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Ein. Vorbereitung des ECM Coated Kulturschalen oder Deckgläser <ol><li> Bereiten ECM Stammlösung durch Auflösen ECM Substrat in PBS (Dulbecco Saline, Invitrogen, # 14040-133 Phosphate-Buffered). Filter mit einem 0,2 mm Spritzenfilter (VWR, # 28145-495) und frieren in Aliquots bei -80 ° C. </li><li> Verdünnen ECM Stammlösung in PBS auf die gewünschte Konzentration. Für MaxGel, in DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium, Invitrogen, # 11.995-065) verdünnen. </li><li> Wenn Immunfluoreszenz durchgeführt werden, sterilisieren 12 mm runde Deckgläschen (VWR, # 89015-724) durch Eintauchen in Ethanol und an der Luft trocknen. Dies sollte in der sterilen laminaren Haube erfolgen. Wenn Immunfluoreszenz nicht durchgeführt werden skip to 1,5 fort. </li><li> Ort sterilisiert Deckgläsern in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen (Corning, # 3526). </li><li> 0,5 ml des verdünnten Substratlösung zu jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 Stunden. </li><li> Absaugen der ECM-Lösung und waschen three-mal in PBS. </li><li> Absaugen PBS und sofort verwenden oder eingewickelt in Parafilm und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen. </li></ol> 2. Vorbereitung der Dissection Werkzeuge Sylgard Platten mit zusätzlichen Aktivkohle pro dem Protokoll des Herstellers vorbereitet. Die widerstandsfähige schwarzem Hintergrund dieser Platten bietet Unterstützung für Pinning sich der Embryo und die Farbe besticht durch guten Kontrast, die Visualisierung des transluzenten Embryos ermöglicht. <ol><li> Um Platten herzustellen wiegen direkt in eine Tri-gießen Becherglas auf einer Waage 150 g Teil A 15 g flüssigen Teil B und 1 g Holzkohle Pulver (World Precision Instruments, # SYLG184). Mischen Sie mit einem Holz popsicle-Stick oder Zungenspatel. Pour in Glas oder Kunststoff 100 cm Gerichten. Verwenden Sie einen kleinen Butanbrenner etwa 10 bis 12 Zentimeter über dem Geschirr zu verbrennen keine Blasen statt. Ort Deckel auf Teller und lassen Sie sich für mindestens 24 Stunden zu setzen. </li><li> Um Sektionsinstrumenten Einsatz einer Minutien pin vorzubereiten (0,1 mm Durchmer) in einem Stifthalter (Fine Wissenschaftliche Werkzeuge, # und # 26.002-10 26.018-17 jeweils) alternativ 26 Gauge Nadeln (BD, # 309.597) abgekröpften mit Hilfe von Zangen können als Sezieren Instrumente verwendet werden. Geschärften Studenten Dumont Nr. 5 Pinzetten (Fine Science Tools, # 91150-20) mit einem Schleifstein (Fine Scientific Tools, # 29008-22). </li><li> Sterilisieren alle Sektionsinstrumenten mit 70% Ethanol vor dem Gebrauch. </li></ol> 3. Sammlung von Embryos <ol><li> Euthanize die zeitgesteuerte schwangere Maus auf 8,5 Tage post coitum nach Tiernutzung Ausschuss Vorschriften und entfernen Gebärmutter. </li><li> Ort Uterus in einer Kunststoff-Petrischale mit sterilem PBS. </li><li> Waschen Gebärmutter einmal mit sterilem PBS. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop vorsichtig Embryo aus Deciduas mit einer Pinzette. </li><li> Entfernen extraembryonalen Membranen und speichern zur Genotypisierung, wenn nötig. </li><li> Embryo durch Zählen Somiten. Die idealen Stufen zu machen Explantate auf zellulärer beh analysierenAvior während der neuronalen fache Erhöhung würde zwischen den 6 und 10 Somiten Stadien, wenn die Neuralfalten fangen gerade erst an zu erheben und vor dem großen Morphogenese des kranialen Mesenchym erfolgt sein. </li><li> Waschen Embryo in PBS. Platz in einem schwarzen Sylgard Platte mit DMEM, die keine Phenolrot (Invitrogen, # 21063-029) enthält. Entfernen Sie die extraembryonalen Membranen und speichern zur Genotypisierung, wenn nötig. </li></ol> 4. Herstellung Explantate <ol><li> Refokussieren des Mikroskops mit der höchstmöglichen Vergrößerung über den Kopfbereich des Embryos. </li><li> Schneiden Sie mit einem Dissektion Nadel in jeder Hand. Verwenden Sie eine Nadel, um das Gewebe an Ort und Stelle und die anderen halten, um Schnitte zu machen. </li><li> Schneiden Sie den Kopf des Embryos ventral der Rhombomere. </li><li> Schneiden Sie entlang der Mittellinie, um den Kopf in zwei gleiche Hälften halbieren. </li><li> Cut um den äußeren Rand des Kopfes und Mittellinie. Diese Kürzungen werden die premigratory Kamm und Oberfläche Ektoderm am äußeren Rand zu entfernen undDie Prächordalplatte an der Mittellinie. Die restlichen Gewebe wird das Explantat und wird die Migration kranialen Neuralleiste, paraxialen Mesoderm und Oberfläche Ektoderm enthalten. </li><li> Da das Gewebe geschnitten wird, entfernen Sie seziert Schutt aus der Schale mit einer sterilen Pasteurpipette. Dies verhindert Verwechselns des Explantats mit dem seziert Schutt. </li><li> Vorsichtig waschen das Explantat durch Pipettieren nach oben und unten mit einem 20 ul Pipettenspitze und Pipetman. Dadurch werden lose anhaftenden Zellen und verhindern gezackten Kanten an den Explantaten. </li><li> Sorgfältig abholen jedes Explantat in etwa 10 ul der Flüssigkeit mit einem 20 ul Pipettenspitze und Pipetman und Platz in der Mitte des beschichteten Kultur gut. </li><li> Fügen Sie 20 ul Kulturmedium mit 15% FBS ergänzt das Explantat decken. </li><li> Die Platte in einer befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (5% CO 2, 37 ° C) für 1-2 h, damit das Explantat in dem Boden der Schale zu befestigen. Kommen periodisch sicherzustellen, dass das Explantat nicht austrocknetout. </li><li> Wenn das Explantat angehängt wurde, sorgfältig zu jeder Vertiefung 250 ul DMEM mit 10% FBS ergänzt, die auf 37 ° C im Wasserbad erwärmt wurde hinzuzufügen. Sobald Explantate angeschlossen haben sie sich nicht bewegen, wenn die Platte wird sanft unter dem Mikroskop erschüttert. </li><li> Zurück Gericht zu Gewebekultur-Inkubator. </li><li> Nach 24 Stunden werden die Explantate fest angebracht werden und die Zellen beginnen zu emigrieren. Zu diesem Zeitpunkt pharmakologische Mittel können zu den Medien zugegeben werden. </li><li> 48 Stunden nach dem Ausstreichen, werden Zellen aus den Explantaten gewandert sind. Der Abstand migriert werden können visualisiert werden und abgebildet. Wir in der Regel an die Kultur an dieser Stelle seit Explantate auf Anzeichen einer geringeren Rentabilität mit längeren Inkubationen zeigen beginnen. Ein Vitalfarbstoff wie Acridinorange oder Trypanblau kann auch zur Lebensfähigkeit des Explantats zu überprüfen. </li><li> An dieser Stelle erworbenen Bilder können, um den Abstand und die Anzahl der Zellen, die aus dem Explantat migrieren dokumentieren. Alternativ wurden, wenn Explantate auf Deckgläsern ausplattiert,sie festlegbar und immunhistochemischen Analysen durchgeführt, um Proteine ​​von Interesse zu visualisieren. </li></ol> Kritischen Schritte in dem Protokoll <ol><li> Geschnitten Explantaten von ungefähr der gleichen Größe. </li><li> Löschen Sie alle Dissektion Schutt vor der Zerlegung Platte wie Sie sezieren zu verwirrenden Schmutz mit dem gewünschten explantierten Gewebe zu vermeiden sind. </li><li> Wenn plating Explantate in Brunnen oder auf Deckgläsern sicher sein, Tröpfchengröße von Medien mit Explantat Platz in der Mitte der gut. </li><li> Lassen Explantation genügend Zeit, um vor Überschwemmungen die gut mit den Medien zu befestigen. </li><li> Behandlungsbedingungen sollten standardisiert werden für jeden Test Substrat und pharmakologische Mittel verwendet. </li><li> Zwei Explantate können von jedem Embryo gemacht werden (eine aus der linken und eine von rechts der Neuralrohr). </li><li> Wenn die Ermittlung der Migration von Zellen aus mutante Mauslinien unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, legte eine Mutante Explantat in der Kontrollgruppe und der andere in der behandelten Gruppe. </li></ol> Fehlerbehebung <ol><li> Wenn Explantate zu befestigen scheitern, erhöhen die Redezeit für die Befestigung. Nach unserer Erfahrung haben etwa die Hälfte der Explantate nicht anhängen und größere Explantate effizienter zu halten. </li><li> Wenn Explantate auf die Peripherie des Bohrlochs legen sie wird schwer zu Bild. Achten Sie darauf, Explantate in der Mitte des Brunnens platzieren. </li><li> Idealerweise Explantaten wird etwa gleich groß sein. Trotzdem können Abweichungen in Explantat Größe für die Verwendung der Durchmesser der Explantate als Korrekturfaktor bei quanitating Migrationen von Zellen aus Explantaten korrigiert werden. </li><li> Wenn Kontamination sicher sein, sterile Arbeitsbedingungen benutzt werden. Alle Werkzeuge und Oberflächen sollten mit 70% Ethanol sterilisiert werden. Pipetten und Petrischalen sollten neu und steril. </li><li> Wenn Explantate immer verloren sind während der Präparation, in regelmäßigen Abständen zu entfernen Schmutz zu verhindern verlieren Explantat. </li><li> Mastering the Dissektion ist zeitaufwendig und erfordert Übung. Optimal Vergrößerung scharfe Dissektion Werkzeuge und Nadeln Hilfe. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Verfahren angewendet hier stellt eine leistungsfähige Assay, um das Verhalten von kranialen Mesenchymzellen untersuchen. Zusätzlich zu den statischen hier vorgestellten Analysen leben Imaging Experimente im Hellfeld oder in Kombination mit Expression von GFP-markierten Proteine ​​können verwendet werden, um das Verhalten der Zellen in Echtzeit prüfen, da sie migrieren aus dem Explantat werden. Für Echtzeit-Bildgebung Experimenten konnte Explantate mit DiI markiertem oder zur Migration von Neuralleiste aus der paraxialen Mesoderm, ROSA-YFP differenzieren; Mesp1-Cre oder ROSA-YFP; Wnt1-Cre oder anderen transgenen Linien verwendet werden könnten. Cranial Mesenchym-ECM-Interaktionen können ebenfalls untersucht Verwendung dieses Explantat Assay werden. Hier Platte Explantate auf verschiedene ECM Substrate, die in der kranialen Mesenchym zu zeigen, dass Zellen auf diese unterschiedlich stark migrieren und dass das ECM beeinflusst die Morphologie der Zellen sind. Weiterhin können Explantate in einer dreidimensionalen Matrix eingebettet sein, das Verhalten von Cel zugreifenls in diesem Kontext. Das Explantat Assay ist änderbare zur Analyse der Wirkung von genetischen und pharmakologischen Manipulationen am kranialen Mesenchym Verhaltensweisen intrinsische und extrinsische Cues, zu regulieren und zu modifizieren Migration zu analysieren. Zum Beispiel verwendeten wir diesen Assay in unseren Studien, um die Rolle von überschüssigem Hsp90 Sekretion in den anormalen zellulären Verhalten in Hectd1 Mutante kranialen Mesenchym 15 erkennen. In diesen Experimenten, behandelten wir Explantate mit anti-Hsp90-Antikörper, Hsp90-Protein, Geldanamycin und DMA (dimethyl amelioride), um die Sekretion von Hsp90 zu demonstrieren, dass das abnormale Verhalten Hectd1 Mutantenzellen durch überschüssige extrazelluläre Hsp90 15 ist blockieren. Ähnliche Ansätze könnten verwendet werden, um pharmakologisch sezieren zusätzliche Wege zugrunde normal oder abnormal Morphogenese des kranialen Mesenchym werden. Sobald der Test abgeschlossen ist, können Explantate und wandernden Zellen durch eine Vielzahl von Methoden analysiert werden. Beispielsweise immunhistochemischen Analysen cein Arbeitnehmer zur Lokalisierung von Proteinen entscheidend für Zellbewegungen untersuchen. Transkriptom-Analysen könnten auch eingesetzt werden, um festzustellen, wie Behandlungen Genexpression beeinflussen. Ein wesentlicher Nachteil dieser Technik ist, dass dies nicht der Fall Modells Verhaltensweisen in drei Dimensionen, wie sie in vivo auftreten würde. Modifikation des Protokolls wo Explantaten in einer dreidimensionalen Matrix (zB Matrigel) zusammen mit Expression an fluoreszierendem Protein markierte zelluläre Kompartimente eingebettet könnten verwendet notwendig, um dieses Problem anzugehen. Auch wenn diese Änderungen durchgeführt wurden, würde zu weiteren Experimenten Verhaltensweisen in dieser ex vivo-Assay mit denen in vivo gesehen korrelieren notwendig sein. Weitere Einschränkungen umfassen die große Anzahl von Embryonen erforderlich ist, um eine ausreichende Anzahl an statisch wesentliche Daten zu erzeugen erzeugen. Am wichtigsten ist, die Zerlegung relativ einfach ist, erfordert es der Praxis zu meistern.

Neuralrohrschlusses auf dem Oberkopf tritt zwischen embryonalen Tag 8,5 (E8.5) und 9,5 im Maus-Embryo. Nichtbeachtung richtig schließen das Neuralrohr in den Kopf führt Anenzephalie, eine gemeinsame strukturelle Geburtsfehler beim Menschen und ist mit dem Leben unvereinbar. Die Kräfte, die cephalica Neuralrohrschlusses fahren werden sowohl aus dem Nervengewebe selbst und der umgebenden Epidermis und Mesenchym 3 erzeugt. Insbesondere Expansion des kranialen Mesenchym wird angenommen, dass die für Elevation der kranialen Neuralfalten 1,2. Der kraniale Mesenchym ist reich an ECM Proteine ​​insbesondere glykosylierte Proteine ​​wie Heparinsulfat Proteoglykanen, Chondroitin Sulfate und Hyaluronat 4-8. Anders als in der Hühnerembryo wo Neuralleistenzellen vom dorsalen Neuralrohr auswandern nach Neuralrohrschlusses wandert die Neuralleiste im Mausembryo zugleich, dass die Neuralfalten zu r beginnenise (nach dem 5 Somiten-Stadium). Somit während Neurulation im Mausembryo wird die kraniale Mesenchym von Zellen aus der Neuralleiste und der paraxiale Mesoderm abgeleitet sind. Neuralleiste und paraxialen Mesoderm Populationen werden zu verschiedenen Zeiten in der Entwicklung induziert wird; lokalisiert in verschiedenen Stellungen im Embryo und in unterschiedliche Strukturen entwickeln 9,10. Die paraxialen Mesoderm stammt aus dem Primitivstreifens und wandert auf die vordere Region des Embryos, um die mutmaßlichen Neuralplatte zugrunde liegen. Die Neuralleiste an der Verbindungsstelle der Neuralplatte und epidermalen Ektoderm induziert wird, erfährt eine epitheliale den Übergang Mesenchym und delaminiert unmittelbar vor neuronalen fache Erhöhung in der Nagetier Embryo. Neuralleistenzellen entlang stereotypes Pfade in der subectodermal paraxialen Mesoderm der Kiemenbogen, frontonasalen und periokulare Mesenchym migrieren. Die paraxialen Mesoderm wird, einige der Knochen des Schädels Gewölbe und Muskeln des Gesichts tragen, während the Neuralleiste auch auf andere Knochen des Schädels und des Gesichts neben Hirnnerven 9-11 beitragen. Die paraxialen Mesoderm und Neuralleiste Linien kann unterschiedlich von der Mesp1-cre-und Wnt1-cre transgene Mauslinien bzw. 9 gekennzeichnet werden. Die wesentliche Rolle der Schädelbasis Mesenchym in Neuralrohrschlusses hat aus Experimenten abgeleitet worden, wo die Behandlung von Nagetier Embryonen mit ECM stören Mittel wie Hyaluronidase, Chondroitinase ABC, Heparitinase oder Diazo-Oxo-Norleucin (DON) während Neurulation beeinträchtigt Neuralrohrschlusses 7, 12-14. In diesen Versuchen zeigten histologische Analyse von statischen Abschnitten nach Neurulation zugeordnet dysmorphogeneis des kranialen Mesenchym 7,12-14. Da jedoch die teratogene Mittel hatten Zugang zu mehreren Geweben, bleibt zu bestimmen, wenn der craniale Mesenchym wirklich das Zielgewebe werden. Zur Unterstützung der Schlussfolgerung, dass dieses Gewebeist für Neurulation wesentlicher erscheint die kranialen Mesenchym abnormale auf histologische Analysen in einigen Mausmutanten mit Exenzephalie 15-17. Trotzdem in den meisten Fällen hat die Wirkung der Mutation auf die zelluläre Verhalten des kranialen Mesenchym nicht angegangen. Wir haben eine ex-vivo-Assay Explantat direkt untersuchen die Folge genetischer Mutation oder pharmakologische Manipulation auf das Verhalten der kranialen Mesenchymzellen 15 ausgearbeitet. Dieser Assay ist ähnlich dem von Tzahor et al 2003 veröffentlicht das Differenzierungspotenzial der Schädelbasis Mesenchym zugreifen, unterliegt den Rhombomere 18 außer wir haben das Explantat Dissektion modifiziert, um die Migration von mehr anterioren Populationen von kranialen Mesenchym Studie, dass die vorderen neuralen unterliegen Platte. Unsere Methode ist auch eine Änderung der Explantat Assays im Hühnerembryo durchgeführt, um das Zugverhalten der Neuralleiste mit ke zu analysiereny Unterschiede. Vorherige Vorbereitungen der Neuralleiste oder weiter hinten paraxialen Mesoderm 19,20 explantiert. Darüber hinaus während der neuronalen fache Erhöhung im Hühnerembryo hat die Neuralleiste noch nicht emigriert aus dem dorsalen Neuralrohr und damit Explantate des vorderen paraxialen Mesoderm getroffen würden nicht enthalten Neuralleistenzellen. In unserem Assay werden kranialen Mesenchym bestehend aus Explantaten paraxialen Mesoderm, Neuralleiste und Ektoderm Oberfläche hergestellt und auf einem Substrat plattiert. Experimentelle Manipulation einschließlich Isolierung von Explantaten aus genetische Mutanten Plattieren Explantate auf verschiedene ECM oder pharmakologische Behandlungen durchgeführt werden kann. Zellen aus dem Explantat, und der Abstand, die Anzahl und das Verhalten migrieren können analysiert und verglichen werden zwischen den Behandlungsgruppen. Darüber hinaus ist diese Zubereitung änderbare Analysen der zellulären Migration von Live-Imaging-Techniken. Nach der Migration Experiment kann Explantate fixiert und unterworfen werden immunhistochemische Analysen zu PelzTher erläutern die Wirkung der Behandlungen. Im Großen und Ganzen ist das Protokoll präsentiert hier eine einfache ex vivo Test, um das Verhalten der Schädelbasis Mesenchym untersuchen. Als ein repräsentatives Experiment nutzen wir dieses Assays, um die Migration von kranialen Mesenchym auf unterschiedlichen extrazellulären Substrate untersuchen.

an explant assay for assessing cellular behavior of the cranial mesenchyme

Das zentrale Nervensystem ist aus der Neuralplatte, die eine Reihe von komplexen Bewegungen morphogenetischen was zur Bildung des Neuralrohrs in einem Prozess als Neurulation bekannt erfährt abgeleitet. Während Neurulation wird Morphogenese des Mesenchym, das die Neuralplatte zugrunde vermutlich neuronalen fache Erhöhung fahren. Der kraniale Mesenchym wird der paraxialen Mesoderm und Neuralleistenzellen zusammen. Die Zellen des kranialen Mesenchym bilden eine pourous Maschenwerk von sternförmigen förmigen Zellen bestehen und Vermischung extrazellulären Matrix (ECM), die die Stränge Neuralfalten unterstützen. Während Neurulation erfährt das kraniale Mesenchym stereotypen Umlagerungen wodurch die Expansion und diese Bewegungen sind vermutlich eine Antriebskraft für neuronale zweifache Erhöhung bereitzustellen. Allerdings bleiben die Wege und zelluläre Verhaltensweisen, die kranialen Mesenchym Morphogenese fahren schlecht untersucht. Wechselwirkungen zwischen der ECM und den Zellen der kranialen Mesenchym zugrunde these Zelle Verhaltensweisen. Hier beschreiben wir ein einfaches ex vivo Explantat Assay entwickelt, um das Verhalten dieser Zellen charakterisieren. Dieser Assay ist änderbare zur pharmakologischen Manipulationen an der Signalwege beteiligt und Live-Imaging-Analysen seziert weiter zu charakterisieren das Verhalten dieser Zellen. Wir stellen eine repräsentativen Experiment demonstriert den Nutzen dieser Assay in der Charakterisierung der Eigenschaften des wandernden kranialen Mesenchym auf einer Vielzahl von ECM-Komponenten.

Das Auftreten von Zellen Migration von kranialen Mesenchym Explantaten ist in Abbildung 2 gezeigt. Wir testeten Migration auf verschiedene ECM Substrate, die in der kranialen Mesenchym während Neurulation einschließlich Fibronectin (100 mg / ml, Sigma # F1141) sind, Laminin (100 mg / ml, Sigma # L2020), MaxGel ECM (1:500 Verdünnung in DMEM , Sigma # E0282) und Hyaluronsäure (1 mg / ml, Sigma, # 53747). Cells nicht migrieren aus dem Explantat wenn kein ECM vorhanden ist (Daten nicht gezeigt) und alle getesteten Substrate unterstützt die Migration der Zellen. Sowohl die Form als auch die Größe der Zellen, die aus den Explantaten migrieren hängt von dem Substrat. Dies wird erwartet, da frühere Studien belegen, dass die mechanischen Kräfte, die durch Wechselwirkung von Zellen mit verschiedenen ECM erzeugt sowohl die wandernde Form und Eigenschaften der Zellen 21 zu beeinträchtigen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig1.jpg" fo:content-width = &quot;5.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4245/4245fig1highres.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1. Vorbereitung der Explantate. (A) Um Explantate vorzubereiten, werden E8.5 Embryonen aus Deciduas und extraembryonalen Gewebe seziert. (B) Embryo Köpfe von dem Körper zu den anterioren Rhombomere seziert. Explantate werden durch Entfernen von Gewebe aus der Mittellinie und den Außenkanten des Kopfes um die prächordalen Platte an der Mittellinie und dem premigratory Neuralleiste und Ektoderm Oberfläche an der Grenze zu entfernen, jeweils hergestellt. (C) Explantate werden durch Wegschneiden Gewebe aus den Mittellinie und äußeren Kanten des Kopfes, um das prächordalen Platte an der Mittellinie und dem premigratory Neuralleiste und Ektoderm Oberfläche an den Grenzen entfernen hergestellt. (D) Explantate werden in einem kleinen Volumen von Medien auf ECM beschichteten Schalen / Deckgläschen gelegt und dürfen vor der Zugabe von mehr Medien anzubringen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4245/4245fig2.jpg" /> Abbildung 2. Migration der kranialen Mesenchymzellen aus Explantaten auf verschiedenen Substraten ausplattiert. Explantate wurden auf Fibronectin, Laminin, MaxGel ECM oder Hyaluronsäure ausplattiert und fotografiert nach 48 h in Kultur. Größe bar = 200 mm.

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An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Der kraniale Mesenchym erfährt dramatischen morphogene Bewegungen, die wahrscheinlich stellt eine Antriebskraft für die Elevation der Neuralfalten<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Hier beschreiben wir ein einfaches<em&gt; Ex vivo</em&gt; Explantation Assay, um die zellulären Verhalten der Schädelbasis Mesenchym während Neurulation charakterisieren. Dieser Test hat zahlreiche Anwendungen, darunter gefügig zu sein pharmakologischen Manipulationen und Live-Imaging-Analysen.

Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Aufrufe.  Children's National Medical Center. Der kraniale Mesenchym erfährt dramatischen morphogene Bewegungen, die wahrscheinlich stellt eine Antriebskraft für die Elevation der Neuralfalten 1,2. Hier beschreiben wir ein einfaches Ex vivo Explantation Assay, um die zellulären Verhalten der Schädelbasis Mesenchym während Neurulation charakterisieren. Dieser Test hat zahlreiche Anwendungen, darunter gefügig zu sein pharmakologischen Manipulationen und Live-Imaging-Analysen.

Serie: An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung mit Groove Patterns für ein Studium Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

Forschung

Biologie

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical research. The hypoxic chamber offers a simple system to control oxygenation in standard culture vessels, but lacks precise temporal and spatial control over the oxygen concentration at the cell surface, preventing its application in studying a variety of physiological phenomena. Other systems have improved upon the hypoxic chamber, but require specialized knowledge and equipment for their operation, making them intimidating for the average researcher. A microfabricated insert for multiwell plates has been developed to more effectively control the temporal and spatial oxygen concentration to better model physiological phenomena found in vivo. The platform consists of a polydimethylsiloxane insert that nests into a standard multiwell plate and serves as a passive microfluidic gas network with a gas-permeable membrane aimed to modulate oxygen delivery to adherent cells. The device is simple to use and is connected to gas cylinders that provide the pressure to introduce the desired oxygen concentration into the platform. Fabrication involves a combination of standard SU-8 photolithography, replica molding, and defined PDMS spinning on a silicon wafer. The components of the device are bonded after surface treatment using a hand-held plasma system. Validation is accomplished with a planar fluorescent oxygen sensor. Equilibration time is on the order of minutes and a wide variety of oxygen profiles can be attained based on the device design, such as the cyclic profile achieved in this study, and even oxygen gradients to mimic those found in vivo. The device can be sterilized for cell culture using common methods without loss of function. The device's applicability to studying the in vitro wound healing response will be demonstrated.

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabrication and validation of an add-on platform that offers enhanced control over the spatial and temporal oxygenation in a 6-well plate. The device is adaptable to a number of culture systems and can be used to investigate the effects of oxygen on wound healing.

Herstellung und Betrieb eines Oxygen Insert für adhärente Zellkulturen

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Klonogene Test: adhärenter Zellen

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

Trennung von embryonalen Maus-Facial Ektoderm und Mesenchym

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

Live-Imaging-Assay für die Bewertung der Rollen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sphingomyelinase und in der Reparatur von Pore Toxin-bildenden Wunden

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Messung der Auswirkungen von Bakterien auf<em&gt; C. Elegans</em&gt; Verhalten Mit einem Ei Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Single Cell Durotaxis Assay for Assessing Mechanical Control of Cellular Movement and Related Signaling Events

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate underlying a cell must be manipulated. While hydrogels with graded stiffness and long-term migration assays have proven useful in durotaxis studies, immediate, acute responses to local changes in substrate tension allow focused study of individual cell movements and subcellular signaling events. To repeatably test the ability of cells to sense and respond to the underlying substrate stiffness, a modified method for application of acute gradients of increased tension to individual cells cultured on deformable hydrogels is used which allows for real time manipulation of the strength and direction of stiffness gradients imparted upon cells in question. Additionally, by fine tuning the details and parameters of the assay, such as the shape and dimensions of the micropipette or the relative position, placement, and direction of the applied gradient, the assay can be optimized for the study of any mechanically sensitive cell type and system. These parameters can be altered to reliably change the applied stimulus and expand the functionality and versatility of the assay. This method allows examination of both long term durotactic movement as well as more immediate changes in cellular signaling and morphological dynamics in response to changing stiffness.

Mechanical forces are important for controlling cell migration. This protocol demonstrates the use of elastic hydrogels that can be deformed using a glass micropipette and a micromanipulator to stimulate cells with a local stiffness gradient to elicit changes in cell structure and migration.

Einzelzelle Durotaxis Assay zur Beurteilung der mechanischen Steuerung der zellulären Bewegung und verwandter Signalereignisse

Durotaxis is the process by which cells sense and respond to gradients of tension. In order to study this process in vitro, the stiffness of the substrate ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Beurteilung der altersspezifischen phagozytischen Fähigkeit von adulten Drosophila melanogaster Hämozyten mit einem In Vivo Phagozytose-Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

Zusammenfassung

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