Unterstützte teilweise durch R01NS064593 und R21ES016636 (KV). Mikroskopie wurde an der VCU durchgeführt - Department für Neurobiologie und Anatomie Microscopy Facility, unterstützt, zum Teil mit Mitteln aus NIH-NINDS zentralen Kern Gewährung 5P30NS047463. Das Spinning Disc konfokalen Mikroskop wurde mit einem NIH-NCRR award (1S10RR027957) erworben.

A. Cell Preparation <ol><li> Normale menschliche Fibroblasten (GM02270) wurden aus Coriell Zelle Repository, Camden, New Jersey, erhalten und verewigte mit hTERT 6. Die Zellen wurden gezüchtet und in CellStar expandiert 6-cm-Schalen in Medien (4 ml) bestehend aus MEM mit 20% fötalem Rinderserum (GIBCO), non-essential/essential Aminosäuren, Vitamine, Natriumpyruvat, und Penicillin / Streptomycin (HyClone ergänzt ). </li><li> Menschliche embryonale Nieren-293 (HEK293) Zellen wurden von American Type Culture Collection erhalten und gezüchtet und in CellStar 6-cm-Schalen erweitert. Die Zellen wurden in Medien (4 ml) bestehend aus DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, nicht-essentielle Aminosäuren, L-Glutamin und Penicillin / Streptomycin gehalten. </li><li> 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Addgene Plasmid 19.836) und H2B-GFP (PCLNR-H2BG; Addgene Plasmid 17.735) Fusionsgen Konstrukte auch exprimieren Puromycin oder G418-Resistenz-Gene wurden jeweils transduziert (fibroblaM.) oder transfizierten (HEK293) mit SuperFect (Qiagene) in Zellen und gepflegt unter Drogen Auswahl. Wartung der Fluoreszenz wurde periodisch überprüft. </li><li> 24-48 Std. vor Bildaufnahme, wurden Zellen in eine Einzelzell-Suspension trypsiniert und ausgesät in einer niedrigen Dichte auf 3,5-cm FluroDish Glasbodenplatten. </li></ol> B. Mikroskop Setup und Image Acquisition Dieses Protokoll wurde entwickelt, mit dem Zeiss Cell Observer SD Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop mit einem AxioObserver Z1 Stand, ein Dual-Channel-Yokagawa CSU-X1A 5000 Spinning-Disk-Einheit, 2 Photometrics QuantEM 512SC emCCD Kameras, ein HXP 120C Faser-basierten Illuminator, 4 ausgestattet Laser (a Lasos 100mW mehrzeiligen Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm Diode, 40 mW 561 nm Diode und 30 mW 635 nm Diode), AOTF ein Pecon XL multiS1 Stufe Inkubationssystem, Zeiss Inkubation Module (O 2-Modul S, CO 2-Modul S, TempModul S, Heating Unit XL S) und einer Vor mozed XY Bühne mit einer NanoScanZ Piezo Z-Einsatz. Um sphärische Aberrationen zu minimieren, während Bildgebung lebende Zellen in einem wässrigen Medium, einem C-Apochromat 63x/1.20 Wasser / Corr Objektivlinse und Zeiss Immersol W Immersionsflüssigkeit (mit einem Brechungsindex n = 1,334) gelagert wurden verwendet. Für 2-Kanal konfokale Abbildung, eine RQFT 405/488/568/647 dichroitischen Spiegel und BP525/50 (grün) und BP629/62 (rot) Emissionsfilter wurden verwendet. Die System-Software verwendet wurde, war Zeiss Axiovision (Version 4.8.2.0) mit AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Physiologie, MosaiX, Mark &amp; ​​Find, Dual-Kamera, Inside 4D, Autofokus und 3-D Dekonvolution Module. <ol><li> Sicherzustellen, dass CO 2-Gas mit dem CO 2-Modul der Inkubation System läuft. Wenn das Mikroskop durch einen Anti-Vibrations Lufttisch unterstützt wird, auf der Luftzufuhr (oder N 2-Gas) für das Lufttisch einzuschalten. </li><li> Schalten Sie die Stromversorgung für das Stativ, Spinning-Disk-Einheit, Kameras, Inkubation Module, HXP Illuminator, motorisierten Bühne, ArgonLaser und Computer. </li><li> Nach 1 min Aufheizzeit, drehen Sie den Zündschlüssel für den Argon-Laser auf &quot;On&quot;. </li><li> Auf dem Zeiss Laser Bedienfeld auf den Schalter für die Laser-Linien genutzt werden kann. </li><li> Schalten Sie den Schalter für die Lasos Argon-Laser-Controller von &quot;Standby&quot; auf &quot;Laser run&quot; und stellen Sie die Licht-Controller auf das optimale Niveau (dh knapp unterhalb der Stelle, wo die grüne Anzeige leuchtet rot). </li><li> Starten Sie die Software AxioVision. Hinweis: die Benutzeroberfläche für AxioVision kann mit Fenstern und Pull-Down-Menüs, die spezifisch für die jeweilige Mikroskop und Komponenten, die es steuert sich den Kundenwünschen angepasst werden. Als solche hat jedes System eine potenziell einzigartige Schnittstelle. Daher sind allgemeine Anweisungen für die Software-Manipulation in den nachfolgenden Schritten vorgesehen, anstatt Richtungen für spezifische Software-Fenster, Tabs und / oder Pull-down-Menüs. </li><li> Ungefähr 1 Stunde vor der Bildgebung in der Software, Finden die Bedienelemente für den Inkubator undEinschalten der Heizung für die obere Kammer und der Tischplatte. Stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Schalten Sie den CO 2-Steuerung und den Pegel bei 5%. </li><li> Wählen der Objektivlinse zum Abbilden. In dieser Studie wurde ein 63x/1.20 NA C-Apochromat Wasser / Corr Objektivs verwendet. Hinweis: Für dieses Objektiv, ein Immersionsmedium mit einem ähnlichen Brechungsindex Wasser (Zeiss Immersol W Immersionsflüssigkeit) benötigt. </li><li> Wenn mehrere getrennte Positionen über einen langen Zeitraum hinweg abgetastet werden, sicher sein, um eine ausreichende Menge an Immersionsmedium anwenden, um sicherzustellen, dass sie von einer Position zu einer anderen durchgeführt wird. </li><li> Setzen Sie die Schüssel auf der Bühne und bringen das Objektiv bis in Kontakt mit dem Boden. </li><li> Verwenden Sie entweder das Mikroskop Kontrollen oder die Software, leiten das emittierte Licht zu den Okularen und wählen Sie die entsprechende Weitfeld Filter für das Fluoreszenz-Signal von Interesse (für diese Studie, &quot;Red&quot;-Filter für 53BP1 und einem &quot;GFP&quot;-Filter gesetzt für H2B gesetzt ). &lt;/ Li&gt; <li> Blick durch die Augenlinsen, das Bild scharf, und suchen Sie einen geeigneten Bereich der Zellen. </li><li> Verwenden Sie entweder die Software oder das Mikroskop Kontrollen richten das emittierte Licht von der Okulare in den Hafen mit dem konfokalen Spinning Disc Einheit. </li><li> In der Software auf den entsprechenden Laser (für diese Studie, die 561 nm Laser für 53BP1 und der 488 nm-Linie des Argon-Laser für H2B) drehen. </li><li> Für jeden Kanal, um die Intensität des Lasers durch Einstellen der akustooptische abstimmbare Filter (AOTF)-Steuerung auf einen geeigneten Pegel. </li><li> Wählen Sie den entsprechenden dichroitischen Spiegel (RQFT 405/488/568/647) und Emissionsfilter (BP 629/62 für 53BP1 und BP 525/50 für die H2B). Öffnen Sie den Rollladen in die sich drehende Scheibe Einheit. </li><li> Wählen Sie die &quot;Live&quot;-Fenster, um das aktuelle Sichtfeld angezeigt. </li><li> In der Software, öffnen Sie die &quot;Kamera&quot;-Steuerung, wählen Sie die Kamera verwendet werden (wenn ein Dual-Kamera-System) und die Belichtung der Zeit auf etwa 100 ms. Passen Sie die% und EM zu gewinnen, wie ang. Essary Hinweis: Die 53BP1-mCherry Konstrukt erscheint etwas dunkler. Wir fanden es hilfreich, die EM gewinnen zu erhöhen. </li><li> In der Software, öffnen Sie die Steuerung für die konfokale Spinning Disc-Einheit und stellen Sie den drehenden Scheibe Geschwindigkeit durch Eingabe der Kamera-Belichtungszeit, die auf ein geeignetes Bild (zB ~ 100 ms) zu erfassen war. Klicken Sie auf &quot;Set&quot; in der Änderung zu sperren. </li><li> Öffnen Sie &quot;multi-dimensionale Erfassung&quot;. Wählen Sie den Kanal Registerkarte und laden / Auswahl geeigneter Kanäle. Für diese Studie verwenden wir Kanäle für dsRed (561 nm Laser-Anregung und BP 629/62 Filter für Emission) und GFP (488 nm Laserlinie für die Anregung und BP525/50 Filter für Emission) definiert. </li><li> Um Bildregistrierung zu gewährleisten, wurde eine gemeinsame dichroitischen Spiegel (RQFT 405/488/568/647) für beide Kanäle verwendet. Stellen Sie die Software auf &quot;Autofokus&quot;. Hinweis: Gehen Sie zu Extras → Einstellungen Editor, um die MDA-Einstellungen anpassen. Stellen Sie sicher, dass eine angemessene Laserleistung eingestellt wird (&quot;Adequate Laserleistung&quot; bezieht sich auf eine Einstellung, die es Ihnen ermöglichtdie entsprechende Fluorophor erregt bei gleichzeitiger Minimierung Fotobleichen). </li><li> Im MDA-Fenster, wählen Sie die z-Stapel Registerkarte. Wählen Sie &quot;Z-Stapel an der aktuellen Fokus Position&quot;. Stellen Sie den Bereich für ~ 10 um Z-Stapel und wählen Sie &quot;optimal&quot; für die Anzahl der Schritte zur Nyquist bis Z. Hinweis zu gewährleisten: Die genaue Größe des z-Stack wird von der Höhe Ihrer Zellen ab. Entsprechend anpassen. </li><li> 23. Klicken Sie auf &quot;Start&quot; und analysieren die resultierende z-Stapel-Aufnahme zu gewährleisten, die Einstellungen entsprechend für das, was Sie untersuchen (z. B. in dieser Studie war es wichtig, zur Abbildung des gesamten Kern). </li><li> Wählen Sie die &quot;T&quot; (Zeit)-Registerkarte. Für unser Experiment mit Camptothecin, setzen wir das Intervall zwischen Bildgebung Zeitpunkten bis 5 min und die gesamte Dauer der Sitzung für 1 h bei einer Kontrolle (unbehandelte Zellen) Video. Hinweis: zu minimieren Fotobleichen der Zellen, das Experiment sollten so konfiguriert sein, dass der AOTF Zuschnitte den Laser zwischen Bildgebung Zeitpunkten. </li><li> Foder Multi-Punkt-Darstellung von mehreren Zellen in der Schale, im MDA-Fenster, wählen Sie die Registerkarte Position. Stellen Sie sicher, &quot;Apply&quot;-Einstellung vor / nach dem Zeitpunkt &quot;pro Position&quot; aktiviert ist. Wählen Sie &quot;Mark_Find&quot;. Mit der &quot;Live&quot;-Ansicht, bewegen Sie den Teller um und wählen Sie die entsprechenden Sichtfelder. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Start&quot; in der multi-dimensionalen-Akquisition Menü, um das Experiment zu beginnen und aufzuzeichnen eine Steuerung Video (von unbehandelten Zellen). </li><li> Nach der Kontrolle Video, fügt die entsprechende Behandlung (in diesem Fall 10 uM Camptothecin). Wir nahmen die experimentelle (drug-behandelten Zellen) Video bei 5-10 min Intervalle für 2-4 Std. Hinweis: Eine wichtige Frage zu prüfen, ist die Geschwindigkeit, mit der ein bestimmter Effekt tritt nach der Behandlung. Wie im Video zu sehen, beginnen 53BP1 Herde von ~ 5 min nach Zugabe von CPT. Obwohl ein relativ einfacher Vorgang, indem Arzneimittels für die Spiegel manuell und wieder Kalibrierung des Mikroskops braucht Zeit. Dabei müssen diese angegeben werden bei der Gestaltung Experimente. </li><li> Für die Überwachung mitosis setzen wir den Abstand zu 7,5 min und aufgezeichnet für 4-5 h (die spezifischen Einstellungen hängen von der verwendeten Zelllinie und der Länge seiner Zellzyklus). Anpassungen müssen vorgenommen werden, um Fotobleichen bei längeren Aufnahmen zu verhindern. </li></ol> C. Bildverarbeitung und-analyse Dieses Protokoll wurde entwickelt, mit Volocity Software (PerkinElmer). Die Software verwendet werden, um diese Daten (AxioVision) erwerben hat auch die Fähigkeit, Bilder zu verarbeiten und zu analysieren. Benutzer werden aufgefordert, die Software zur Verfügung, um sie zu nutzen, und wenden Sie sich entsprechende Literatur im Hinblick auf ihre Anwendung. <ol><li> Öffnen Volocity Software. Erstellen und benennen Sie eine neue Bibliothek, und importieren Sie Ihre Video-Dateien. </li><li> Zum Öffnen der Dateien haben wir in der Regel finden es sehr hilfreich, um die &quot;Extended Focus&quot;-Einstellung verwenden. Dies überlagert die Z-Stapel Scheiben und, für dieses Protokoll, ermöglicht es uns, 53BP1 Foci in verschiedenen Bereichen des Kerns zu visualisieren. </li><li> Passen Sie Videos wie nötig. Volocity wird mit einer Reihe von Tools, um die Qualität der aufgenommenen Bilder zu verbessern ausgestattet. Durch die Sicherstellung der Einstellungen am Mikroskop angemessen waren, kann viel Zeit bei der Bearbeitung später gespeichert werden. Oft ist es hilfreich, Ihre Bilder deconvolve, und passen Sie die Helligkeit / Kontrast. Ihre spezifische Bearbeitung Bedürfnisse werden auf der Grundlage des Experiments variieren. </li><li> Fügen Sie einen relativen Zeitstempel und Maßstab. </li><li> Um Zellen in 3-D zu sehen, die &quot;3-D Deckkraft&quot; Einstellung. Dies erlaubt eine Drehung der 3-D gerendert Zellen im Raum, wodurch mehrere Perspektiven von Strukturen von Interesse in den Zellen. Hinweis: Es ist hilfreich, um Zellen in unterschiedlichen Ebenen visualisieren zu bestimmen, wo Strukturen von Interesse anzeigen. Zum Beispiel wird in dem &quot;Extended Focus&quot;-Einstellung ist es schwierig zu erkennen, dass die 53BP1 bedeutet in der Tat von der DNA dissoziiert während der Mitose. Dies ist jedoch ohne weiteres ersichtlich in 3-D. </li><li> Filme und Standbilder können in einer Vielzahl von Dateitypen auf Benutzer Präferenz exportiert werden. </l<html> i&gt; </ol> D. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für 53BP1 Foci-Bildung in Abhängigkeit von CPT wird in Abbildung 1 gezeigt. Cells CPT Form Brennpunkte innerhalb von 5-10 min ausgesetzt, und pflegen diese Schwerpunkte während der gesamten Dauer der Aufnahme. Wie in 2, 53BP1 dissoziiert von Chromatin zu Beginn der Mitose gezeigt, Bilden einer dünnen Dunst um den kondensierenden Chromosomen. Als Telophase auftritt und Mitose zu einem Ende kommt, 53BP1 wieder Aggregate in verschiedene Schwerpunkte. Während die HEK293-Zellen wurden nicht CPT ausgesetzt, sie dennoch gebildet reichlich, spontane 53BP1 Reparatur Brennpunkte durch endogene DNA-Schäden erzeugt. Diese Beobachtung erlaubt uns zu dem Schluss, dass 53BP1 nicht bilden Schwerpunkte in der frühen Mitose, im Einklang mit einem früheren Bericht zeigt einen ähnlichen Effekt nach der Exposition von Zellen gegenüber ionisierender Strahlung und radiomimetische Drogen 5. Abbildung 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Camptothecin (10 uM) und bewirkt DSBs 53BP1 Foci-Bildung in Fibroblasten Rad innerhalb von 30 min der Zugabe des Arzneimittels an das Medium. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Abbildung 2. 53BP1 nicht bilden Schwerpunkte während der Mitose bis telophase/G1 in HEK293 Zellen.

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Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. 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G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Aufrechterhaltung der genomischen Integrität ist entscheidend für das Überleben der Zelle. Die Nichtbeachtung der Genom führt zu vorzeitigem Altern, Karzinogenese oder Tod 8 erhalten. Es gibt intensive Interesse an anspruchsvollen, wie die DDR-Funktionen, die sich aus ihrer Bedeutung sowohl Grundlagen-und klinischen Forschung. Viele Techniken wurden im Laufe der Jahre entwickelt, um bei der Untersuchung, wie Zellen erkennen und zu reparieren DNA-Schädigung zu unterstützen. Traditionelle Methoden wie Immunzytochemie und Western Blot wurden Säulen des Feldes, obwohl die jüngsten Fortschritte in der Technologie erlaubt haben immer raffinierteren Methoden zu entwickeln. Live Cell Imaging, wie in diesem Protokoll aufgeführt, ermöglicht es uns, Merkmale der DDR durch traditionelle Techniken übersehen zu studieren. Von zentraler Bedeutung für die Verwendung von lebenden Zellen ist die Schaffung von fluoreszenzmarkierten Proteinen. Hier beschreiben wir die Verwendung einer mCherry-markierten Proteins in dem DDR beteiligten 53BP1 sowie einem Histon H2B-GFP-Fusion Produkt. Fluoreszenzmarkierte Proteine ​​sind ausführlich in Molekular-und Zellbiologie verwendet, jedoch sind sie nicht ohne ihre Grenzen. Anbringen einer neuen Struktur an ein körpereigenes Protein schafft die offensichtliche Gefahr der Veränderung natürliche Funktion. Darüber hinaus können bestimmte Konstrukte und wird auf verschiedenen Ebenen in verschiedenen Zelllinien exprimiert werden, unter verschiedenen Bedingungen. Wir haben divergierenden Ebenen der Fluoreszenzintensität in allen der gentechnisch veränderten Zellen in dieser Studie verwendet beobachtet. Die 53BP1 konstruieren in diesem Protokoll verwendet fehlen die meisten funktionellen Domänen, jedoch behält er die Fähigkeit, auf Seiten von DNA-Schäden, die scheint nicht zu beeinträchtigen Zelle 2 zu binden. Zusätzlich ist es wichtig, das Verfahren zum Gentransport zu betrachten. In diesem Protokoll haben wir zwei Methoden: lentivirale Transduktion und stabile Transfektion. Unsere Lentivirus-infizierten Zellen werden stabil transduzierten mit dem fluoreszierenden Konstrukt;daher werden sie auch weiterhin diese Proteine ​​unbestimmte Zeit auszudrücken. Jedoch ist dieses Verfahren etwas aufwendig und im Vergleich zur Transfektion diktiert wird, durch die Art der Zellen ausgerichtet ist; einige Zellen nicht zugänglich sind, um eine effiziente Transfektion. Auf der anderen Seite sind in der Lage, Lentiviren meisten Zellen, einschließlich der menschlichen Kraft. Die Ermittler sind aufgefordert, die Vor-und Nachteile jeder Methode wiegen, wenn es um ihre eigenen Experimente kommt. Als mögliche Mittel zur Umgehung der Probleme, die mit fluoreszenzmarkierten Proteinen wurden die Verwendung von zellpermeablen fluoreszenzmarkierten Sonden kurzem für Live Zellexperimenten 10 berichtet. Allerdings hat diese Technik noch nicht voll entwickelt werden. Ein wesentlicher Vorteil des Live Cell Imaging ist die Fähigkeit, die räumlich-zeitliche Beziehungen der DDR und der DSB-Reparatur zu studieren. Tatsächlich waren Dimitrova et al. (2008) in der Lage, fluoreszenzmarkierten lebenden Zellen zu beobachten und zeigen RomanBildung über 53BP1 Bindung an Telomeren und wie es wirkt Chromatin Dynamik. Diese Analyse wäre deutlich schwieriger, aber nicht unmöglich, mit anderen Methoden. Mit der Fähigkeit, die DDR in Raum und Zeit zu überwachen ermöglicht es uns, Funktionen und Beziehungen, die wir sonst übersehen könnte erkennen. Zusammenfassend mit Live Cell Imaging ermöglicht es Forschern, um die Kinetik der DSB Bildung und Auflösung in Echtzeit zu überwachen und ermöglicht die quantitative Analyse bei einer einzelnen Zelle. Zusätzlich zu der Technik, die in dieser Studie verwendet, können andere Anwendungen von lebenden Zellen verwendet werden, wie FRAP FRET und 3 sein. Die Technologie des Beobachtens Zellen in Echtzeit weiter verbessert werden und verwendet, um eine Vielzahl von zellulären Prozessen studieren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Produkt </td><td> Firma </td></tr><tr><td> CellStar Kulturschalen </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish Glasboden Gerichten </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td></tr><tr><td> MEM-Medien </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Aminosäuren </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitamine </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Natriumpyruvat </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Plasmid 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> PCLNR-H2BG; Plasmid 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss Cell Observer SD Imaging Systems </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (Release 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Oil </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity Software (Version 6,0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Doppelstrangbrüche (DSB) sind die meisten schädlichen DNA-Läsionen eine Zelle begegnen kann. Wenn links unrepariert, um DSBs Hafen ein großes Potenzial zu generieren Mutationen und chromosomalen Aberrationen 1. Um dieses Trauma Katalysieren genomische Instabilität zu verhindern, ist es von entscheidender Bedeutung, damit Zellen DSBs detektieren, die DNA-Schäden Reaktion (DDR) zu aktivieren, und die Reparatur der DNA. Wenn angeregt, arbeitet der DDR zur genomischen Integrität durch das Auslösen des Zellzyklus zu ermöglichen für die Reparatur stattfinden oder zwingen die Zelle zur Apoptose bewahren. Die vorherrschenden Mechanismen der DSB-Reparatur entstehen durch homologe end-joining (NHEJ) und homologe Rekombination Reparatur (HRR) (bewertet in 2). Es gibt viele Proteine, deren Tätigkeiten müssen genau orchestriert werden für die DDR, um richtig funktionieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren für 2 - und 3-dimensionale (D) Visualisierung von einem dieser Proteine, 53BP1. Das p53-bindendes Protein 1 (53BP1) lokalisiert BereichenDSBs durch Bindung an modifizierten Histonen 3,4 bilden Schwerpunkte innerhalb von 5-15 Minuten 5. Die Histon-Modifikationen und Rekrutierung von 53BP1 und andere DDR Proteine ​​DSB Seiten werden geglaubt, um die strukturelle Neuordnung der Chromatin um Bereiche des Schadens erleichtern und dazu beitragen, DNA-Reparatur 6. Über die direkte Beteiligung der Reparatur wurden zusätzliche Rollen für 53BP1 worden in der DDR beschrieben, wie die Regulierung eines Intra-S Kontrollpunkt, einen G2 / M Kontrollpunkt, und Aktivieren stromabwärts DDR Proteine ​​7-9. Vor kurzem wurde entdeckt, dass 53BP1 bildet keine Foci in Reaktion auf DNA-Schäden während der Mitose induziert, anstatt abzuwarten, bevor Zellen G1 Lokalisierung zu der Nähe DSBs 6 einzugeben. DDR Proteine ​​wie 53BP1 haben sich mit mitotischen Strukturen (wie Kinetochoren) während der Progression durch Mitose 10 zuzuordnen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von 2 - und 3-D Live Cell Imaging zu visualisierendie Bildung von 53BP1 Foci in Reaktion auf das DNA-schädigende Mittel Camptothecin (CPT) sowie das Verhalten 53BP1 während der Mitose. Camptothecin ist ein Topoisomerase-I-Inhibitor, der in erster Linie verursacht DSBs während der DNA-Replikation. Um dies zu erreichen, haben wir eine bisher beschriebenen 53BP1-mCherry fluoreszierende Fusionsprotein zu konstruieren, bestehend aus einem 53BP1 Proteindomäne können DSBs 11 binden. Darüber hinaus haben wir ein Histon H2B-GFP fluoreszierende Fusionsprotein zu konstruieren können Chromatin Dynamik während des Zellzyklus, insbesondere aber zu überwachen während der Mitose 12. Live Cell Imaging in mehreren Dimensionen ist ein hervorragendes Werkzeug, um unser Verständnis der Funktion der DDR Proteine ​​in eukaryotischen Zellen zu vertiefen.

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung eines DNA Doppelstrangbruch Signalprotein als Reaktion auf DNA-Schäden sowie seine Lokalisierung während der Mitose aktiviert.

Zwei-und dreidimensionale Live Cell Imaging der DNA-Reparatur-Proteine

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Aufrufe.  Virginia Commonwealth University. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung eines DNA Doppelstrangbruch Signalprotein als Reaktion auf DNA-Schäden sowie seine Lokalisierung während der Mitose aktiviert.

Serie: Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabrication der Chip-Größe Gerüste für die dreidimensionale Kultivierung der Zellen

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Forschung

Biologie

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET-Imaging im dreidimensionalen Hydrogelen

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Single-Cell Resolution Dreidimensionale Bildgebung intakter Organoide

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...