<p class="jove_content"&gt; Wir danken Nadeshda Wolf, Nadine und Susanne Eschen Delong für hervorragende Tierhaltung. CW wurde durch ein Promotionsstipendium des Helmholtz-Programm &quot;unterstützt<em&gt; BioGrenzflächen</em&gt; International Graduate School &#39;(BIFIGS). Weitere Unterstützung wurde von einem KIT-RISC-Stipendium und durch ein Marie Curie International Reintegration Grants im 7. Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (PIRG07-GA-2010 bis 267552) zu CG zur Verfügung gestellt. Marie Curie Initial Training Network (238821) - AHS wurde von BOLD (Biologie der Leber und der Bauchspeicheldrüse Entwicklung und Krankheit) unterstützt. UL wurde von Dopaminet RP7 (Siebte Rahmenprogramm) (223744) unterstützt.</p&gt;

1. Behandlung der Tiere Für das Kinn Assay Verwendung 3 dpf Larven, die sich aus Gruppe Paarungen zwischen homozygoten doppelt transgenen cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 und AB (Wildtyp-) Fisch. Sammle Embryonen, die durch natürliche Laichen und heben Sie sie bei 29 ° C in E3 Medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4 und 0,1% Methylenblau, äquilibriert, um pH 7,0) in Petrischalen. Es ist wichtig, um eine Dichte von Embryonen, die nicht mehr als 50-70 Platte zu halten. 2. Larva Sortierung Überprüfen Sie alle Larven unter einem Fluoreszenz-Stereoskop für fluoreszierenden Reporter Ausdruck, spontane Entzündung und entsprechende altersabhängige Entwicklung. 3. Siebmediums Vorbereitung (immer frisch ansetzen) Planen E3-Medium ohne Methylenblau mit DMSO (1% Endkonzentration) und MS222 (0,05 g / l) ergänzt. 4. CuSO4Vorbereitung (immer frisch ansetzen) Erste abwiegen CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) und bereiten eine 20 mM Stammlösung in dH 2 O. Bereiten 120 uM CuSO 4-Arbeitslösung (von 20 mM Stammlösung) in E3/DMSO (1%) / MS-222. Schützen Sie CuSO 4-Lösung von Licht. 5. 384-Well-Platte Vorbereitung (Greiner 384 Well Mikrotiterplatten) Pre-+ 20 ul E3/DMSO (1%) / MS-222 in jede Vertiefung mit einem umgekehrten Pipette. Eine erhöhte Pipettenspitze Bohrung ist erforderlich, um die Embryonen vorsichtig damit umgehen, ohne jegliche Verletzung zuzufügen, dies wird durch Schneiden Sie die Spitze auf eine 2 mm Bohrung durchgeführt. Übertragen Sie einzelne Larve in 74 ul Medium in jede Vertiefung (84 ul für unbehandelte Kontrolle). Wenn nötig, mit Orientierung Larven in einer lateralen Position innerhalb des auch eine flexible Eppendorf Microloader Pipettenspitze (Eppendorf, 5242 956,003). Führen Sie alle folgenden Schritte Liquid-Handling-Roboter mit einer FlüssigkeitHandling Workstation um eine gleichzeitige Behandlung aller Larven zu gewährleisten. 6. Medikamentöse Behandlung Mischen Verbindungen in Drug Stock Platte 5-mal durch Auf-und Abpipettieren. In 16 ul 7,5-fach Drug Stock Platte in jede Vertiefung und mischen Sie 5-mal. Passen Spitze Position innerhalb Brunnen, um Verletzungen der Larven zu verhindern und verzichten auf das Medium 10 pl / s. Mischen Medium in Wells 4-mal, um eine homogene Verteilung des Arzneimittels innerhalb des Bohrlochs zu gewährleisten. 7. Incubation Inkubieren Abschirmblech für 1 h bei 29 ° C mit Alufolie bedeckt, um Verbindungen sowie CuSO 4 vor Licht schützen. 8. Chemische Verwundender In 10 ul 120 uM CuSO 4 funktionierende Lösung in jede Vertiefung mit Ausnahme der negativen Kontrollen, mischen und inkubieren 4 mal wieder für 1 h bei 29 ° C. 9. Waschen Entfernen und austauschen 80 ul von mir<html> Medium aus jeder Vertiefung zweimal (in 20 ul-Schritten) zu entfernen und Verbindungen CuSO 4. 10. Image Acquisition Starten der Bildaufnahme auf einem invertierten automatisierten Mikroskop (dh: Olympus scan ^ R) 90 Minuten nach der anfänglichen Behandlung Kupfer. Setzt die initiale z-Ebene, so dass Neuromasten von rechts und links hintere seitliche Linie sichtbar sind. Bild jedes Well einmal pro Stunde in der Kanäle Hellfeld, mit Cy3 und GFP in 4 Fokalebenen (50 mu m Abstand) ein 4-fach-Objektiv (NA = 0,13). Weitere Informationen zu Bild-und Datenverarbeitung sind auf Anfrage erhältlich. 11. Bildverarbeitung 1. Daten sortieren Raw-Bilder werden mit unseren Kunden Software LabView-Skript verarbeitet. Die erste Operation in der Bildverarbeitung Pipeline wird von RAW-Bildern Sortierung vom Mikroskop erzeugten Daten-Ordner von Kanal-, Brunnen-und Zeit-Punkt-Informationen. ove_step &quot;&gt; 2. Erweiterte Tiefenschärfe Anschließend erzeugt die Software erweitert unscharfe Bilder von 4 Brennebenen für jeden der Kanäle. 3. RGB-Overlay In einem letzten Schritt die erweiterten Fokus Bilder aus den 3 Kanälen zusammengeführt werden, um in einem letzten RGB-Overlay-Bild führen. 4. Automatisierte Erkennung Neuromasten Ein Mustererkennungs-Tool (Rapid-IA LabView-Prototyping-Werkzeug) identifiziert Neuromasten in den RGB-Overlay-Bilder und erstellt eine empirisch definierten Bereich von Interesse rund um den Neuromasten. 5. Quantifizierung Innerhalb der empirisch definierten Bereich von Interesse umgebenden verletzten Neuromasten rot fluoreszierenden Leukozyten (wider als rote Pixel) werden ausgewertet, was zu einer primären Auslesen von p ercent ein REA o l durch eukocytes (Paol) ccupied. Im Durchschnitt 95,27 ± 2,11% (FDA1) und 95,12 ±1,56% (FDA2) von Brunnen (Larven) wurden ordnungsgemäß erkannt und haben in der Folge zu weiteren Datenverarbeitung unterzogen worden. Die Rohdaten-Ausgang (Paol für jeden erkannten Neuromasten) in einer txt-Datei gespeichert und dient als Daten-Input für den MATLAB-Skripten, die die Rohdaten weiterverarbeiten. 12. Data Processing 1. Imaps Beurteilung des Erfolgs einzelner Experimente durch grafische Visualisierung der Rohdaten-Ausgang Paol in einem Farbcode konnte mit sogenannten Entzündung Karten (IMAPS) (Abbildung 2) realisiert werden. Leuchtend grüne spiegelt eine hohe initiale entzündliche Index; schwarz bedeutet, dass keine Entzündung. Dies ermöglicht schnellen Überblick zur raschen Identifizierung von gescheiterten Versuchen, die dann von der weiteren Datenanalyse ausgeschlossen werden können. 2. Mittelung von Kontrollen Jede experimentelle Platte enthält 320 Verbindungen spiegelt eineinzelnen Datenpunkt pro Verbindung und Zeit-Punkt-sowie 32 positiven und negativen Kontrollen. Der 32-Steuerung repliziert sind gemittelte und die Standardabweichung berechnet. Für die Kontrollen nur Datenpunkte innerhalb 2 Standardabweichungen enthalten sind. 3. Normalisierung Die Normalisierung wird durch Tabellenkalkulation getan. Der durchschnittliche Wert von DMSO, wobei die Negativkontrolle, wird auf 0 gesetzt und der höchste gemittelten Paol für die Kupfer-Steuerung wird auf 1 gesetzt, so dass die maximale Differenz zwischen dem positiven und negativen Kontrollproben auf 1 gesetzt ist. Jede Verbindung der Paol wird linear interpoliert oder extrapoliert zur jeweiligen Kontrolle über die experimentelle Platte. 4. Abschließende Auslesen: Entzündliche Index Nach einer ausreichenden Wiederholungsversuchen (zB 15) durchgeführt wurden, werden normalisierte Rohdaten Wiederholungsversuchen gemittelt, was zu einer endgültigen Auslesen - die entzündlicheIndex. Die anfängliche Entzündungsreaktion Index des Kupfer-Steuerung beginnt bei 100% für die Zeit-Punkt-Null und korreliert mit der Bildaufnahme Startzeit (90 Minuten nach der anfänglichen Behandlung Kupfer). 5. Monotone Exponentialregression Fitting Aufgrund einer Entzündung Auflösung im Laufe der Zeit führen wir eine monotone nichtlineare Regression exponentiellen Fitting in Richtung der anfänglichen Entzündung durch <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="Gleichung 1" /> - A 0 ist ein Maß für die ursprüngliche Antwort bei t = 0, wird ein 1 zu der Steigung der Größe über die Zeit passt. 6. 2-D-Merkmalsraum Plot (Abbildung 4) Um den Merkmalsraum zu erzeugen, wird eine nicht-lineare Regression und einen Cluster-Analyse teilt die Merkmalsraum in charakteristische Bereiche, wodurch eine automatisierte Erkennung von interessanten Kandidaten aus verschiedenen immunmodulatorischen Kategorien (Anti-inflammatORY, Anti-Auflösung, pro-inflammatorische, pro-Auflösung). Alle Verbindungen sind in der 2-D-Darstellung von den Parametern a 0 und a 1 bezogen angezeigt. 13. Datenmanagements und der Datenspeicherung Unsere Daten-Handling-Routinen erstellen Internetseiten zu visualisieren und zu repräsentieren, wie Drogen-Bildschirme bieten einen schnellen Überblick über die Bild-und Datenverarbeitung Schritte &#39;Ergebnisse sowie eine detaillierte Ansicht, wenn durch den Benutzer 10 angefordert. Soft-Links zu anderen relevanten heterogenen biologischen und chemischen Datenbanken sowie um eine wertvolle Ressource für vergleichende Studien und Roman 11 vorzusehen integriert. Durch diese Routinen werden die Daten richtig Normen und Metainformationen für die langfristige Speicherung dieser Daten eingestellt. 14. Repräsentative Ergebnisse In einer Pilotstudie Bildschirm analysierten wir eine Bibliothek, bestehend aus 640 FDA zugelassen bekannten bioaktiven Verbindungen für Auswirkungen auf die Initiation, Progression oder Auflösung eines Granulocytic Entzündungsreaktion. Basierend auf der beobachteten Effekte wir klassifiziertes 4 Arten von immunmodulatorischen Phänotypen, die ein Anzeichen sein für verschiedene Wirkmechanismen kann: anti-inflammatorische (1), Anti-Auflösung (2), pro-inflammatorische (3) und pro-Auflösung (4) , welche mit den Parameter a 0 und 1, die von einer monoton nicht-lineare Regression Armatur (E + ao ALX -) entstehen beschrieben in Richtung der ersten Entzündung. A 0 repräsentiert die Größe der Entzündungsreaktion während ein 1 charakterisiert die Steigung der Kurve und beschreibt somit Entzündung die Lösung. Anzeigen aller Verbindungen in einem 2-D-Merkmalsraum Grundstück (A 1 im Vergleich zu einem 0) ermöglicht die automatisierte Identifizierung von Kandidaten schlagen aus den verschiedenen Kategorien immunmodulatorische (Abbildung 3). 45. Stelle von 640 Verbindungen ausgeübt signifikante anti-inflammatorische Wirkung durch Reduktion der entzündlichen ersten Index zu 50% oder weniger. Innerhalb this Kategorie fanden wir sechs Verbindungen aus der pharmakologischen Klasse der nicht-steroidale entzündungshemmende Medikamente (NSAIDs), Bestätigung der Gültigkeit unseres Ansatzes. Allerdings rangiert NSAR nicht zu den stärksten entzündungshemmenden Medikamenten. Abgesehen von den NSAR fanden wir einige zusätzliche pharmakologische Wirkstoff-Klassen wie zum Beispiel Angiotensin-Rezeptorblocker (ARB), Antibiotika und Protonenpumpenhemmern. 7 Verbindungen erfüllten die Kriterien empirisch definierte Schwelle für potenzielle Pro-Auflösung Drogen. 18 Drogen übten einen pro-inflammatorische Wirkung, was zu übertriebenen Leukozytenrekrutierung verletzt Neuromasten im Vergleich zu den positiven Kontrollen. Nur 2-Verbindungen verhindert rechtzeitige Lösung der Entzündungsreaktion. Die entzündungshemmende Wirkung der mehrere Hit-Kandidaten (exemplarische Kandidaten aus oben genannten pharmakologischen Wirkstoffklassen) aus dem Pilot-Bildschirm could in einer Dosis-abhängigen Weise in den nachfolgenden sekundären Assays Chin (Daten nicht gezeigt) bestätigt werden. Eine Wiederholung von 4 potentiellen pro-Auflösung Medikamente nicht bestätigen Sie die angegebene Wirkungsweise wie in der primären Bildschirm ausgeübt. 2 der Medikamente einen leichten entzündungshemmend bei höheren Konzentrationen (20 pM). Ein drittes Medikament zeigte eine marginale Nicht-Dosis-abhängigen anti-inflammatorische Wirkung Arzneimittelkonzentrationen im Bereich von 5 bis 20 uM. Die vierte Droge hatte keine Wirkung auf die entzündliche Reaktion bei den getesteten Konzentrationen. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> Abbildung 1. Workflow des Chin-Assay. Einzelne Verbindung transgenen cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 Larven (3 DPF) werden von Hand in 384-Well Mikrotiterplatten verteilt. Drogen werden gleichzeitig in jede Vertiefung mit einem Zephyr Compact Liquid Handling Workstation hinzugefügt. Die Testplatten werden dann für 1 h bei 29 ° C inkubiert Die Behandlung mit CuSO 4 </sub&gt; - Lösung (10 uM Endkonzentration) für 1 h zufügt, die Verwundung und initiiert eine akute entzündliche Reaktion. Schließlich werden Kupferlösung und Drogen abgewaschen und automatisierte Bildaufnahme gestartet wird (90 Minuten nach der anfänglichen Behandlung Kupfer). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> Abbildung 2. . Übersicht Bild von RAW-Bildern Die Abbildung zeigt RAW-Bilder von 4 Fokalebenen (Z = 0 - 3) im Abstand von 50 um in den Kanälen Cy3 (links) und GFP (rechts) sind. Arrows (Z = 1,2) zeigen beispielhaft Neuromasten, Pfeilspitzen (Z = 1,2) Punkt zu geclusterten Leukozyten um Neuromasten. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> Abbildung 3. Entzündung Maps (IMAPS) Der Erfolg der einzelnen Versuche in imaps was die Entzündungsreaktion (Rohdaten) in einem Farbcode beurteilt werden kann:. Hellgrün spiegelt eine hohe anfängliche Inflation<html> mmatory Antwort; schwarz bedeutet, dass keine Entzündung imaps Zum Zeitpunkt 0 (links) und Zeit-Punkt 5 (rechts) zeigen deutlich, ob ein Experiment in weiteren Datenverarbeitung einbezogen werden sollten.. Kupfer Kontrollen (Zeile 13 und 24) zeigen sich in unterschiedlichen Schattierungen von Grün, während DMSO Kontrollvertiefungen (Zeile 1 und 12) in dunkelgrün oder schwarz erscheinen. Zum Zeitpunkt-Nummer 5 wird eine Entzündung fast in Kupfer Kontrollen lösen, jetzt in dunklen Schattierungen von grün oder schwarz gekennzeichnet. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> Abbildung 4. 2-D-Merkmalsraum Diagramm von 320 Verbindungen eines FDA-Bibliothek und ihre entsprechenden Kontrollen. Alle Verbindung Vertiefungen in einem 2-D Merkmalsraum Plots basierend auf der Parameter a 0 und a 1, die aus einem nicht-linearen ergeben angezeigt Regression Armatur (d/4203/4203eq1.jpg &quot;alt =&quot; Gleichung 1 &quot;/&gt;) in Richtung der anfänglichen Entzündung. Diese Funktion Raum Grundstück erlaubt die automatisierte Identifizierung von interessanten Kandidaten, die zu einer der folgenden vier Kategorien immunmodulatorischen achten, die Anzeichen der Medikamente kann &quot;Wirkungsweise:. anti-inflammatorische (1), Anti-Auflösung (2), pro-inflammatorische (3) und pro-Auflösung (4) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

<ol>
	<li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish.">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li><li>Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+advance:+pharmacological+manipulation+of+inflammation+resolution+during+spontaneously+resolving+tissue+neutrophilia+in+the+zebrafish.">Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).</li><li>Martin, J. S., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+in+vivo+zebrafish+models+to+understand+the+biochemical+basis+of+neutrophilic+respiratory+disease.">Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).</li><li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo:+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation.">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li><li>D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemically+induced+inflammation+assay+in+zebrafish.">A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish.</a> BMC Biol. 8, 151 (2010).</li><li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line.">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li><li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciencenet'+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge.">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li><li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvester':+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources.">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

<p class="jove_content"&gt; Hier präsentieren wir eine vollautomatische Hochdurchsatz-Screening-Strategie zur Identifizierung von immunmodulatorischen Verbindungen in einem ganzen Tier Kontext. Somit ist eine Überwachung einer akuten Entzündungsreaktion<em&gt; In-vivo-</em&gt; Und in Echtzeit.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Wir stellen ein Protokoll zur Zebrafisch als ein wertvolles Modell-Organismus für die Wirkstoffforschung oder Drogen Wiederverwendung Bemühungen gelten, da die Droge Auswirkungen auf die Rekrutierung von Leukozyten an Wunden lassen sich relativ einfach im Rahmen einer voll funktionsfähigen angeborenen Immunsystems untersucht werden. Der einzigartige Vorteil unseres Ansatzes ist die Tatsache, dass chemische Verwundung manuelle Manipulation Larven obsolet macht, so dass eine Automatisierung und Screening in einem High-Throughput-Format.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Darüber hinaus können schädliche oder toxische Arzneimittelwirkungen sowie starken Off-Target-Effekte leicht mit der vorgeschlagenen Set-up beurteilt werden. Die FDA genehmigte jedoch Bibliothek enthielt keine toxischen Verbindungen bei den angegebenen Konzentrationen Screening. Trotzdem haben wir für offensichtlich giftige Verbindungen vorzuschlagen, um den verfügbaren Datenbestand (zB immunmodulatorische Phänotyp, Wirkstoffkonzentration) zwischen Mitgliedern der gleichen pharmakologischen Substanzklasse in der Bibliothek getestet vergleichen. Giftig Mitglieder einer Familie Substanz, die sonst übt eine vielversprechende immunmodulatorische Phänotyp, konnte bei niedrigeren Konzentrationen getestet werden, wenn nötig zu sein.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Wir haben die Möglichkeit der Kategorisierung von Drogen automatisch entsprechend ihrer ausgeübten immunmodulatorischen Wirkung unter Beweis gestellt. Arzneimittel aus der Kategorie der entzündungshemmenden Verbindungen können in unabhängigen Versuchen, die meisten der Verbindungen Ausüben ihrer Wirkung in einer Dosis-abhängigen Weise validiert werden können. Vier Verbindungen als mögliche pro-Auflösung Drogen identifiziert werden konnten bisher nicht als solche bestätigt werden. Es zeigt auch, dass diese besondere Kategorie immunmodulatorische schwierig zu beschreiben ist, da keine Medikamente ausschließlich betrifft Auflösung bisher in der Literatur beschrieben. Jedoch zeigten 3 der 4 erneut geprüft Arzneimittel ein entzündungshemmendes Trend bei höheren molaren Konzentrationen. Die Optimierung der empirisch definierte Schwelle Kriterien sollen helfen, die Anzahl der False-Positives zu reduzieren.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Darüber hinaus bietet die präsentierte Technik die Möglichkeit, für die Identifizierung von Mutationen in Genen, die Leukozyten Zugverhalten genutzt werden<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Abschließend kann das vorgeschlagene Verfahren erleichtern und beschleunigen Wirkstoffforschung oder Drogen Wiederverwendung Bemühungen durch Abgabe von potenziellen neuen Leitstrukturen mit leicht verfügbaren Informationen über die Verträglichkeit der Medikamente, Toxizität, Dosierung sowie mögliche Off-Target-Effekte. Daher dient als einfache, kostengünstige und zeitsparende Strategie in frühen Stadien der Medikamentenentwicklung erzielen.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> Kupfer (II)-sulfat wasserfreiem </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> FDA zugelassenen Arzneimittel Bibliothek </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 Mikrotiterplatte Unverbindliche, μClear </td><td> Greiner </td><td> 781906 </td><td> schwarz </td></tr><tr><td> Olympus scan ^ R </td><td> Olymp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zephyr Compact Liquid Handling Workstation </td><td> Caliper </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

facilitating drug discovery: an automated high-content inflammation assay in zebrafish

Zebrafisch-Larven sind besonders zuträglich ganze Tier kleines Molekül Bildschirmen 1,2 aufgrund ihrer geringen Größe und der relativen Leichtigkeit der Manipulation und Überwachung sowie der Tatsache, dass Verbindungen einfach dem Badewasser hinzugefügt werden und sind leicht absorbiert werden, wenn in einem verabreicht &lt;1% DMSO-Lösung. Durch die optische Klarheit der Zebrafisch-Larven und der Verfügbarkeit von transgenen Linien exprimiert fluoreszierenden Proteinen in Leukozyten bieten Zebrafisch den einzigartigen Vorteil, Überwachen eines akuten Entzündungsreaktion in vivo. Folglich wurde unter Verwendung der Zebrafisch für High-Content-Bildschirme kleines Molekül mit dem Ziel der Identifizierung von immunmodulatorischen Verbindungen mit hohem Durchsatz 3-6 vorgeschlagen worden, was darauf hindeutet Entzündung Induktion Szenarien zB lokalisierte Nicks in fin Gewebe-, Laser-Schäden gerichtet an die Oberfläche des Dotters Embryonen 7 oder Heckflosse Amputation 3,5,6. Der größte Nachteil dieser Methoden war jedochdas Erfordernis einer manuellen Manipulation Larven zu induzieren Verwundung und verhindert so das Hochdurchsatz-Screening. Die Einführung der chemisch induzierte Entzündung (Chin)-Assay 8 beseitigt diese Hemmnisse. Seit Verwundung zugefügt wird chemisch die Zahl der Embryonen, die gleichzeitig behandelt werden können, ist praktisch unbegrenzt. Temporäre Behandlung von Zebrafisch-Larven mit Kupfersulfat selektiv induziert Zelltod in Haarzellen des seitliche Linie System und führt zu einer schnellen Rekrutierung von Granulozyten verletzten Neuromasten. Die entzündliche Reaktion kann in Echtzeit durch Verwendung transgener Verbindung cldnB :: GFP / lysC :: DsRed2 6,9 Zebrafischlarven, die ein grün fluoreszierendes Protein in Neuromasten Zellen, sowie ein rot fluoreszierendes Protein exprimieren Granulozyten Kennzeichnung eingehalten werden. Um ein Screening-Strategie, die sowohl High-Content-und Hochdurchsatz-Analysen erlauben würde, erarbeiten wir eingeführt Liquid-Handling-Roboter-und kombinierter automatisierte MICRoscopy mit einem benutzerdefinierten Skript entwickelte Software. Dieses Skript ermöglicht die automatisierte Quantifizierung der Entzündungsreaktion indem man die Prozent-Bereich von rot fluoreszierenden Leukozyten innerhalb einer empirisch definierten Umgebung verletzten grün fluoreszierenden Neuromasten besetzt. Darüber hinaus haben wir automatisierte Datenverarbeitung, Handhabung, Visualisierung und Speicherung aller auf speziell entwickelte MATLAB-und Python-Skripte basieren. In Kürze stellen wir eine automatisierte HC / HT Bildschirm, der Prüfung von chemischen Verbindungen ermöglicht ihre Wirkung auf Initiation, Progression oder Auflösung eines granulozytäre Entzündungsreaktion. Dieses Protokoll dient einem guten Ausgangspunkt für tiefer gehende Analysen der Droge Mechanismen und Stoffwechselwege in der Orchestrierung von einem angeborenen Immunantwort beteiligt. In Zukunft kann es helfen, zu identifizieren unerträglich giftige oder Off-Target-Effekte bei früheren Phasen der Wirkstoffforschung und reduzieren dadurch prozedurale Risiken und Kosten für die Arzneimittelentwicklung.

Watch this Scientific Journal Video about Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish at JoVE.com

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Hier beschreiben wir einen neuen High-Content-chemisch induzierte Entzündung Assay mit dem Ziel der Identifizierung von immunmodulatorischen Proteine ​​tätig. Wir haben erfolgreich automatisierte Mikroskopie mit selbst entwickelten Software-Scripte für die automatisierte Quantifizierung der Entzündungsreaktion sowie weitere Datenverarbeitung, Analyse-, Bergbau-und Storage kombiniert.

Die Erleichterung Drug Discovery: Eine automatisierte High-Content-Assay Entzündung im Zebrafisch

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

facilitating-drug-discovery-an-automated-high-content-inflammation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K Aufrufe.  Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany. Hier beschreiben wir einen neuen High-Content-chemisch induzierte Entzündung Assay mit dem Ziel der Identifizierung von immunmodulatorischen Proteine ​​tätig. Wir haben erfolgreich automatisierte Mikroskopie mit selbst entwickelten Software-Scripte für die automatisierte Quantifizierung der Entzündungsreaktion sowie weitere Datenverarbeitung, Analyse-, Bergbau-und Storage kombiniert.

Serie: Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

Die Induktion einer entzündlichen Reaktion in der Primär Hepatozyten-Kulturen von Mäusen

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum-Bindungsassay, der die Drug Penetration in Tuberkulose-Läsionen vorhersagt

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...