Die Untersuchung wurde mit Professional Development und Forschung Startup Funds von der University of Ontario Institute of Technology (UOIT) an Dr. John A. Samis und kanadischen Institutes of Health Research Health Professional Student Research Award an Irina Levit unterstützt. Die Autoren danken Shannon Everett (Teaching and Learning Centre, UOIT) für ihre Unterstützung der Vorbereitung des Videos. Die Autoren danken Dr. Michael E. Nesheim (Department of Biochemistry, Universität der Königin, Kingston, ON) für seine Betreuung, Einsicht und hilfreiche Diskussionen. Die Autoren danken Dr. Cheng Hock Toh (Roald Dahl Haemostasis and Thrombosis Centre, Royal Liverpool University Hospital, Liverpool, UK) für die Bereitstellung der DIC Patientenplasmen in der Studie verwendet.

Ein. Vorbereitung der FV-defizienten Humanplasma <ol><li> Dieses Verfahren ist eine Modifikation des Verfahrens ursprünglich von Bloom et al 4 beschrieben. </li><li> Erhalten menschlichem Vollblut von einem zustimmenden gesunden erwachsenen Freiwilligen (männlich oder weiblich, Alter 18 - 50 Jahre), die nicht unter wird keine Medikamente. Latexhandschuhe und einen Laborkittel während des gesamten Verfahrens. </li><li> Es werden 100 ml 3,2% (w / v) Trinatriumcitrat in destilliertem Wasser. Legen Sie 6,0 ml dieser Lösung werden in separaten 60 ml Spritzen. Entfernen Sie die Luft durch Drücken Kolben vorsichtig auf den 6,0 ml-Markierung auf der Spritze. </li><li> Verwenden Sie einen Alkoholtupfer, um Bereich Cubitalvene zwischen Bizeps und Unterarm zu reinigen. Schließen 20 Gauge Schmetterling Vorrichtung an einer 3 ml Spritze. Legen Butterfly-Nadel in Cubitalvene und ziehen vorsichtig auf Kolben, bis Blut füllt die 3 ml-Marke. Entsorgen Sie Spritze mit Blut. Dieser Schritt wird ausgeführt, um jegliche Gewebsfaktor aus dem beschädigten Endothel an der Nadel gelöst zu entfernenVerletzungen Website, die Koagulation aktivieren kann und stören mit der Vorbereitung der FV-Mangelplasma. </li><li> Schließen Butterfly-Nadel bis 60 ml Spritze &#39;geladen&#39; mit 6,0 ml Trinatriumcitrat und ziehen sanft auf den Kolben, bis das Blut erreicht die 60-ml-Markierung auf der Spritze. (Final Citratkonzentration 10.9mm). </li><li> Entfernen Sie die Spritze vom Butterfly-Nadel und vorsichtig mischen Spritze während einer behandschuhten Finger oder Daumen auf die Spritze anschließen. </li><li> Weiter Blutentnahme in 60 ml Spritzen mit jeweils 6,0 ml von 3,2% Trinatriumcitrat, wie oben beschrieben gefüllt. Man sollte Rückgewinnung von ca. 50% des Volumens als Citratblut Plasma nach Zentrifugation und dass 50 FV ul-Mangelplasma wird je Probe in der Mikrotiterplatte Assay erforderlich antizipieren. Unser Labor routinemäßig verarbeitet 300-420 ml Citratblut in einer Zeit mit 5-7 x 60 ml Spritzen mit jeweils 6,0 ml von 3,2% Trinatriumcitrat / Spritze. Dies ist ausreichend, FV-Mangelplasma etwa 3.000 Mikro-Platte-Assays (siehe unten). </li><li> Entfernen Butterfly-Nadel von freiwilligen Arm und drücken Sie eine sterile Gaze über Ort Venenpunktion für 1,0 min. Titelbild Ort Venenpunktion mit einem sterilen Verband. </li><li> Zentrifuge Citratblut bei 3.300 xg für 20 min bei Raumtemperatur. Recover obere gelbe Plasmaschicht einem Plastikbecher mit einem Rührstab mit einem Kunststoff-Pipette dabei nicht um die untere rote und weiße Blutkörperchen Schicht zu stören. </li><li> Measure Volumen von Plasma in ml und behalten 100 ul Plasma vor EDTA-Zugabe auf Eis für zukünftige Prothrombin Gerinnungszeit (PT)-Tests (siehe unten). </li><li> Langsam feste EDTA Citratplasma unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur zu 5mM erreichen (Endkonzentration). Sobald das EDTA gelöst und pH auf 7,0 durch Eintropfen von 1,0 M NaOH unter leichtem Rühren. </li><li> Deckel Becher mit Saran Wrap und inkubieren für 8-10 h ohne Rühren bei 37 ° C. </li><li> Alle 2 Std., erholen 100 ulDie EDTA-behandelten Plasma auf Eis und bestimmen die PT zum Zeitpunkt der Inkubation mit EDTA und zu vergleichen, um die PT von Plasma vor der EDTA-Zugabe (siehe oben). </li><li> Für die PT Bestimmungen, Ort abnehmbaren 8 gut immunomodule Streifen in Kunststoff Schablonenhalterung und insert into Mikroplatten-Reader. </li><li> Orient immunomodule Streifen in Mikroplatten-Reader als: leer, leer, Probe, leer, leer, Probe, leer und leer von links nach rechts in der Vorlage Inhaber Lichtstreuung Störungen von benachbarten Probe-haltigen Streifen zu minimieren. Außerdem verwende nur Brunnen 2-7 von oben nach unten in jedem 8 gut immunomodule Streifen auf Lichtstreuung Störungen von Kanten aus Kunststoff Schablonenhalterung minimieren. </li><li> Der FV Mikrotiterplatten-Assay ist für die Messung von Fibringerinnselbildung in mindestens 12 verschiedene Proben gleichzeitig (6 Proben pro immunomodule Streifen über 2 immunomodule Streifen). </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette 50 ul HBS (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4)Jede Mikrotitergefäß für jede der zu untersuchenden Probe. Mit einem einzigen Pipette 50 ul des normalen menschlichen gebündelt Referenzplasmas (NHP) oder Plasma vor der Zugabe von EDTA oder an verschiedenen Inkubationszeiten nach Zugabe von EDTA zu Mikrotitervertiefungen trennen. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette 50 ul Thromboplastin (siehe unten Herstellungsverfahren) an alle Mikrotitervertiefungen mit Plasma untersucht werden. Inkubieren in Mikroplatten-Reader bei 25 ° C für 1 min und programmieren Sie die Mikroplatten-Reader, um die Platte während der 15-25 sec des 1 min Inkubation schütteln. </li><li> Mit dem Computer Schnittstelle mit dem Mikroplatten-Reader, den Zugang SoftMax Pro Software Mikroplatten Anwendung. Stellen Sie den Leser auf Absorption, Wellenlänge 405nm, Modus Kinetic, Temperatur bis 25 ° C, und programmieren Sie die Mikroplatten-Reader für 5 sec schütteln, und die Extinktion bei 405 nm alle 5 Sek. für 6 min. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette Calciumchlorid (50 ul von 25 mM in destilliertem Wasser; 2.1mm final Konzentration), um alle Mikrotitervertiefungen, warten Sie 15 Sekunden, und drücken Sie die &#39;Start&#39; Symbol auf der Mikrotiterplatte SoftMax Pro Menü, um den Test zu beginnen. </li><li> Bestimmen Sie die PTs aus der Extinktion gegen die Zeit-Profile in SoftMax Pro, wie die Zeit die Hälfte der maximalen Zunahme der Absorption bei 405nm (Die Mitte der sigmoidal Extinktion gegen die Zeit-Kurve nach Thromboplastin und Calciumchlorid Zusätzlich produziert. Siehe unten zu erreichen, Abbildung 1). </li><li> Berechnen Sie die FV 1-stufig Aktivität aus dem Log Clot Time (sec) vs Log FV Aktivität (Einheiten / ml), wie unten in Abbildung 2A dargestellt. Für die Quantifizierung Zwecke wird 1HE der FV-Aktivität als die Aktivität in 1,0 ml NHP vor vorsätzlichen Aktivierung mit aufgenommen Thrombin (Siehe unten, Assaying menschlichem Blutplasma-Proben mit dem FV 1-stufig und 2-stufiger Mikroplatten Koagulationsanalyse) definiert. </li><li> Planen 4.0l von 20 mM HEPES, enthaltend 0,15 M NaCl in destilliertem Wasser unter leichtem Rühren. Der pH-Wert auf 7,4 mit langsamen dropwise Zugabe von 5.0M NaOH (HBS, pH 7,4). </li><li> Besorgen Sie sich eine ausreichende Länge der Dialyseschlauch und gründlich mit destilliertem Wasser. Einen Knoten in ein Ende des Schlauchs. Transfer EDTA behandelte Plasma in einen Dialyseschlauch mit einem Kunststoff-Pipette, Luft zu entfernen, und binden Sie einen Knoten in das andere Ende des Schlauchs. </li><li> Sorgfältig hängen die EDTA-behandelte Plasma in den Schlauch in die HBS unter leichtem Rühren. Deckel mit Saran Wrap und Dialyse für 14-16h unter leichtem Rühren bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das EDTA-treated/dialyzed Plasma in 3,0 ml Aliquots auf 15,0 ml mit Schraubverschluss Röhrchen und behalten 100 ul für PT-Assay von &#39;final&#39; FV-Mangelplasma auf Eis. Bewahren Sie die FV-Mangelplasma in bei -80 ° C bis zur Verwendung. Unter den oben beschriebenen Bedingungen, die PTs Anstieg von 10 bis 15 Sekunden vor EDTA Neben 90-100 sec 8-10 Stunden nach EDTA-Zugabe. Die FV-Mangelplasma nach dieser Methode hergestellt routinemäßig enthält weniger als 0,1% der aktiven FV im Ausgangsgemischfrisches Humanplasma. </li></ol> 2. Herstellung von Thromboplastin <ol><li> Dialyse gezwungen ist, einen Calcium aus diesem Reagenz zu entfernen, um präzise Timing Fibringerinnselbildung vom Zeitpunkt der Zugabe Calciumchlorid zur Gerinnung einzuleiten gestatten. </li><li> Planen 100 ml und 4.0l von 20mM HEPES und 0,15 M NaCl in destilliertem Wasser in einem Kunststoffbecher unter leichtem Rühren. PH-Einstellung auf 7,4 unter langsamen Zutropfen von 5,0 M NaOH (HBS, pH 7,4). </li><li> Fügen Sie 6,0 ml HBS, pH 7,4 auf jeder Flasche des Thromboplastinreagenz, ersetzen Deckel, und schütteln Sie leicht zu lösen. Inkubieren Reagenz in verschlossenen Ampullen für 15 min bei Raumtemperatur auf getrocknete Material aufzulösen. Leicht schütteln, um sich vollständig aufzulösen. </li><li> Schneiden Sie eine ausreichende Länge der Dialyseschlauch, gründlich mit destilliertem Wasser, und binden Sie ein Ende des Schlauchs mit einem Knoten. Übertragen Thromboplastinzeit einen Dialyseschlauch, Luft zu entfernen, und binden Sie andere Ende des Schlauchs mit einem Knoten. </li><li> Carefully hängen Dialyseschlauch in 4.0l von HBS, pH 7,4 und vorsichtig umrühren bedeckt mit Saran Wrap bei 4 ° C für 14-16 Std. </li><li> Übertragen 3,0 ml Aliquots der dialysierten Thromboplastinzeit bis 15 ml mit Schraubverschluss Röhrchen und bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 3. Vorbereitung der FV 1-stufig Microplate Koagulationsanalyse Activity Norm Curves <ol><li> Auftauen FV-Mangelplasma, NHP, und Thromboplastin bei 37 ° C für 10 min. Vorsichtig mischen FV-Mangelplasma und Thromboplastin unabhängig, Transfer zum Kunststoff-Wasch-Trays zu trennen und auf Eis inkubieren. Bewahren Sie die NHP auf Eis nach vorsichtigem Mischen. Laden Calciumchlorid (25 mM in destilliertem Wasser) in einem separaten Fach Waschen bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten 200 ul jeder der 2-fach serielle Verdünnungen von NHP von 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512-fach in HBS mit pH 7,4 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex gut und auf Eis inkubieren. </li><li> Zeigen abnehmbare 8 gut immunomodule Streifen in plastic Schablonenhalterung und insert into Mikroplatten-Reader. </li><li> Orient immunomodule Streifen in Mikroplatten-Reader als: leer, leer, Probe, leer, leer, Probe, leer und leer von links nach rechts in der Vorlage Inhaber Lichtstreuung Störungen von benachbarten Probe-haltigen Streifen zu minimieren. Außerdem verwende nur Brunnen 2-7 von oben nach unten in jedem 8 gut immunomodule Streifen auf Lichtstreuung Störungen von Kanten aus Kunststoff Schablonenhalterung minimieren. </li><li> Der FV Mikrotiterplatten-Assay ist für die Messung von Fibringerinnselbildung in mindestens 12 verschiedene Proben gleichzeitig (6 Proben pro immunomodule Streifen über 2 immunomodule Streifen). </li><li> Schalten Sie Mikroplatten-Reader und den Zugang SoftMax Pro Mikroplatten Anwendungssoftware. </li><li> Mit einer Mehrkanalpipette machen gleichzeitige Zugabe von FV-Mangelplasma (50 ul) für alle Proben Mikrotitervertiefungen. Verwenden Sie eine einzelne Pipette 50 ul der 10 serielle Verdünnungen von NHP oben, um Mikrotitervertiefungen trennen vorbereitet.</li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette Thromboplastinzeit (50 ul) für alle Probenvertiefungen. Inkubieren im Mikrotiterplattenfotometer bei 25 ° C für 1 min und programmieren Sie die Mikroplatten-Reader, um die Platte während der 15-25 sec des 1 min Inkubation schütteln. </li><li> Mit dem Computer Schnittstelle mit dem Mikroplatten-Reader, den Zugang SoftMax Pro Software Mikroplatten Anwendung. Stellen Sie den Leser auf Absorption, Wellenlänge 405nm, Modus Kinetic, Temperatur bis 25 ° C, und programmieren Sie die Mikroplatten-Reader für die ersten 5 Sekunden nach Calciumchlorid Zusätzlich zu schütteln, und messen die Absorption bei 405nm alle 5 Sek. 6 min danach. Die 5 Sek. Schütteln Intervall wird nicht in den berechneten Gerinnungszeiten USt. (siehe unten). </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette Calciumchlorid (50 ul von 25 mM in destilliertem Wasser; Endkonzentration 3,5 mm) für alle Proben Mikrotitervertiefungen, warten Sie 15 Sekunden, drücken Sie die &#39;Start&#39; Symbol in der Mikroplatten Anwendung in SoftMax Pro vom Computer auf den Beginn Assay. </li><li> Ter Gerinnungszeiten sind als die Zeit in Sekunden, um den Mittelpunkt zwischen dem minimalen und maximalen Absorption bei 405nm erreicht nach Thromboplastin und Calciumchlorid Zusätzlich berechnet. </li><li> Die Anfangsgeschwindigkeiten der Gerinnselbildung sind als die Rate der Zunahme der Absorption bei 405nm (mEinheiten / min), die die ersten fünf Zeitpunkte der Gerinnselbildung in dem linearen Abschnitt der Extinktion in Abhängigkeit von Zeit-Kurve umfasst berechnet. </li><li> Das Ausmaß der Gerinnselbildung wurde als die Differenz zwischen dem maximalen und minimalen Extinktion bei 405nm (Einheiten) während des Ereignisses erreicht Gerinnselbildung ermittelt. </li></ol> 4. Testen Human Plasma-Proben mit dem FV 1-stufig und 2-stufiger Microplate Koagulationsanalyse <ol><li> Auftauen FV-Mangelplasma, NHP, Probe Plasmen und Thromboplastin bei 37 ° C für 10 min. Vorsichtig mischen FV-Mangelplasma und Thromboplastin unabhängig, Transfer zum Kunststoff-ELISA Waschen Schalen zu trennen und auf Eis inkubieren. Bewahren Sie die NHP und Probe Plasmen auf EisNach vorsichtigem Mischen. Laden Calciumchlorid (25 mM in destilliertem Wasser) in einem separaten Fach ELISA Waschen bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten 200 ul jeder der 40-fache Verdünnungen von NHP und Probe Plasmen in HBS, pH 7,4 mit 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex gut und auf Eis inkubieren. </li><li> Legen Sie ein Wechselmedium 8 gut immunomodule Streifen in Kunststoff Schablonenhalterung legen und in Mikroplatten-Reader. </li><li> Alternate leer, leer, Probe, leer, leer, Probe, leer und leer immunomodule Streifen von links nach rechts in der Vorlage Inhaber Lichtstreuung Störungen von benachbarten Probe enthaltenden Streifen zu minimieren. Nur 2-7 Vertiefungen von oben nach unten in jedem immunomodule Streifens an Lichtstreuung Interferenz von Kanten aus Kunststoff Schablonenhalterung minimieren. </li><li> Schalten Sie Mikroplatten-Reader und den Zugang SoftMax Pro Mikroplatten Anwendungssoftware. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette FV-Mangelplasma (50 ul) für alle Proben Mikrotitervertiefungen. Mit einem single Pipette 50 ul 40-fach verdünnte NHP oder Probe Plasmen oben, um Mikrotitervertiefungen trennen vorbereitet. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette Thromboplastinzeit (50 ul) für alle Probenvertiefungen. Inkubieren im Mikrotiterplattenfotometer bei 25 ° C für 1 min und programmieren Sie die Mikroplatten-Reader, um die Platte während der 15-25 sec des 1 min Inkubation schütteln. </li><li> Mit dem Computer Schnittstelle mit dem Mikroplatten-Reader, den Zugang SoftMax Pro Software Mikroplatten Anwendung. Stellen Sie den Leser auf Absorption, Wellenlänge 405nm, Modus Kinetic, Temperatur bis 25 ° C, und programmieren Sie die Mikroplatten-Reader für die ersten 5 Sekunden nach Calciumchlorid Zusätzlich zu schütteln, und messen die Absorption bei 405nm alle 5 Sek. 6 min danach. Die 5 Sek. Schütteln Intervall wird nicht in den berechneten Gerinnungszeiten USt. (siehe unten). </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette Calciumchlorid (50 ul von 25 mM in destilliertem Wasser; 6,25 Endkonzentration) für alle Proben Mikrotitervertiefungen und sofort prESS &#39;Start&#39; Symbol in der Mikroplatten Anwendung in SoftMax Pro vom Computer auf den Test zu beginnen. </li><li> Am Ende des Versuchs, die Zeit bestimmen, Anfangsgeschwindigkeit und das Ausmaß der Gerinnselbildung für 40-fach verdünnten Probe Plasmen NHP und aus der Absorption gegen die Zeit-Profile in SoftMax Pro. </li><li> Unter Berücksichtigung des 40-fachen Verdünnung, verwenden Sie die Gerinnungszeit für jede Probe, um den FV Aktivität in Units / ml aus der FV 1-stufig Aktivität Standardkurve von Log Clot Zeit vs Log FV Activity (2A) zu berechnen. Dies stellt die FV-1 Bühne Aktivität oder dass ohne &quot;absichtlich&quot; Aktivierung durch Thrombin. </li><li> Da FV ist mit dem aktiven Thrombin aktiviert Cofaktor ist FVa 1, eine zweite Assay nach Zugabe und Inkubation mit Thrombin kritischen die genaue Messung der FV 2-stufigen Aktivität einer Plasmaprobe (Mit &quot;absichtlich&quot; Aktivierung durch Thrombin hinzugefügt). </li><li> Für den FV 2-stufigen Test vorzubereiten 200-300 ul gereinigtes Thrombin 18 at 100nM in HBS, pH 7,4 und auf Eis inkubieren. Planen Sie 10 ul verdünnte Thrombin für jede Plasmaprobe verwenden, um mit dem FV 2-stufig Assay getestet werden. </li><li> 120 ul verdünnte der obigen NHP und Probe Plasmen von 40-fach bis 100-fach mit 170 ul HBS, pH 7,4 mit 2,8 Calciumchlorid. Fügen Sie 10 ul Thrombin (10 nM Endkonzentration) zu jeder Probe. Vortex gut mischen und bei 37 ° C inkubieren für 1 min. </li><li> Verdünnen NHP und Probe Plasmen 500-fach durch Zugabe von 400 ul HBS, pH 7,4, Vortex gut, und Assay 50 ul jeder Plasmaprobe in der FV 1-stufig Mikroplattenassay wie oben beschrieben. </li><li> Bestimmen Sie die Gerinnungszeit für NHP und jeder Plasmaprobe aus der Extinktion gegen die Zeit-Profile in SoftMax Pro getestet. Unter Berücksichtigung der 500-fachen Verdünnung, verwenden Sie die Gerinnungszeit für jede Probe, um den FV 2-stufig Aktivität aus dem FV berechnen 1-stufig Standardkurve von Log Clot Zeit vs Log FV-Aktivität (Abbildung 2A). </li><li> Die gesamte FV AktivitätenFV 1-stufig Aktivität - ty kann dann als FV 2-stufig Aktivität berechnet werden. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die kinetische Mikroplatte Assayverfahren skizziert die Entwicklung eines neuartigen, schnelle, kostengünstige und praktische Technik zur Messung von FV Gerinnungsaktivität in Proben von humanem Plasma, das kein (FV 1-Stufen-Test) oder wurden absichtlich mit zugesetzten Thrombin (FV aktiviert 2-Stufen-Test). Der Assay beruht auf einer kinetischen Mikroplattenleser und alle Materialien und Reagenzien erforderlich sind kommerziell erhältlich oder können in-house erfolgen. Der Assay überwacht ständig die Änderung in der Lichtstreuung von Plasma während Fibringerinnsels Formation bei 405nm. Die Mikroplattenassay hat den Vorteil, mit kleinen Plasma Probenvolumina (ul) und ist zugänglich für die Analyse von mehreren Proben gleichzeitig (bis zu 12). Diese Attribute sind Assay vorteilhaft, wenn teure Geräte und Reagenzien verwendet werden (automatische Analysegeräte und Faktor-defizienten Plasmen), nur kleinen Probenvolumina zur Verfügung (Patientenplasmen) oder Analysieren einer großen Anzahl von Proben (Während FV Aufreinigung from Plasma). Die FV Mikroplattenassay hat die zusätzlichen Vorteile, dass es bequem, schnell ist, und erfordert nicht die Isolierung und Reinigung der benötigten Bestandteile. Verglichen mit manueller Dreh-Rohr 3, 4 und automatisierte 5-7 FV-Assays, die gemeldet wurden, hat der FV Mikroplattenassay vergleichbaren Reihe von nützlichen Gerinnungszeiten (25-75 sec) und der entsprechenden FV Ebenen in der Probe (0,5 bis 0,005 Einheiten / ml), und die Empfindlichkeit / Nachweisgrenzen (20-80pM). Im Vergleich zum manuellen Kipp-Rohr FV Assays, die aus einer subjektiven visuellen Beurteilung der Gerinnselbildung 3, 4 leiden erlaubt der FV Mikroplattenassay objektive und quantitative Messung der Gerinnungszeit, Anfangsgeschwindigkeit und das Ausmaß von Fibrin Gerinnselbildung. Verglichen mit automatisierten FV Assays, die von der Pflicht zur teure Analysegeräte und Reagenzien 7.5 leiden, sind die FV Mikroplattenassay Reagenzien und Materialien kostengünstig und alle benötigten Materialien können purcha seinsed kommerziell oder aus in-house. Manuelle Kipp-Rohr 3, 4 und 5-7 automatisierten Assays FV Allgemeinen nur den Zeit bis zur Gerinnselbildung; nicht die Zeit, Anfangsgeschwindigkeit und das Ausmaß von Fibrin Gerinnselbildung, die alle genau spektrophotometrisch mit der Mikroplatte FV-Assay gemessen. Schließlich leiden manuellen Tilt-Rohrs 3,4 und automatisierte 5-7 FV Assays ab nur in der Lage, das FV-Aktivität in Plasmaproben ein zu einer Zeit zu messen, während die FV Mikroplattenassay zugänglich ist, um mit hohem Durchsatz und 12 Proben können Assay gleichzeitig. Die Mikrotiterplatte wurde verwendet, um zu demonstrieren, dass die in 9 FV DIC Patientenplasmen weniger aktiv als in NHP aufgrund einer Kombination von verzögerten Gerinnungszeiten und unteren Anfangsgeschwindigkeiten der Gerinnselbildung in der FV 1-Stufen-Test war. Die ersten Preise der Gerinnselbildung in der FV 2-stufig Assay in den DIC Patientenplasmen wurden nicht von NHP geändert. Die Ausmaße der Gerinnselbildung in der DIC patient Plasmen wurden auch nicht von NHP in der FV 1-stufig und 2-stufiger Assays geändert. Verminderte FV 1-stufig, 2-stufig, und insgesamt Aktivitäten können schon aufgrund der erhöhten FV Verbrauch 19 und / oder Inaktivierung 6 in Übereinstimmung mit anderen Studien, die während der Pathogenese dieser erworbenen Erkrankung des Blutes haben. Angesichts des Umfangs der Gerinnselbildung in den Plasmen DIC war das gleiche wie mit NHP beobachtet, war diese Variable wahrscheinlich eine Folge der Konzentration an Fibrinogen in der FV-Mangelplasma und nicht auf die Eigenschaften der Patientenplasmen verwandt. Die Ergebnisse aus der Mikroplatten-Assay zeigte, dass die Messung von FV-Aktivität in Proben von humanem Plasma kann aus der Zeit und Anfangsgeschwindigkeit der Gerinnselbildung vom FV 1-Stufen-Test und dem Zeitpunkt der Gerinnselbildung und Gesamtaktivität von der FV 2 erhalten werden - Bühne Assay. Es war nicht möglich, quantitative Messung der FV-Aktivität in einer Plasmaprobe erhalten bezogen auf das Ausmaß der Bildung von Blutgerinnseln in tEr FV 1 - und 2-stufiger Assays oder die anfängliche Geschwindigkeit der Gerinnselbildung in der FV 2-stufig Assay. Angesichts alle Reaktionen erreicht etwa den gleichen Umfang der Gerinnselbildung von 0,35 bis 0,45 Einheiten zwischen den Anfangs-Absorption vor und nach der maximalen Absorption Thromboplastin und Calciumchlorid hinaus bedeutet die Messung des Ausmaßes der Gerinnselbildung keine quantitative Beurteilung der FV-Aktivität in einem gegeben Plasmaprobe. Das neuartige Mikroplattenassay finden Einsatz in Forschung und klinischen Einrichtungen zur Messung von FV-Aktivität in Proben von humanem Plasma und Fraktionen während dessen Reinigung aus menschlichen und tierischen Plasmas. Die Mikroplatte Assay verwendet werden, um die Zeit, Anfangsgeschwindigkeit und das Ausmaß der Gerinnselbildung zu messen; Parametern allgemeinen nicht gleichzeitig im manuellen Plane-Rohr Assays und automatisierte Gerinnungsmeßgeräte überwacht. Mit diesen Informationen kann eine vollständige quantitative Bewertung der Beteiligung der FV während der Gerinnselbildung Eventin humanem Plasma als bisher 3-7 berichtet. Diese Information ist besonders wichtig in Forschung und klinische Labors beim Messen signifikanten Veränderungen FV-Aktivität in Proben von Plasma oder mit gereinigten FV oder FVa. Die FV Mikroplatte Assay kann auch verwendet werden, zu charakterisieren und zu messen, die Verbindungen zu aktivieren oder zu inaktivieren, FV und FVa können, messen die FV Aktivität bei Patienten mit einem Risiko für venöse Thrombose als Folge des FV-Leiden-Mutation 20, 21 und um die Aktivität zu überwachen FV während seiner Reinigung aus Plasma. Die FV Mikroplattenassay leicht anpassbar ist, um die Aktivität von jedem Gerinnungsfaktor im extrinsischen, intrinsische oder gemeinsamen Pfad zu messen unter Verwendung der entsprechenden Faktor-Mangelplasma und Initiieren Reagenzien zur Fibrinbildung. Der Test wird unser Verständnis der FV Biochemie durch eine genauere und vollständigere Messung seiner Tätigkeit in Forschung und klinische Labors zu erhöhen. Letztely, werden diese Informationen positiv beeinflussen Umgebungen im Gesundheitswesen durch eine frühere Diagnose und Entwicklung von wirksameren Therapien für Menschen mit Gerinnungsstörungen, wie DIC heimgesucht.

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (Optional) </td></tr><tr><td> Kinetic Mikroplatten-Reader </td><td> Molecular Devices </td><td> Spectra Max 190 </td><td> Softmax PRO 4,3 LS Software </td></tr><tr><td> Normale gepoolten menschlichen Referenzplasmas </td><td> Precision Biologicals </td><td> CCN-10 </td><td></td></tr><tr><td> Trinatriumcitrat </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10242 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10093 </td><td></td></tr><tr><td> FV-defizienten Humanplasma 4 </td><td></td><td></td><td> Aus frischem Humanplasma und in Aliquots bei -70 ° C </td></tr><tr><td> 3 und 60ml Spritzen </td><td> Becton Dickenson </td><td> 309585 und 136898 </td><td></td></tr><tr><td> Schmetterling Gerät </td><td> Vacutainer </td><td> 367251 </td><td> 20 Gauge </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> H-3375 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fischer </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Thromboplastin </td><td> Trinity Biotech </td><td> T1106 </td><td> Dialysierte vs HBS, pH 7,4 und in Aliquots bei -70 ° C </td></tr><tr><td> Calciumchlorid </td><td> Becton Dickenson </td><td> B10070 </td><td></td></tr><tr><td> Humanes Thrombin 15 </td><td></td><td></td><td> Aus Humanplasma; bei -20 ° C in 50% (v / v) Glycerol gelagert. </td></tr><tr><td> Dialysemembran </td><td> Fischer </td><td> 21-152-6 </td><td> 6-8kDa Molekulargewichtsschnitt; 50mm x 3m. </td></tr><tr><td> Schablonenhalterung und abnehmbare 8 Vertiefungen. </td><td> Nunc </td><td> 14-245-63 und 469957 </td><td></td></tr><tr><td> ELISA Waschen Trays </td><td> BioRad </td><td> 224-4872 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und 15 ml mit Schraubverschluss Röhrchen. </td><td> Sarstedt </td><td> 72690 und 62554205 </td><td></td></tr><tr><td> Mehrkanalpipette </td><td> Fischer </td><td> 2703630 </td><td> 8-Kanal-Modell. </td></tr></tbody></table>

measurement of factor v activity in human plasma using a microplate coagulation assay

In Reaktion auf eine Verletzung ist die Blutgerinnung aktiviert und führt zur Erzeugung der Gerinnungszeit Protease, Thrombin. Thrombin spaltet Fibrinogen zu Fibrin bildet eine unlösliche Klumpen, die Blutung stoppt. Faktor V (FV) in seiner aktivierten Form, FVa, ist ein kritischer Cofaktor für die Protease Faktor Xa und Beschleuniger der Thrombinbildung während Fibrin Gerinnselbildung als Teil Prothrombinase 1, 2. Manuelle FV Assays wurden 3, 4 beschrieben, aber sie sind zeitaufwendig und subjektiv. Automatisierte FV Assays wurden beschrieben 5-7, aber der Analysator und Reagenzien sind teuer und in der Regel lediglich die Gerinnungszeit, nicht die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Fibrinbildung. Die Mikrotiterplatte Plattform zur Messung enzymkatalysierten Veranstaltungen wegen der Bequemlichkeit bevorzugt, Zeit, Kosten, kleines Volumen, kontinuierliche Überwachung und High-Throughput-8, 9. Microplate Assays wurden für Gerinnsel-Lyse 10, Thrombozytenaggregation gemeldet11 und Gerinnungsfaktoren 12, jedoch nicht für FV-Aktivität in menschlichem Plasma. Das Ziel des Verfahrens war es, eine Mikroplatten-Assay, der FV-Aktivität misst während der Fibrinbildung in humanem Plasma zu entwickeln. Diese neuartige Mikroplatte Verfahren stellt eine einfache, kostengünstige und rasche Bestimmung von FV-Aktivität in menschlichem Plasma. Der Assay beruht auf einer kinetischen Mikroplattenleser die Extinktionsänderung bei 405 nm während der Fibrinbildung in Humanplasma (Abbildung 1) 13 zu überwachen. Der Assay misst genau die Zeit, Anfangsgeschwindigkeit und das Ausmaß von Fibrin Gerinnselbildung. Es erfordert nur ul Mengen von Plasma ist in 6 min abgeschlossen hat hohem Durchsatz, ist empfindlich gegen 24-80pM FV, und misst die Menge an unbeabsichtigt betätigt (1-stufig Aktivität) und Thrombin-aktivierten FV (2-Stufen-Aktivität ), um eine umfassende Beurteilung des gesamten funktionelle Aktivität (2-stufig Aktivität - 1-Stufen-Aktivität). Disseminierte intravasdere Gerinnung (DIC) ist eine erworbene Gerinnungsstörungen, die am häufigsten entwickelt sich aus bereits bestehenden Infektionen 14. DIC ist mit einer schlechten Prognose und erhöht die Mortalität über dem bereits bestehenden Pathologie 15 zugeordnet. Der Assay wurde verwendet, um zu zeigen, dass in 9 Patienten mit DIC, der FV 1-stufig, 2-stufig, und insgesamt Tätigkeiten verringert wurden, im Durchschnitt um 54%, 44% und 42%, verglichen mit normalen gepoolten menschlichen Referenz-Plasma (NHP). Der FV Mikroplattenassay ist leicht anpassbar an die Tätigkeit jedes Gerinnungsfaktor messen. Dieser Assay wird unser Verständnis der FV Biochemie durch eine genauere und vollständigere Messung seiner Tätigkeit in Forschung und klinischen Umgebungen zu erhöhen. Diese Informationen werden positiv beeinflussen Umgebungen im Gesundheitswesen durch eine frühere Diagnose und Entwicklung von wirksameren Therapien für Gerinnungsstörungen, wie DIC.

Repräsentative Ergebnisse - Vorbereitung der FV 1-stufig Mikroplatten Koagulationsanalyse Aktivität Standardkurven Ein repräsentatives Beispiel eines Fibringerinnsels Formation in der FV-Assay im Zeitablauf mit dem Mikroplattenleser gefertigt ist in Abbildung 1 veranschaulicht. Die FV-Assay misst genau die Zeit, anfängliche Rate und Ausmaß von Fibrin Gerinnselbildung. Inspektion der Brunnen auf Assay Abschluss bestätigt, dass die Bildung von Blutgerinnseln aufgetreten. Alle Reaktionen erreicht etwa den gleichen Umfang der Gerinnselbildung mit einer allgemeinen Extinktionsänderung bei 405 nm von 0,35 bis 0,45 Einheiten zwischen dem Anfangspunkt Extinktion vor und nach der maximalen Absorption Thromboplastin und Calciumchlorid hinaus. Repräsentative Beispiele von FV 1-stufig Aktivität Standardkurven von Log Clot Zeit (in Sekunden) vs Log FV Aktivität (Einheiten / ml) und Log Initial Rate der Gerinnselbildung (in mEinheiten / min) vs Log FV Aktivität (Einheiten / ml ) für serielle Verdünnungen von NHP in gezeigt, <strong&gt; 2A und 2B sind. Montage des Log-Log Grundstück von Clot Zeit vs FV 1-Aktivität zeigte eine starke Beziehung zwischen diesen Variablen nach der linearen Regressionsanalyse (2A, R 2 = 0,980). Montage des Log-Log Plot des Initial Rate der Gerinnselbildung vs FV Aktivität zeigte auch eine starke Beziehung zwischen diesen Variablen nach der linearen Regressionsanalyse (2B; R 2 = 0,983). Die Beziehung der beiden Log Clot Zeit und Log Initial Rate der Gerinnselbildung vs Log FV Aktivität blieb linear für NHP bis zu 512-fach verdünnt. Da FV zirkuliert in NHP bei ca. 40 nM 12-16, ist die Mikroplattenassay empfindlich auf ca. 24-80pM FV in NHP. Da die Dissoziationskonstante der Wechselwirkung FVa-FXa-Lipid in Prothrombinase etwa 1 nM 17 ist, ist der FV Mikroplattenassay durchaus geeignet zur Messung von FV Ebenen im physiologisch relevant nM Bereich für FVa Funktion in Prothrombinase. Mit dem FV Mikroplattenassay wurde auch festgestellt, dass im normalen Bereich der FV-Aktivität in der FV 1-stufig Aktivitätstest von 15 gesunden Kontrollpersonen Plasmen (männlich und weiblich, Alter 18-20yrs) (Mittelwert ± Standardabweichung; Range) war: 0,96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Dies stimmt gut mit der normalen, gesunden FV-Aktivität und Reichweite (0.66-1.14U/ml) von Cutler et al. für den FV 1-stufig Aktivität mit einem automatischen Analysator 7 bestimmt. Die Intra-Assay-Variabilität der Zeit, den Umfang und die anfängliche Rate der Bildung von Blutgerinnseln in der FV 1-stufig Assay in 6 Bohrungen auf 8 verschiedenen Tagen betrug 3,4%, 4,4% und 3,1% betragen. Die Inter-Assay-Variabilität der Zeit, den Umfang und die anfängliche Rate der Bildung von Blutgerinnseln in der FV 1-stufig Assay in 6 Vertiefungen 8 verschiedene Experimente an 8 verschiedenen Tagen betrug 7,1%, 7,8% und 9,2% betragen. Somit ist die Intra-und Inter-Assay-Variabilität dieser drei Messred Variablen war auf einem niedrigen und akzeptablen Niveau für robuste Testleistung innerhalb und zwischen Mikroplattenassay von mehreren Proben gleichzeitig (bis zu 12). Repräsentative Ergebnisse - Assaying menschlichem Blutplasma-Proben mit dem FV 1-stufig und 2-stufiger Mikroplatten Koagulationsanalyse Die Standardkurve von Log Clot Zeit vs Log FV Activity (2A) wurde verwendet, um die FV-Aktivität in NHP und 9 DIC Patientenplasmen, die nicht absichtlich mit zusätzlichen Thrombin (FV 1-stufig Aktivität) wurden aktiviert oder wurden absichtlich mit aktiviertem messen Thrombin zugegeben (FV 2-Stufen-Aktivität) und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Alle 9 DIC Patientenplasmen zeigten FV 1-stufig Aktivitäten und Anfangsgeschwindigkeiten der Gerinnselbildung, die durchschnittlich verringert wurden, um 54% bzw. 18%, bzw. von NHP. Die Ausmaße der Gerinnselbildung in der FV 1-stufig Assay in den DIC Patienten waren nicht groß anders NHP und erhöhte im Durchschnitt um 13% von NHP. <html> Aktivierung des NHP mit Thrombin erzeugt eine ungefähre 8-fachen Anstieg der FV 2-Stufen-Aktivität über dem FV 1-Stufen-Aktivität (Tabelle 1). Dies deutet darauf hin, dass der FV in NHP hauptsächlich in ihrer aktivierten Form war und stimmt mit den zuvor berichteten Ergebnisse mit manuellen Kipp-tube FV Assays 3, 4 und automatisierte FV Assays 5-7. Der FV 2-stufig und Gesamtaktivität wurden auch in den DIC-Patienten im Durchschnitt gesunken, von 44% und 42%, bzw. von NHP. Die ersten Preise und Ausmaß der Gerinnselbildung in der FV 2-stufig Assay in den DIC Patienten waren nicht signifikant verschieden von NHP und variiert im Durchschnitt um ca. 9% und 4%, bzw. von dem mit NHP beobachtet. Diese Ergebnisse zeigten, daß mit dem FV in NHP, der FV in den DIC Patientenplasmen Vergleich in Folge einer verlängerten Zeit und verringerte Rate von Fibrin Gerinnselbildung und dass der Patient FV war durchschnittlich nur 56% als aktivierbare mit Thrombin als auch. ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Gerinnselbildung im normalen gepoolten menschlichen Referenz-Plasma mit der kinetischen Mikrotiterplatten FV 1-stufig Koagulationsanalyse gemessen. Fibringerinnselbildung in NHP wurde kontinuierlich bei 405 nm mit Hilfe eines kinetischen Mikroplatten-Reader überwacht. Die Handlung ist die Mikroplattenleser Ausgang eines 6 min Reaktion von 32-fach verdünnten NHP, FV-Mangelplasma, Thromboplastin und Calciumchlorid in einer Mikrotiterplatte. Die vertikale Achse stellt die Änderung der Absorption bei 405 nm, die als Ergebnis der Fibrinbildung im Plasma aufgetreten ist. Der Zeitpunkt der Fibrinbildung wurde als die Zeit, um die Hälfte der maximalen Erhöhung in der Absorption oder den Mittelpunkt einer Kurve (36,40 sec) erreicht definiert. Die anfängliche Geschwindigkeit der Gerinnselbildung wurde als die Rate der Änderung der Absorption bei 405 nm über die ersten 5 Zeitpunkte des linearen Anstiegs der Absorption Abschnitt der Kurve (611,88 mEinheiten / min) definiert. Der ExZelt der Gerinnselbildung wurde als die Differenz zwischen dem maximalen und minimalen Absorption bei 405 nm (0,35 Einheiten) definiert. <img src="/files/ftp_upload/3822/3822fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Standardkurven von Zeit und anfänglichen Rate von Gerinnselbildung vs Faktor V-Aktivität im normalen gepoolten menschlichen Referenzplasmas mit dem FV 1-stufig Mikroplattenassay. NHP wurde seriell verdünnt (0 - bis 512-fache in HBS) und einem Assay mit dem FV 1-stufig Mikroplattenassay wie im Protokoll beschrieben. Log-Log Plots der Zeit und Anfangsgeschwindigkeit der Gerinnselbildung vs FV Aktivität im FV 1-stufig Mikroplattenassay Nach linearer Regressionsanalyse der Daten in Felder A und B, gezeigt. <table border="1"><tbody><tr><td> Probe </td><td> 1-stufig Assay Aktivität (Einheiten / ml) </td><td> 1-stufig Assay Umfang (Units) </td><td&gt; 1-stufig Assay Initial Rate (mEinheiten / min) </td><td> 2-stufige Assay Aktivität (Einheiten / ml) </td><td> 2-stufige Assay Umfang (Units) </td><td> 2-stufige Assay Initial Rate (mEinheiten / min) </td><td> Insgesamt Aktivität (Einheiten / ml) </td></tr><tr><td> NHP </td><td> 1,02 </td><td> 0,363 </td><td> 744,96 </td><td> 7,93 </td><td> 0,433 </td><td> 375,84 </td><td> 6,91 </td></tr><tr><td> Patient 1 </td><td> 0,36 </td><td> 0,404 </td><td> 583,80 </td><td> 3,84 </td><td> 0,432 </td><td> 249,96 </td><td> 3,48 </td></tr><tr><td> Patient 2 </td><td> 0,67 </td><td> 0,416 </td><td> 704,04 </td><td> 5,28 </td><td> 0,469 </td><td> 323,16 </td><td> 4,61 </td></tr><tr><td><strong&gt; Patient 3 </td><td> 0,31 </td><td> 0,435 </td><td> 562,08 </td><td> 3,92 </td><td> 0,453 </td><td> 294,96 </td><td> 3,61 </td></tr><tr><td> Patient 4 </td><td> 0,39 </td><td> 0,435 </td><td> 617,04 </td><td> 4,14 </td><td> 0,462 </td><td> 372,60 </td><td> 3,75 </td></tr><tr><td> Patient 5 </td><td> 0,73 </td><td> 0,401 </td><td> 641,40 </td><td> 5,91 </td><td> 0,433 </td><td> 354,24 </td><td> 5,18 </td></tr><tr><td> Patient 6 </td><td> 0,45 </td><td> 0,403 </td><td> 600,72 </td><td> 4,16 </td><td> 0,445 </td><td> 393,96 </td><td> 3,71 </td></tr><tr><td> Patient 7 </td><td> 0,49 </td><td> 0,395 </td><td> 575,40 </td><td> 4,89 </td><td> 0,449 </td><td> 357,48 </td><td> 4,40 </td></tr><tr><td> Patienten 8 </td><td> 0,19 </td><td> 0,448 </td><td> 489,00 </td><td> 2,89 </td><td> 0,450 </td><td> 330,48 </td><td> 2,70 </td></tr><tr><td> Patienten 9 </td><td> 0,64 </td><td> 0,423 </td><td> 699,48 </td><td> 5,11 </td><td> 0,455 </td><td> 417,24 </td><td> 4,47 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 FV Activity in NHP und in 9 Patienten, die disseminierte intravasale Gerinnung (DIC) entwickelt. Die FV 1-stufig, 2-stufig, und Gesamtaktivität in NHP und 9 DIC Patientenplasmen wurden aus dem FV 1-stufig Mikroplattenassay Standard bestimmt Kurve der Zeit der Gerinnungsbildung vs FV Aktivität (2A) und sind in Einheiten / ml angegeben. Die ersten Preise (Initial Zuwachsrate in A405nm über die ersten fünf Zeitpunkten in mEinheiten / min) und Extents (Maximum A405nm - Minimum A405nm) der Gerinnselbildung in der FV 1 - und 2-stufiger Mikroplattenassay sind ebenfalls gezeigt.

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Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Diese Studie beschreibt eine neue Mikrotiterplatte Assay, FV Gerinnungsaktivität misst während Fibrin Gerinnselbildung in Humanplasma, die zuvor noch nicht gemeldet. Das Verfahren verwendet eine kinetische Mikroplattenleser das kontinuierliche Messen der Änderung der Absorption bei 405 nm während Fibrin Gerinnselbildung in humanem Plasma.

Messung der Faktor V-Aktivität in humanem Plasma unter Verwendung eines Mikroplatten Koagulationsanalyse

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

measurement-factor-v-activity-human-plasma-using-microplate

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.9K Aufrufe.  University of Ontario Institute of Technology. Diese Studie beschreibt eine neue Mikrotiterplatte Assay, FV Gerinnungsaktivität misst während Fibrin Gerinnselbildung in Humanplasma, die zuvor noch nicht gemeldet. Das Verfahren verwendet eine kinetische Mikroplattenleser das kontinuierliche Messen der Änderung der Absorption bei 405 nm während Fibrin Gerinnselbildung in humanem Plasma.

Serie: Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

Ein Calcium Biolumineszenzassay für die funktionelle Analyse von Mosquito ( Aedes aegypti) Und Tick ( Rhipicephalus microplus) G-Protein gekoppelten Rezeptoren

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen der Moskitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Ein Mikroplatten Assay Chemical Auswirkungen auf die RBL-2H3 Mastzelldegranulation bewerten: Effekte von Triclosan ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

Aktivierung und Messung der NLRP3 Inflammasom Aktivität mit IL-1β in humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Messung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...