Für Proben mit mittlerer Zelldichte wählt man einen der 16 kleineren Quadranten zum Zählen aus. Bei sehr hoher Zelldichte sollte man die Zellen in einem der mittleren 25 Quadranten zählen. Unabhängig davon welchen Quadranten man aussucht und wie hoch die Zelldichte ist, sollte man mindestens 20-50 Zellen pro Quadrant zählen.
Nicht alle Zellen passen genau in den jeweiligen Quadranten. Man kann die Zellen zählen, welche die oberen und linken Abgrenzungslinien berühren und die Zellen ignorieren, welche die unteren und rechten Abgrenzungslinien berühren. Um die genaueste Zählung zu erhalten, benutzt man ein Zählgerät und bestimmt den Durchschnittswert von 4 Zählungen in gleich großen Quadranten.
Um die Zellzahl in 1 ml Volumen zu bestimmen, multipliziert man die Zellzahl mit 10000, weil, wie wir schon gesagt haben, jeder große Quadrant 1/10000 eines ml ist. Wenn man einen dieser großen Quadranten gezählt hat, multipliziert man die Zahl einfach mit 1. Wenn man einen der kleineren Eckquadranten gezählt hat, multipliziert man die Zahl mit 16. Wenn man alle Zellen einem der 25 mittleren Quadranten gezählt hat, multipliziert man die Nummer mit 25. Wenn man die Probe vor der Zählung verdünnt hat, muss man auch noch den Verdünnungsfaktor in die Berechnung einbeziehen.
Um die Zellzahl in 1ml der Probe zu bestimmen, müssen die 20 Zellen in dem mittleren Quadranten mit 104 und 25 multipliziert werden, was insgesamt 5x106 Zellen in 1ml der Probe ergibt.
Nun das wir die Gesamtzellzahl in 1 ml berechnet haben, müssen wir die Nummer noch mit dem Gesamtvolumen der Lösung multiplizieren. Wenn wir also beispielsweise 5x106 Zellen in einem ml haben, ist die Gesamtzellzahl 1x107 in 2 ml.
Um Pipettierfehlern, Verzählen oder eventueller ungleichmäßiger Verteilung von Zellen vorzubeugen, belädt man die andere Seite der Zählkammer und zählt die Probe ein zweites Mal.
Wenn man die Zellen unter dem Mikroskop zählt, kann man auch gleichzeitig die Lebendzellzahl der Probe bestimmen. Trypanblau, ein Lebendzellfarbstoff, wird dazu oft mit der Probe vor der Beladung der Zählkammer vermischt.
Lebende Zellen werden nicht eingefärbt, da diese sehr selektiv sind mit dem, was durch ihre Zellmembranen durchgeht. Eine tote Zelle hat keine intakte Zellmembran, wodurch das Trypanblau das Zytoplasma einfärbt.
Um die Lebendzellzahl zu bestimmen, verdünnt man eine Teilprobe der Zellsuspension mit Trypanblau. Danach pipettiert man die Probe wie eine normale Zellprobe auf. Unter Phasenkontrast erscheinen lebende Zellen hell und golden und sollten gezählt werden; Zellen die trüb, tot und blau sind zählt man nicht.
Man berechnet die Zellzahl wie zuvor, nur das man dieses Mal die Gesamtzellzahl mit dem Trypanblauverdünnungsfaktor multipliziert. Das heißt, wenn unsere ursprüngliche Beispielprobe zuerst in Trypanblau verdünnt worden wäre, müssten wir unsere Zellzahl mit der 1:10 Verdünnung multiplizieren, um eine Gesamtzahl von 1X108 zu erhalten.
Nach der Zählung sollte man nicht vergessen das Deckglas und die Zählkammer gründlich zu reinigen.
Nun das wir uns ausführlich mit dem Zählen beschäftigt haben, sprechen wir über Gründe weshalb man die Zellzahl in bestimmten Experimenten bestimmen muss.
Nachdem man Zellen von normalen oder experimentellen Geweben isoliert, ist es wichtig zu wissen wie viele Zellen man erhalten hat. Hier will ein Forscher wissen wie viele Splenozyten, oder Zellen der Milz, von der Milz einer Maus isoliert worden sind.
Wenn man Experimente macht um zu bestimmen wie zwei verschiedenen Zellpopulationen reagieren, ist es wichtig zu wissen wie viele Zellen man zusammen mischt, zum Beispiel in dieser Kultur von B und T Zellen.
Für bestimmte auf Zellen basierende Verfahren muss man wissen wie viele Zellen vorhanden sind. Hier wird ein ELISPOT Verfahren benutzt um zu bestimmen wie viele Zellen in einer Probe IFN sekretieren, also ein entzündungsförderndes Protein welches bei einer Infektion mit humanen Papillomviren sekretiert wird.
Wenn man ein Experiment macht bei dem RNA von Zellen extrahiert wird, ist es wichtig zu wissen wie viele Zellen man hat, um eine ausreichende Menge an mRNA in dem Experiment zu erhalten.
Die Zählkammer ist ein relativ billiges und relativ leicht zu benutzendes Instrument für die Zellzählung. Es kann allerdings lange dauern und man kann Fehler machen.
Der Scepter automatische Zellzähler im Pipettenformat ist, wie der Name schon sagt, ein Zählgerät das eine höhere Zählgenauigkeit als die Zählkammer ermöglicht, und das sowohl die Größe als auch das Volumen von Zellen in einer Probe bestimmen kann.
Der TC10 automatische Zellzähler kann sowohl die Zellzahl, als auch die Lebendzellzahl bestimmen, und errechnet automatisch die Zellzahl in der Probe. Außerdem kann man die Zellen auf einem Bildschirm anzuschauen.
Das war die Einführung in die Zellzählung von JoVE. In diesem Video haben wir wiederholt was eine Zählkammer ist, wie man Zellen zählt und wie man die Lebendzellzahl bestimmt. Außerdem haben wir verschiedene Gründe erläutert wieso man Zellen zählen muss. Danke für eure Aufmerksamkeit und denkt daran nicht die blauen Zellen zu zählen!
