Die Autoren möchten sich Emilija Renke und Janet Yu für die technische Unterstützung bedanken. DCN ist durch Zuschüsse aus dem United States Department of Defense (DR080205, DM102823, OR09055 und OR090059) unterstützt. RDH wird durch einen Zuschuss aus dem Maryland Landwirtschaft Experiment Station und einer NIH Training Grant in Cell and Molecular Biology unterstützt.

Ein. Bestimmung der optimalen Heizung AGB Zuerst muss man experimentell die optimale Bebrütungstemperatur und die Zeit bis zum Erwärmungsschritt in dem Assay verwendet. Für unsere PlyC Modell, ist es wichtig zu beachten, dass E. coli mit plyCA und plyCB Gene auf getrennten Expressionsplasmiden cotransformiert ist gezeigt worden, um eine voll funktionsfähige PlyC Holoenzym 6 zu bilden. Die 96-well Mikrotiterplatte Vorbereitung sowie Zellwachstum Bedingungen und die anschließende Replica-Plating-Technik wurden von Beispielen in der Literatur 12-16 angepaßt. Eine Inkubationszeit von 30 min wird für diesen Test als Ergebnisse aus früheren thermische Inaktivierung Experimenten einen schnellen Verlust der Aktivität während der Kurzzeitinkubation in Umgebungen über physiologischen Temperatur (unveröffentlichte Beobachtung) diktieren. Die optimale Temperatur für die Inkubation PlyC wurde durch die folgenden Schritte näher erläutert: <ol><li> Transform das Expressionskonstrukt pBAD24: plyCA (Amp r) in den kompetenten E. coli-Stamm DH5 pBAD33: plyCB (Cm r). </li><li> Platte die Transformanten auf einem Luria-Bertani (LB)-Agarplatte mit Ampicillin (100 ug / ml) und Chloramphenicol (35 ug / ml) ergänzt. Die Inkubation über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Mit einem sterilen Zahnstocher, impfen einen individuellen Kolonie in jeder Reihe von Vertiefungen (Abbildung 2a) in einem sterilen, klar, Flachboden-96-Well, lidded Mikrotiterplatte mit 200 ul LB mit Ampicillin und Chloramphenicol ergänzt enthält. </li><li> Sicher stellen Sie den 96-Well-Mikrotiterplatte auf einem 37 ° C Schüttelinkubator und wachsen die Bakterien über Nacht bei 300 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Rufen Sie die 96-Well-Mikrotiterplatte aus dem 37 ° C Schüttelinkubator und Replik Platte zu einem neuen 96-Well Mikrotiterplatten wie folgt: <ol class="lalpha"><li> Fügen Sie 180 ul LB mit Ampicillin und Chloramphenicol ergänztIn jede Vertiefung der Replik Platte. </li><li> Übertragen 20 ul von Bakterien aus der Original-Platte in die entsprechenden Vertiefungen in der Replik Platte. Dies sollte in einer anfänglichen OD 600 von ~ 0,5 führen. </li></ol></li><li> Sicher stellen die Replik Platte auf dem 37 ° C Schüttelinkubator und inkubieren Sie die Platte für 1 Stunde bei 300 rpm, dann die inductant. Im Falle der pBAD Expressionssystemen ist die inductant 0,25% Arabinose. Andere Expressionssysteme können unterschiedliche inductants. Legen Sie die Platte wieder auf die 37 ° C Schüttelinkubator und schütteln bei 300 rpm für weitere 4 Stunden, um für die Proteinexpression ermöglichen. Expression der Regel zwischen 10-20 pg PlyC. </li><li> Sobald Proteinexpression abgeschlossen hat, rufen Sie die Replik Platte und Pellet die Bakterien, indem Sie die 96-Well Mikrotiterplatten in einer Kühlzentrifuge, die einen Ausschwingrotor Rotor, der 96-Well-Mikrotiterplatten passt enthält. Zentrifugieren bei 3000 UpM für 10 min bei Raumtemperatur.</li><li> Entfernen Sie die Medien Überstand langsam umdrehen, die Mikrotiterplatte und sanft Dekantieren die Medien. </li><li> Lyse der Zellen durch Zugabe von 50 ul B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent in jede Vertiefung. Inkubieren der Platte bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> Erhöhung der Lautstärke in jeder Vertiefung zu 120 ul 70 ul durch Zugabe von Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,2. </li><li> Das unlösliche Pellet Zelltrümmer durch Spinnen der Platte bei 3000 UpM für 10 min bei 4 ° C in der Kühlzentrifuge. </li><li> Übertragen 110 ul des löslichen Rohlysat zu den entsprechenden Vertiefungen einer 96-Well-Platte Thermocycler. </li><li> Mit 30 min nach der vorgegebenen Inkubationszeit, setzen die löslichen Lysate derzeit wohnhaft in der 96-well Thermocycler Platte mit einem breiten Gradienten Temperaturbereich Spanning 15-20 ° C. Beachten Sie, ist das Ziel, bei welcher Temperatur ein bestimmtes Enzym verliert&gt; 95% katalytische Aktivität zu bestimmen. </li><li> Nach der Inkubation inkubieren 96 wellThermocycler Platte bei 4 ° C für 5 min und dann 100 ul der löslichen Lysaten aus der 96-Well-Platte Thermocycler zu ihren entsprechenden Speicherort auch in der endgültigen 96-Well-Mikrotiterplatte. </li><li> Mit einem 12-Kanal-multipipettor, fügen Sie 100 ul GAS-Stamm D471 in jede Vertiefung. Beachten Sie, D471 Zellen, die ursprünglich von Übernacht-Kulturen gefriergetrocknet und erneut mit PBS pH 7,2 bis eine OD 600 von ~ 2,0 erhalten. </li><li> Anschließend wird der 96-Well-Platte in der Mikroplatte Spektralphotometer und überwachen die Enzymkinetik durch Messung der OD 600 alle 15 Sekunden für 20 min. Die niedrigste Temperatur, Inkubationszeit, die Vertiefungen, die eine Änderung der optischen Dichte (AOD ≤ 0,1) fehlte entsprach wird als der nicht-permissiven Temperatur. </li></ol> Nach einem breiten Temperaturbereich Bildschirm durchgeführt wird, um das nicht-permissiven Temperatur zu identifizieren, können die obigen Schritte in einem engeren Bereich von Temperaturen (5 ° -10 ° C) zu erhellen wiederholt werdendie genaue nicht-permissiven Temperatur für das Enzym von Interesse. Hinweis kann der nicht-permissiven Temperatur in diesem Assay identifiziert anders sein als die Schmelztemperatur durch andere Mittel aufgeklärt aufgrund der Unterschiede im Volumen, Konzentration etc. 2. Erzeugen der Mutant Bibliothek Die Schaffung der Mutantenbibliothek zu screenenden beinhaltet zufällig Einbau von Mutationen durch einen fehlerhaften DNA-Polymerase mit minimaler Verzerrung der Nukleotid plyCA Gens unter Verwendung der GeneMorph II Zufällige Mutagenese-Kits wie folgt: <ol><li> Entwerfen Nukleotidprimer mit ähnlichen Schmelztemperaturen (T m) zwischen 55 bis 72 ° C mit den Restriktionsschnittstellen der Wahl an der 5 &#39;und 3&#39; Enden des plyCA Gens. </li><li> Da die gewünschte Mutation beträgt 2-3 Nukleotiden pro plyCA (1,4 kb), verwenden Sie die PCR-Reaktion-Konzentrationen sowie die Thermocycler vom Hersteller empfohlen für geringen Mutationsrate frequencies (0-4,5 pro kb). </li><li> Klonen der mutagenisierten plyCA Gene in den Expressionsvektor pBAD24. </li><li> Transformieren der Konstrukte in eine DH5a pBAD33: plyCB Hintergrund und Platte Transformanten auf LB-Agarplatten mit Ampicillin und Chloramphenicol ergänzt. </li><li> Zusätzlich zu transformieren und Platte DH5a pBAD33: plyCB mit dem Expressionsvektor pBAD24 enthaltend die WT plyCA Gens. Kolonien von dieser Platte wird wie die Kontrollen beim Screening dienen. </li></ol> 3. 96 Well Mikrotiterplatten Vorbereitung und Cell Growth AGB <ol><li> Füllen Sie jede Vertiefung einer 96-Well Mikrotiterplatten mit 200 ul LB mit Ampicillin und Chloramphenicol ergänzt. </li><li> Nach der Mikrotiterplatte schematische (Abb. 2b), sorgfältig wählen Sie eine einzelne Kolonie von der Nacht Agarplatten mit einem sterilisierten Zahnstocher und impfen die Bakterien in der Vertiefung der 96 bezeichnet Mikrotiterplatten plate. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass nur eine Kolonie pro Well geimpft. </li><li> Schütteln Sie die fest verankert 96-well Mikrotiterplatte bei 300 rpm über Nacht bei 37 ° C. </li></ol> 4. Replica Plating, Protein Expression Induktion und Lysate Vorbereitung <ol><li> Folgen Sie den Schritten 1,5-1,11 aus dem Abschnitt &quot;Bestimmung der optimalen Heizung Bedingungen&quot; mit einer Modifikation. Bewahren Sie die Original-Platte bei 4 ° C nach der Replika-Plattierung Schritt abgeschlossen hat. </li><li> Nach Schritt 1.11, Übertragung 110 ul des löslichen Rohlysat zu den entsprechenden Vertiefungen einer 96-Well-Platte Thermocycler mit Ausnahme der positiven Kontrollvertiefungen A1-D1. Im Hinblick auf die positive Kontrolle Lysaten (dh Lysaten, die nicht erwärmt werden), 100 ul Transfer der Lysate auf die entsprechenden Vertiefungen einer neuen Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, die als letzte Testplatte für das Experiment und auf Eis lagern dienen wird. </li></ol> 5. Löslichen Lysate Heat Treatment <ol><li> Erwärmen der negativen Kontrolle und mutierten löslichen Lysaten derzeit beengten im 96-Well-Platte in dem Thermocycler Thermocycler für 30 min bei der optimierten nicht permissiven Inkubationstemperatur in Schritt 1 bestimmt. </li><li> Nach nicht-permissiven Temperatur Inkubation inkubieren 96 well Thermocycler Platte bei 4 ° C für 5 min. </li><li> Übertragen Sie 100 ul der löslichen Lysate aus der 96-Well-Thermocycler Platte ihrer identischen auch Standorte in der abschließenden 96-Well Mikrotiterplatten-Assay Platte bereits mit den positiven Kontrolle löslichen Lysate. </li><li> Mit einem 12-Kanal-multipipettor, fügen Sie 100 ul GAS-Stamm D471 in jede Vertiefung. Sofort legen die Platte in der Mikroplatten-Spektralphotometer. </li><li> Überwachen Sie die Enzymkinetik durch Messung der OD 600 alle 15 Sekunden für 20 min. <ol class="lalpha"><li> Eine Variante mit PlyC fortgeschritten thermische Verhalten wird als ein Konstrukt, das die ursprüngliche optische Dichte um 50 Prozent abnehmen kann in weniger als 900 Sekunden bei der definiertenicht-permissiven Temperatur. Zusätzlich müssen die positiven Kontrollen (dh nicht-beheizten, WT PlyC) zu WT katalytische Aktivität entfalten (t 1/2 ≤ 100 sec) und die negativen Kontrollen (dh erhitzt, WT PlyC) sollte keine Aktivität. </li></ol></li><li> Sobald eine Variante mit PlyC fortgeschritten thermische Verhalten ermittelt wird, Abrufen der ursprünglichen Platte bei 4 ° C und inoculate Bakterien aus der einzelnen Vertiefung spezifisch für die Mutante von Interesse in frischem LB-Medium mit Ampicillin und Chloramphenicol ergänzt gespeichert. Wachsen des Inokulums über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Extrahieren und zu reinigen Plasmid-DNA aus der Kultur und dann legt für die Sequenzierung, um die Nukleotid-Mutationen, die verbesserte thermische Verhalten abzuleiten, um PlyCA identifizieren. Darüber hinaus ergänzen eine kleine Teilmenge der Übernacht-Kultur mit 10% Glycerin und bei -80 ° C zur weiteren Verwendung. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll, das in Abbildung 1 dargestellt, stellt eine 96-well Mikrotiterplatte Methodik, die ein bis gerichteten Evolution zu verwenden, um die Thermostabilität einer bakteriolytischen Enzyms erhöhen kann. Durch die Verwendung eines fehlerhaften DNA-Polymerase, einer zufälligen Mutationen, die die gesamte kinetische Stabilität des übersetzten bakteriolytischen Molekül von Interesse, das typischerweise durch molekularen Reorganisationen bestehend aus zunehmender elektrostatischen erhöhen einführen kann, Interaktionen Disulfidbrücke und hydrophoben erzeugen, die eine verbesserte Molekülpackung, erweiterte Modifikationen der Oberflächenladung Netzwerken oder Verstärkung einer höheren Oligomerisierungszustand 17-18. Nach dem Einbringen von Nukleotid-Mutationen wurde ein umfangreiches Screening-Verfahren dann verwendet, um Mutationen, die thermisch nutzbringende identifizieren. Die repräsentativen hier vorgestellten Ergebnisse wurden auf einer Runde Zufallsmutagenese basiert. In Wirklichkeit ist vorgeschlagen worden, dassmindestens drei aufeinanderfolgenden Runden der Zufallsmutagenese ist jede Verwendung der robustesten Mutante als Lead Enzym, gefolgt durch DNA-Shuffling geeignet für diese Art der gerichteten Evolution thermischen Verhaltens in der 2. Es ist wichtig zu verstehen, dass, während diese Protokoll identifiziert Mutationen, die kinetische Stabilität zu vergrößern, diese Varianten nicht notwendigerweise Thermostabilität erhöht. Ein Molekül wird als thermostabile wenn es die Fähigkeit, seine Struktur auf einer hohen Temperatur zu halten hat. Jedoch in dem Assay präsentiert werden die Restaktivität der Mutante Lysaten nicht bei gleicher Temperatur, dass sie zunächst wurden während des Wärmebehandlungsschritts inkubiert und damit ein möglicherweise für Mutationen, die Rückfaltung anstatt verbesserte Thermostabilität 19 fördern Auswählen getestet. Während wir Extrapolieren thermische Verhalten als Hinweis auf thermische Stabilität muss wahre thermische Stabilität empirisch durch Biophys messendenical Methoden wie Circulardichroismus (CD), Differential Scanning Calorimetry (DSC) und Differential-Scanning-Fluorimetrie (DSF). Vorläufige Daten von CD und DSF Experimenten legen nahe, dass mehrere Kandidaten von der Methode vorgestellt identifiziert tatsächlich anzuzeigen fortgeschritten Thermostabilität (Daten nicht gezeigt). Obwohl der hier vorgestellte Methode ist spezifisch für Anwendung erhöhten thermischen Verhalten PlyC kann diese gleiche Methode verwendet werden, um zusätzlich thermische Aktivität auf andere bakteriolytischen Enzymen steigern mit geringfügigen Veränderungen Variablen wie Puffer, Mutationsraten, Erwärmungsbedingungen und Expressionssysteme werden. Eine kritische Variable assoziiert mit diesem Assay betrifft die Nukleotid Mutationsrate des fehlerhaften DNA-Polymerase. Wir entschieden uns für die fehleranfällige Mutazyme II-DNA-Polymerase in unserem gerichtete Evolution Assay verwenden, durch experimentelle Hinweise darauf, diese besondere Enzym zeigt die geringste Vorspannung mitBezug auf die Nukleotide werden zufällig in dem interessierenden Gen eingebaut, wenn auf andere zufällige Mutagenese-Techniken, wie die Verwendung von Hydroxylamin, Mutator E. Vergleich coli-Stämme und andere fehleranfällige DNA polyermases 20. Im Allgemeinen neigen niedrigere Mutationsraten zu sein aus zwei Gründen wünschenswert. Erstens Engineering Thermostabilität an Proteine ​​typischerweise aus relativ wenigen Aminosäuresubstitutionen. Hohe Mutationsraten kann dramatische strukturelle Veränderungen insbesondere Moleküle, die abschließend in strukturellen Fehlfaltung und funktionelle Abweichungen führen kann. Beispielsweise kann die Einarbeitung von Glycin und Prolin-Reste stören alpha schraubenförmigen sekundären Strukturen 21. Sekunde, hohe Nukleotid Mutationsraten die Chancen erhöhen Einbeziehung vorzeitige Stoppcodons, was abgeschnitten Moleküle, die biologisch inaktiv sind. Im Allgemeinen werden niedrigere Mutationsraten bevorzugt, da geringere Fehlerraten Ergebnis im accumulation der adaptiven Mutationen während höhere Mutationsraten neutral oder schädlichen Mutationen zu erzeugen 22. Für jede Runde der Zufallsmutagenese, beinhaltet eine weitere kritische Variable, daß man Optimierung des Inkubationstemperatur während des Screening-Prozesses verwendet wird. Auswahl der experimentellen nicht-permissiven Temperatur ist relativ schwierig. Wir haben uns zunächst verwendet eine Inkubationstemperatur, die 10 ° C höher als die nicht-permissiven Temperatur von PlyC, aber nach Screening 3.000 Mutanten konnten wir keine vorteilhafte Mutationen zu identifizieren. Unter Berücksichtigung der gerichteten Evolution Methoden aus sequenziellen Identifizieren von Vorteil Aminosäuresubstitutionen, additive Wirkungen haben, wurde festgestellt, dass eine weniger strenge Temperatur während des Screening-Prozesses verwendet werden soll, auch wenn es die Möglichkeit der Erzeugung Fehlalarmen erhöht. Als solches verwendet man eine Inkubationstemperatur betrug die nur wenige Grad oberhalb der Nicht-Zulive Temperatur und nachgesiebt ausgewählten Bewerber auszuschließen, die False-Positives. Wir entschieden uns, eine Inkubationstemperatur, die nicht allzu gemäßigten nutzen (≤ 1 ° C höher als niedrigsten nicht-permissiven Temperatur) und umgekehrt nicht zu hart (≥ 5 ° C höher als niedrigsten nicht-permissiven Temperatur). Die ideale Temperatur haben wir beschlossen, in diesem speziellen Assay verwenden, war eine moderate 2 ° C höher als die experimentell ermittelten nicht-permissiven Temperatur. Auswählen einer Temperatur, die zu mild ist, wird in einer wesentlich höheren falsch positiven Identifizierung Rate als die ~ 20% haben wir beobachtet (Tabelle I) ergeben bei Verwendung eines moderaten Inkubationstemperatur. Darüber hinaus konnte mit einer Inkubationstemperatur, die zu hart ist letztlich in der Unfähigkeit, Mutanten mit deutlich verbesserte thermische Verhalten zu identifizieren führen. Zum Beispiel mit einer Inkubationstemperatur von ≥ 5 ° C würde in der Unfähigkeit geführt haben, um die Identifizierungverspricht 29C3 Mutante als auch die Mehrheit der anderen Kandidaten in der ersten Screening-Runde ausgewählt. In Summe bieten wir ein Protokoll für Engineering bakteriolytischen Enzyme verbesserte kinetische Stabilität zu erwerben. Darüber hinaus kann diese gleichen Assay ohne die Erwärmungsschritte, zum Screening auf Mutationen, die katalytische Aktivität zu erhöhen verwendet werden. Vermehrung sowohl katalytische Aktivität und Thermostabilität ist ein wichtiger Entwicklungs-Hürde keinen therapeutischen Enzym. Obwohl die Details dieser protokollspezifischen zum Endolysin PlyC sind, kann die Methodik einem bakteriolytischen Enzym mit nur wenigen Änderungen angepasst werden. Wir die vorläufigen Ergebnisse aus nur der ersten Runde der Mutagenese, die diese Funktionalität des Assay überprüft, was zur Umsetzung und zur Identifizierung von Mutationen, die eine Erhöhung der Thermostabilität von molekularen signifikanter Größe generieren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> B-PER II Bacterial Protein Extraction Reagent </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78260 </td></tr><tr><td> GeneMorph II Zufallsmutagenese Kit </td><td> Agilent Technologies </td><td> 200500 </td></tr><tr><td> Löschen 96 Well, Flachboden-Mikrotiterplatte mit Deckel </td><td> BD Vacutainer Labware Medical </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> 96 Well Nonskirted PCR Plates </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-232 </td></tr><tr><td> Ausschwingrotor </td><td> Eppendorf </td><td> A-2-DWP </td></tr><tr><td> Ampicillin Sodium Salt </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1760 </td></tr><tr><td> Chloramphenicol </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP904 </td&gt; </tr><tr><td> Arabinose </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2504 </td></tr><tr><td> pBAD24 Expression Vector </td><td> ATCC </td><td> 87399 </td></tr><tr><td> pBAD33 Expression Vector </td><td> ATCC </td><td> 87402 </td></tr></tbody></table>

a new screening method for the directed evolution of thermostable bacteriolytic enzymes

Gerichteten Evolution wird als eine Methode der natürlichen Selektion zu nutzen, um Proteine ​​konstruieren, um besondere Eigenschaften, die nicht mit dem Protein in der Natur assoziiert sind zu erwerben definiert. Literatur hat zahlreiche Beispiele für die Umsetzung der gerichteten Evolution zur Verfügung gestellt, um erfolgreich zu verändern molekularen Spezifität und Katalyse 1. Der primäre Vorteil der Verwendung gerichteten Evolution statt rationellere Ansätze für Molekulartechnik betrifft das Volumen und Variantenvielfalt, die 2 gescreent werden können. Eine mögliche Anwendung der gerichteten Evolution beinhaltet die Verbesserung der strukturellen Stabilität bakteriolytischen Enzymen, wie Endolysinen. Bakteriophagen kodieren und auszudrücken Endolysine eine kritische kovalenten Bindung im Peptidoglycan (dh Zellwand) von Bakterien hydrolysieren, was Wirtszelle Lyse und Freisetzung von Nachkommen Virionen. Bemerkenswert ist, besitzen diese Enzyme die Fähigkeit, extrinsisch induziert Lyse susceptIVK Bakterien in Abwesenheit von Phagen und ferner wurden sowohl in vitro als auch in vivo für ihr therapeutisches Potential 3-5 validiert. Das Thema unserer gerichtete Evolution Studie beinhaltet die PlyC Endolysin, die aus PlyCA und PlyCB Untereinheiten 6 besteht. Wenn gereinigtes und fügte extrinsisch, lysiert die PlyC Holoenzym Gruppe A-Streptokokken (GAS) sowie anderen Streptokokken Gruppen in wenigen Sekunden und weiterhin wurde in vivo gegen GAS 7 validiert. Bezeichnenderweise Überwachung der Rest Enzymkinetik nach erhöhter Temperatur Inkubation bietet deutliche Hinweise darauf, dass PlyC lytische Aktivität verliert abrupt bei 45 ° C, was auf eine kurze therapeutische Haltbarkeit, die zusätzliche Entwicklung dieses Enzyms begrenzen kann. Weitere Studien zeigen, die mangelnde thermische Stabilität nur für die PlyCA Untereinheit beobachtet, während die PlyCB Untereinheit ist stabil bis zu ~ 90 ° C (unveröffentlichte Beobachtung). Neben PlyC bestehen siele Beispiele in der Literatur, die thermolabile Natur Endolysine beschreiben. Beispielsweise verliert die Staphylococcus aureus Endolysin LysK und Streptococcus pneumoniae Endolysinen Cpl-1 und Pal Aktivität spontan auf 42 ° C, 43,5 ° C und 50,2 ° C, jeweils 8-10. Nach der Arrhenius-Gleichung, die die Geschwindigkeit einer chemischen Reaktion bezieht sich auf die Temperatur, die in dem bestimmten System, wird eine Erhöhung der Thermostabilität mit einer Zunahme der Lebenserwartung Regal 11 korrelieren. Zu diesem Zweck hat die gerichtete Evolution gezeigt worden, um ein nützliches Werkzeug für die Änderung der thermischen Aktivität verschiedener Moleküle in der Natur, aber niemals hat dieser spezielle Technologie bereits erfolgreich für das Studium der bakteriolytischen Enzymen ausgenutzt. Ebenso erfolgreich Konten voran die strukturelle Stabilität von dieser besonderen Klasse von Antibiotika überhaupt sind nicht vorhanden. In diesem Video beschäftigen wir eine neue Methode, die einen Fehler-pr verwendetein DNA-Polymerase durch eine optimierte Siebvorgang unter Verwendung eines 96-Well-Mikrotiterplatten-Format, um Mutationen an den PlyCA Untereinheit des PlyC Streptokokken Endolysin die zu einer Erhöhung der Stabilität enzymkinetische (Abbildung 1) korrelieren identifizieren gefolgt. Ergebnisse nach nur einer Runde der Zufallsmutagenese schlagen die Methodik generiert PlyC Varianten, die mehr als zweimal die restliche Aktivität beibehalten, wenn zum Wildtyp (WT) PlyC nach erhöhter Temperatur Behandlung verglichen.

Zum Abschluss der ersten Runde der Zufallsmutagenese wurden über 6.000 PlyC Mutanten gescreent und insgesamt 35 Mutanten mit potentiell erhöhten thermischen Verhaltens identifiziert, ausgewählt und sequenziert. Genomanalyse, die in Tabelle I zusammengefaßt, legt nahe, dass der 35 Kandidaten, 7 der Konstrukte enthalten WT PlyCA Sequenzen auf der Ebene der Translation, entsprechend Fehlalarme durch den Assay identifiziert. Von den verbleibenden 28 Kandidaten, war die Mutation Bereich von 1 bis 6 Nukleotid-Mutationen mit einem Durchschnitt von 2,75 Mutationsrate Nukleotide pro plyCA Gen, das in der 2-3 Nukleotid Mutationsbereich wir Targeting war. Auf der Ebene der Translation, ergab dies insbesondere Nucleotid-Mutation und Frequenz eine Aminosäuremutation Bereich von 1 bis 5 Aminosäuren, mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 1,9 Mutation Aminosäuremutationen pro PlyCA Polypeptids. Von den 28 Kandidaten mit mindestens einer Aminosäure MutatIonen wurden vier dieser mutierten Konstrukte zufällig für die weitere Charakterisierung zu bestätigen, dass die umfangreiche Screening-Verfahren der gerichteten Evolution Methodik wurde in der Tat richtig funktioniert gewählt. Die mutierten PlyC Enzyme wurden zu&gt; 95% Homogenität mittels SDS-PAGE-Analyse, wie oben beschrieben basierend 6-7 gereinigt. Enzymkinetik von WT PlyC und jedem der vier PlyC Mutanten wurden in gleichen molaren Konzentrationen nach Inkubation der gereinigten Enzymen an verschiedenen erhöhten Temperaturen aufweist. Die Aktivität wurde nach der Zugabe von D471 GAS durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm alle 15 Sekunden für 20 min verfolgt. Aktivität wurde als die restliche maximale Geschwindigkeit des Enzyms nach Wärmeinkubation definiert. Von den vier Kandidaten nach dem Zufallsprinzip für die weitere Charakterisierung ausgewählt, zeigten Mutanten 29C3 am meisten verbesserten thermischen Verhalten. Das thermische Verhalten der WT PlyC und 29C3 wurde bei verschiedenen Temperaturen untersucht während Inkubieren und Testen auf Aktivität in PBS pH 7,2 bei80 nM und 40 nM Konzentrationen sind. Die 45-50 ° C Inkubationsexperimente (Abbildung 3) wurden in einem Thermocycler, wobei die Proben in einem dünnwandigen 96-Thermocycler Platte in einem Gesamtvolumen von 120 ul inkubiert wurden durchgeführt. Der 35 ° C, 40 ° C und 45 ° C Inkubationsexperimente (Abbildung 4 und 5) wurden in einem Heizblock bei dem die Proben in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in einem Gesamtvolumen von 1,3 ml inkubiert wurden durchgeführt. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. WT PlyC und 29C3 zeigte keinen signifikanten Unterschied in kinetische Stabilität bei Raumtemperatur (25 ° C), wie in dem ersten Satz von Stangen in Abbildung 3 dargestellt. Nachdem jedoch eine kurzfristige Inkubation für 30 min von Temperaturen im Bereich von 45-50 ° C war die Aktivität von 29C3 wesentlich größer als die spezifische Aktivität zu dem WT-Konstrukt bei jeder Temperatur Punkt. Zum Beispiel, erscheint WT PlyC einen 44% igen Verlust an Aktivität bei 45,2° C während 29C3 zeigte nur eine 2% Verlust in der Aktivität bei der gleichen Temperatur. Langzeitinkubation Studien Vergleichen der Restaktivität von sowohl WT PlyC und 29C3 wurden zusätzlich bei 35 ° C und 40 ° C mit der Messung der Restaktivität bei 24 und 48 h Zeitpunkten. Bei 35 ° C, erscheint 29C3 41% und 176% höhere Aktivität als WT PlyC bei 24 und 48 Stunden Inkubationszeit Punkten bzw. (Abbildung 4a). Bei 40 ° C, erscheint 29C3 28% und 107% höhere Aktivität als WT PlyC bei 24 und 48 h Inkubationszeit Punkten, bzw. (4b). Die Restaktivität von WT PlyC und 29C3 wurden alle 20 min für insgesamt 3 Stunden bei 45 ° C überwacht WT PlyC konnte nur 21% der Aktivität nach einer 3-stündigen Inkubation bei dieser Temperatur halten während 29C3 konnte auf 46% Aktivität beibehalten. Die Halbwertszeit (t 1/2) für WT PlyC und 29C3 waren 67 und 147 min, bzw. schlagen<html> ten, dass 29C3 hat eine 2,2 fache Erhöhung der kinetischen Stabilität bei 45 ° C (Abb. 5). <table border="1"><tbody><tr><td> Insgesamt Runde 1 Bewerber </td><td> 35 </td></tr><tr><td> Kandidaten mit WT PlyCA Sequence </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Kandidaten mit ≥ 1 Aminosäuremutation </td><td> 28 </td></tr><tr><td> - Durchschnittliche Nucleotide Mutation Rate (nt / plyCA) </td><td> 2,75 </td></tr><tr><td> - Nucleotide Mutation Range (nt) </td><td> 1-6 </td></tr><tr><td> - Durchschnittliche Aminosäuremutation Rate (AA / PlyCA) </td><td> 1,9 </td></tr><tr><td> - Amino Acid Mutation Range (AA) </td><td> 1-5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Candidate Pool Genomic Analysis. pload/4216/4216fig1highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Gerichtete Evolution Test-Methodik. In der gerichteten Evolution, beginnt man mit der Führung Enzym, das WT PlyC wäre für die erste Runde. Eine Bibliothek von Mutanten, die zufällige PlyC unvoreingenommene Nukleotid Mutationen zur plyCA Gen wird dann durch einen fehlerhaften DNA-Polymerase konstruiert, kloniert in den Expressionsvektor pBAD24 und in den E. coli-Stamm DH5a bereits enthaltenden pBAD33:. plyCB Einzelne Transformanten werden in ihre eigenen spezifischen well einer 96 well-Mikrotiterplatte inokuliert. Durch ein umfangreiches Screening-Verfahren werden einzelne PlyC Mutanten, die katalytisch aktiv sind nach Inkubation bei einer nicht-zulässigen Temperatur als Mutanten mit verbesserten kinetischen Stabilität klassifiziert. Theconstruct Anzeigen der meisten fortgeschritten Wärmeverhalten wird folglich wird das Blei Enzym für die nächste Runde der Zufallsmutagenese. Insgesamt gibt es drei komplette Runden random Mutagenese gefolgt von DNA-Shuffling, was zu einem bakteriolytischen Molekül mit entwickelt thermisches Verhalten. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4216/4216fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig2.jpg" /> Abbildung 2. 96-well Mikrotiterplatte Vorlagen für die gerichtete Evolution Assay. Die Mikrotiterplatte schematische bei der Bestimmung der optimalen Heizbedingungen (Abbildung 2a) besteht aus Impfen einer einzigen elterlichen WT PlyC Klon in jeder Zeile der Mikrotiterplatte. Die Mikrotiterplatte schematische während Mutante Screening (2b) aus Inokulieren alle Vertiefungen in Spalte 1 mit einer einzigartigen elterliche WT PlyC Klon sowie Inokulieren alle Vertiefungen in Spalten 2-12 mit einer verschiedenen PlyC Mutante Klon. Wells A1-D1 sind für die positive elterliche Kontrolle, die zusammen bezeichnetnsist der WT PlyC Konstrukte nicht auf nicht zulässige Temperatur Inkubation ausgesetzt. Wells E1-H1 sind für die negativen Kindersicherung, welche von WT PlyC Konstrukte, die auf nicht-zulässigen Temperatur Inkubation ausgesetzt sind, bestehen bezeichnet. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig3.jpg" /> Abbildung 3. Restaktivität kinetische Analyse Vergleichen WT PlyC und 29C3. Enzyme wurden bis zur Homogenität gereinigt und inkubiert für 30 Minuten in einem Thermocycler in gleichen molaren Konzentrationen entweder bei Raumtemperatur oder bei einem Temperaturgradienten im Bereich von 45-50 ° C. Enzymatische Aktivität korreliert mit der maximalen Geschwindigkeit nach bestimmten Temperatur Inkubation angezeigt. Mit Ausnahme der 25 ° C und 47,7 ° C, die Abweichung in der Aktivität zwischen WT und 29C3 bei jeder Temperatur korreliert, um einen p-Wert &lt;0.05. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten angegeben. </p&gt; <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig4.jpg" /> Abbildung 4. Restaktivität kinetische Analyse Vergleichen WT PlyC bis 29C3 bei 35 ° C und 40 ° C äquimolare Konzentrationen von gereinigtem WT PlyC und 29C3 wurden in einem Heizblock bei 35 ° C (Fig. 4a) oder 40 ° C (4b) inkubiert. Die restliche Enzymaktivität wurde bei 24 und 48 h Zeitpunkten gemessen. Die Aktivität von jedem Konstrukt angezeigt wurde, um die Maximalgeschwindigkeit zum Zeitpunkt Null angezeigt normalisiert. Die Variation in der Aktivität zwischen WT und 29C3 bei jeder Temperatur und Zeitpunkt bis zu einem p-Wert &lt;0.05 korreliert. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten angegeben. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig5.jpg" /> Abbildung 5. Restaktivität kinetische Analyse verglichenWT PlyC bis 29C3 bei 45 ° C äquimolare Konzentrationen von gereinigtem WT PlyC und 29C3 wurden in einem Heizblock bei 45 ° C und die restliche Enzymaktivität wurde alle 20 min gemessen 3 h inkubiert. Die Aktivität von jedem Konstrukt angezeigt wurde, um die Maximalgeschwindigkeit zum Zeitpunkt Null angezeigt normalisiert. Mit Ausnahme der Datenpunkte bei 20 min, die Variation in der Aktivität zwischen WT und 29C3 zu jedem Zeitpunkt auf einen p-Wert &lt;0.05 korreliert. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten angegeben.

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Eine neue Screening-Methode für die gerichtete Evolution thermostabiler bakteriolytischer Enzyme | Immunologie und Infektion | Video

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Eine neuartige Methode der gerichteten Evolution spezifischen Bereich der Thermostabilität Engineering entwickelt wurde und folglich validiert bakteriolytischen Enzymen. Nach nur einem Runde der Zufallsmutagenese, ein weiterentwickelter bakteriolytischen Enzym, PlyC 29C3, erscheint größer als zweimal die Restaktivität bei dem Wildtyp-Protein nach erhöhter Temperatur Inkubation verglichen.

Ein neues Screening-Verfahren für die gelenkte Evolution von thermostabilen Bakteriolytische Enzyme

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

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17.8K Aufrufe.  University of Maryland. Eine neuartige Methode der gerichteten Evolution spezifischen Bereich der Thermostabilität Engineering entwickelt wurde und folglich validiert bakteriolytischen Enzymen. Nach nur einem Runde der Zufallsmutagenese, ein weiterentwickelter bakteriolytischen Enzym, PlyC 29C3, erscheint größer als zweimal die Restaktivität bei dem Wildtyp-Protein nach erhöhter Temperatur Inkubation verglichen.

Serie: A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Partikelagglutinations Methode für Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

Auswahl der Plasmodium falciparum Parasiten für Cytoadhesion zu Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Eine Einführung in die parasitischen Wespen<em&gt; Drosophila</em&gt; Und die antiparasitäre Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of lesion size is a hard procedure and animals show difficulty to eat, breathe and move because of the lesion. In order to optimize the hamster model for cutaneous leishmaniasis, young adult male and female golden hamsters (Mesocricetus auratus) were injected intradermally at the dorsal skin with 1 to 1.5 x l07 promastigotes of Leishmania species and progression of subsequent lesions were evaluated for up to 16 weeks post infection. The golden hamster was selected because it is considered the adequate bio-model to evaluate drugs against Leishmania as they are susceptible to infection by different species. Cutaneous infection of hamsters results in chronic but controlled lesions, and a clinical evolution with signs similar to those observed in humans. Therefore, the establishment of the extent of infection by measuring the size of the lesion according to the area of indurations and ulcers is feasible. This approach has proven its versatility and easy management during inoculation, follow up and characterization of typical lesions (ulcers), application of treatments through different ways and obtaining of clinical samples after different treatments. By using this method the quality of animal life regarding locomotion, search for food and water, play and social activities is also preserved.

Optimization of the experimental hamster model for cutaneous leishmaniasis by intradermal injection of Leishmania promastigotes at the dorsal skin. This approach is useful during inoculation, follow-up, characterization of lesions, application of treatments and obtaining of clinical samples. Locomotion, search for food and water, play and social activities are preserved.

Kutane Leishmaniose in der Rückenhaut von Hamstern: ein nützliches Modell für das Screening von Drogen leishmanientötende

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic biotinylation by the E. coli biotin-protein ligase BirA is highly specific and allows for the biotinylation of target proteins in their native environment; however, the current usage of BirA mediated biotinylation requires the presence of a synthetic acceptor peptide (AP) in the target protein. Therefore, its application is limited to proteins that have been engineered to contain the AP. The purpose of the present protocol is to use the bacterial display of a peptide derived from an unmodified target protein to select for BirA variants that biotinylates the peptide. The system is based on a single plasmid that allows for the co-expression of BirA variants along with a scaffold for the peptide display on the bacterial surface. The protocol describes a detailed procedure for the incorporation of the target peptide into the display scaffold, creation of the BirA library, selection of active BirA variants and initial characterization of the isolated BirA variants. The method provides a highly effective selection system for the isolation of novel BirA variants that can be used for the further directed evolution of biotin-protein ligases that biotinylate a native protein in complex solutions.

Here we present a method to select for novel variants of the E. coli biotin-protein ligase BirA that biotinylates a specific target peptide. The protocol describes the construction of a plasmid for the bacterial display of the target peptide, generation of a BirA library, selection and characterization of BirA variants.

Bakterielles Peptid-Display zur Auswahl neuartiger Biotinylatierungsenzyme

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...