Diese Arbeit wurde durch Grant R01NS062842 vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health (VVD) und durch Zuschüsse R21 NS064403 vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health durch ARRA (VVD) und R21 unterstützt EB006301 National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health (VVD).

Die Abschnitte für die molekulare Maschine-basierte Erkennung sollten zunächst vorbereitet werden, weil ihre Vorbereitung nimmt mehr Zeit als die Montage der molekularen Gerät. Das Konstrukt funktioniert gut mit 5-6μm dicke Abschnitte aus Paraformaldehyd-fixierte, in Paraffin eingebettetes Gewebe Blöcke geschnitten. Verwenden Sie schieben Marken, die Abschnitte zu halten und, wie ProbeOn Plus-geladen und vorgereinigte Objektträger (Fisher Scientific) oder ähnliches. Wir empfehlen zunächst mit einem Gewebe mit einem bekannten Muster von DNA-Schäden, die sowohl DNase I-und DNase II-Typ Pausen enthält, wie zB Dexamethason behandelten apoptotischen Ratte Thymus 13,14. 1. Vorbereitung von Abschnitten <ol><li> Setzen Sie die Teile in einen Objektträger-Rack und Entwachsen in Xylol für 15 min, ein frisches Xylol Bad für weitere 5 Minuten übertragen. </li><li> Rehydrieren, indem sie durch abgestufte Ethanolkonzentrationen: 96% Ethanol-2x5min, 80% Ethanol - 5min, Wasser - 2x5 min. </li><li> Digest Abschnitt mit Proteinase K. Mit 100 &amp;mgr; eines 50μg/mL Lösung pro Abschnitt. Inkubieren 15 &#39;bei Raumtemperatur (23 ° C) in einer feuchten Kammer. Die Zeit muss möglicherweise angepasst werden je nach Gewebetyp. Hartgewebe erfordert möglicherweise mehr Aufschluss. Times of 15-25 min sind in der Regel verwendet. Unzureichende Verdauung kann das schwächere Signal führen. Overdigestion auf der anderen Seite ergibt Signal Verschwinden und Abschnitt Störung. </li><li> Spülen in destilliertem Wasser für 2x10 min. </li><li> Apply 100 ul pro Abschnitt 2% BSA für Vorblockierung. Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur (23 ° C). Während dieser Zeit versammeln die molekulare Maschine. </li></ol> 2. Molekulare Maschinen Montage Alle Reagenzien sind für 25 ul Gesamtvolumen, das reicht für einen einzigen Nachweis in einer durchschnittlichen Größe Gewebeschnitt (10x10mm) skaliert wird. Die Lautstärke kann skaliert werden, wie gebraucht. <ol><li> Kombinieren Sie in einem kleinen Plastikschlauch in dieser Reihenfolge: </li></ol><table border="1"><tbody> &lt;tr&gt; <td><ol><li> Bidestilliertem Wasser; </li><li> 15% Polyethylenglykol-8000; </li><li> Lösung von 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM Dithioerythrit, 1 mM ATP, (dh für regelmäßige T4 DNA-Ligase-Puffer); </li><li> 70 pmol Oligonukleotid 1, </li><li> 215 pmol (1,76 bis 7,1 ug) VACC TOPO </li><li> 10 Einheiten T4 DNA-Ligase (500 U / mL) </li></ol></td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Vorsichtig mischen. Die molekulare fast sofort selbst montiert Konstrukt in diese Lösung und kann sofort bei Raumtemperatur (23 ° C) verwendet werden. Eine Erhöhung der Temperatur auf 37 ° C blockiert die T4 DNA-Ligase-basierte Komponente der Etikettierung. </li></ol> 3. Mit molekularen Maschinen in Gewebeschnitten zu dual label 5&#39;OH und 5&#39;PO4 DNA-Brüche <ol><li> Saugen Sie das Vorblockierung Lösung und gelten 25 &amp;mgr; l des gesamten Reaktionsmischung mit 70 pmol Oligonukleotid 1, 53 bis 215 pmol (1,76 bis 7,1 ug) VACCTOPO und 10 Einheiten T4 DNA-Ligase (500 U / ml) in einer Lösung von 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM Dithioerythrit, 1 mM ATP und 15% Polyethylenglykol-8000. Die gleiche Sequenz Oligonukleotid Durchführung einer FITC-Label, Oligonukleotid-2, kann stattdessen für den Nachweis von einer einzigen Art von DNA-Brüchen verwendet werden. In einem solchen Fall auslassen Ligase von der Kennzeichnungspflicht Reaktion. Auch in dieser Situation eine Lösung von 50 mM Tris-HCL, pH 7,4, 15% PEG-8000 kann anstelle von T4 DNA-Ligase-Puffer verwendet werden. </li><li> Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur (23 ° C) in einer feuchten Kammer mit einem Kunststoff-Deckglas. Vor Licht schützen. Die Absenkung der Temperatur auf 16 ° C reduziert die Ligase-basierte Signal, die Temperatur zu erhöhen, um 37 ° C vollständig eliminiert die Ligase-basierte Signal. Eine partielle Hemmung der Ligase tritt manchmal in der Reaktionsmischung, die möglicherweise durch Verunreinigungen mit Topoisomerase Präparate eingeführt. Daher könnte längere Inkubationszeit (2-4 Stunden) benötigt werden, besonders wenn significant Zahl der Ligase-markierten Pausen vorhanden sind. Obwohl beide Ligase und topo-Signale in dieser Phase beobachtet werden kann, in vielen Fällen die Ligase-Signal weiter verbessert werden kann durch wiederholtes Auftragen des Reaktionsgemisches ohne VACC TOPO-und Dual-Oligonukleotid, aber mit einer Haarnadel geformt Oligonukleotid (Oligonukleotid 3) (35 mg / mL) und T4 DNA-Ligase (250 U / mL). Zur Verbesserung der Signal mit Schritt 3 fortfahren, um die Reaktion ohne Vergrößerung zu sehen fahren Sie mit Schritt 5 fort. </li><li> Entfernen Deckgläser durch leichtes Eintauchen der Objektträger vertikal in einer Coplin Gefäß mit Wasser bei Raumtemperatur. Saugen Sie überschüssiges Wasser. </li><li> Enhance-Ligase-Signal, indem 25 ul Reaktionsansatz ohne VACC TOPO und Oligonukleotid-1, aber mit Oligonukleotid-3: 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM Dithioerythrit, 1 mM ATP und 15% Polyethylenglykol- 8000, 5 Einheiten T4 DNA-Ligase, 35 mg / ml Oligonukleotid 3 (mit stumpfen Enden Haarnadel). Das Gesamtvolumen der Kennzeichnung Lösung can skaliert werden, um die größeren Abschnitte aufzunehmen. Inkubieren für 18 h (über Nacht) bei Raumtemperatur (23 ° C) in einer feuchten Kammer mit einem Kunststoff-Deckglas. </li><li> Entfernen Deckgläser durch leichtes Eintauchen der Objektträger vertikal in Coplin Gefäß mit Wasser bei Raumtemperatur. Dann waschen Abschnitt 3x10 min in destilliertem Wasser. </li><li> Spülen mit Natrium-Bicarbonat-Puffer. Alkalischer Lösung spülen verbessert FITC Fluoreszenz, die pH-sensitiv ist und liegt deutlich unter pH 7 reduziert. </li><li> Abdeckprofil mit einem Antifading Lösung (Vectashield mit DAPI), Deckglas und zu analysieren, das Signal mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops. Doppelstrang-DNA bricht mit 5&#39;OH fluoreszieren grün, 5&#39;PO 4 Pausen - fluoreszieren rot (Abbildung 2). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig2.jpg" /> Abbildung 1. Semi-künstliche molekulare Maschine erkennt zwei Arten vonDNA-Schäden in situ. Die fluoreszierenden Maschine selbst montiert, wenn VACC TOPO bindet sich an die Doppel-Haarnadel 32-mer. Die Maschine beginnt den Betrieb durch die Spaltung von selbst in zwei Detektor-Einheiten über Topoisomerase-made Schnitt am 3 &#39;Ende der Erkennungssequenz. Daraus ergibt sich ein zyklischer Prozess, bei dem FITC-markierten Einheit trennt kontinuierlich und religates zurück zu den Rhodamin-markierten Einheit. Dieser bleibt bestehen, bis eine nachweisbare DNA-Bruch aufgetreten ist. Wenn eine solche Alternative Akzeptor (5&#39;OH stumpfen Ende DNA Pause) im Gewebeschnitt wird, wird die FITC Teil, um es zu unterbinden. Die restlichen Rhodamin Teil wird 5 &#39;PO 4 DNA stumpfen Ende bricht mit Hilfe der T4 DNA-Ligase zu befestigen. Folglich sind beide Arten von DNA-Brüchen gleichzeitig detektiert. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig1.jpg" /> Abbildung 2. Molekulare Maschine Dual-Etiketten zwei Arten von DNA-Brüchenin einem Gewebe Abschnitt Dexamethason behandelten Thymus. Blunt-ended DNA-Brüche von DNase I-und DNase II-Typs sind in der Thymus-kortikalen Arealen Apoptose nachgewiesen werden. Grüne zytoplasmatischen Fluoreszenz (5&#39;OH DNA-Brüche) markiert kortikalen Makrophagen verdauen Kernmaterial von apoptotischen Thymozyten. Dieses Signal wird von VACC TOPO produziert, und lokalisiert zu Phagolysosomen mit DNA enthält 5&#39;OH Doppelstrang-Brüche 11,12. Red-Fluoreszenz (5&#39;PO 4 Pausen) Etiketten Kerne von apoptotischen Thymozyten nicht durch Makrophagen verschlungen. Massive Zahl von Thymozyten gleichzeitig Apoptose durch Erzeugung von 5&#39;PO 4 Doppel-Strangbrüchen begleitet, visualisiert durch Ligase-basierte Kennzeichnung. Diese Brüche sind an der nuklearen Peripherie gelegen, bildet ringförmige Muster. Alle Zellkerne werden visualisiert durch Gegenfärbung mit DAPI (blaue Fluoreszenz).

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Video zeigen wir, wie zu montieren und ein Dual-Kennzeichnung DNA-Schäden Sensor. Der Sensor ist eine molekulare Maschine durch bio-molekularen Motor, ein Virus-kodierte Protein VACC TOPO mit künstlichen Komponenten verbunden angetrieben. Die vorgestellte Entwicklung beispielhaft für eine bio-fähigen Ansatz, der die Anpassung biologischer Strukturen, Architekturen und tatsächlichen Teile und Komponenten von Zellen Fürsprecher der Gestaltung von ungiftigen molekularen Skala Geräte 12,15. Dieser Ansatz behebt zwei Probleme inhärent auf dem Gebiet der in-vivo Nanosensoren: 1. der Schwierigkeit, wirklich gleichmäßige und reproduzierbare Nano-Konstrukte mit traditionellen Nanomaterialien und 2. die potenzielle Toxizität und hohe biologische Reaktivität von Nanosonden, Partikel und andere hochdisperse Nanomaterialien. Der Sensor integriert eine natürlich vorkommende molekulare Maschine mit künstlichen Komponenten, die re-direct es um eine neue Funktion von DNA-Schäden Kennzeichnung. Das Produkt einer solchen Integration ist ein semi-künstliche molekulare Maschine, um eine neue Aufgabe ausgerichtet. Während Topoisomerasen, Polymerasen und andere enzymatische Maschinen häufig in der biochemischen Forschung verwendet werden, sind sie nicht mit technischen Komponenten in einzelne molekulare Baugruppen integriert. Folglich in ihrer Routine zu verwenden, werden sie nicht als semi-künstlichen Vorrichtungen 12 eingesetzt. Hier zeigen wir, wie man den Sensor in das Gewebe Abschnitt Format für die gleichzeitige Kennzeichnung von DNase I-und DNase II-Typ bricht. Derzeit gibt es keine anderen Methoden zur Verfügung, wie simultanes Dual-Erkennung durchführen. DNase I-und DNase II-Typ Pausen sind wichtige Marker für Zelltod Progression, speziell die Kennzeichnung der apoptotischen selbst autonom und phagocytic Phasen 11,16. Der Sensor ist eine sinnvolle Ergänzung der biomedizinischen Forschung Arsenal Umgang mit der Erkennung und detaillierte Charakterisierung von Apoptose.

<ol><li> Xylol </li><li> 80 und 96% Ethanol. </li><li> 2% ige Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) in destilliertem Wasser. </li><li> Oligonukleotid 1: Doppel-Haarnadel, dual mit Fluorescein und Tetramethylrhodamin gekennzeichnet: </li></ol> 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT R AT GCG TT-3 &#39;; F - FITC-dT; R - Tetramethylrhodamine-dT. Andere rotverschoben Fluorophore wie BODIPY TR, Rhodamin oder TAMRA kann anstelle von Tetramethylrhodamin als R verwendet werden. Alternativ können Sie Oligonukleotid 2 -. Doppel-Haarnadel Einzelzimmer mit Fluorescein (für den Nachweis von einer einzigen Art von DNA-Brüchen (DNase II-Typ) Die Einzel-Fluorophor-tragenden Sonde ist wesentlich billiger und ist praktisch, wenn ein einzelnes Art der DNA brechen, um zu kennzeichnen: 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3 &#39;; F - FITC-dT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonucleotid 3. Blunt-ended rhodaminmarkierten Haarnadel für die Verbesserung der in-situ-Ligation Signal mit T4 DNA-Ligase: 5&#39;-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3 &#39;; R - Tetramethylrhodamine-dT </li><li> Vaccinia DNA Topoisomerase l (VACC TOPO) - 3000 U / ul (Vivid Technologies). In den ersten Versuchen verwendeten wir 215 pmol (7,1 ug) der VACC TOPO pro jede 25 ul des Reaktionsgemisches. Allerdings kann die Topoisomerase-Konzentration deutlich, ohne den Verlust der Empfindlichkeit reduziert werden. Wir haben später benutzte eine viermal geringere Menge an VACC TOPO pro Abschnitt (1,76 mg in 25 ul der Reaktionsmischung pro Abschnitt) mit ähnlichen Ergebnissen. Reduzierung der Menge des Enzyms bis 880 ng (in 25 ul der Reaktion mix) führte ein schwächeres Signal und 8,8 ng VACC TOPO produziert keine nachweisbaren Signal. </li><li> T4 DNA-Ligase 5 U / ul (Roche). Dieses hochkonzentrierte Ligase Vorbereitung gibt das beste Signal in unseren experimentellen Bedingungen. </li&gt; <li> 10 x Reaktionspuffer für T4 DNA-Ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 mM Dithioerythrit, 10 mM ATP, pH 7,5 (20 ° C) (Roche). ATP in Reaktionspuffer ist einfach in sich wiederholenden Zyklen Auftauen Einfrieren zerstört. Aliquot der Puffer in kleinen 15-20 ul Portionen und bei - 20 ° C einmal verwenden. </li><li> 30% (w / v) Lösung von PEG-8000 (Sigma) in zweifach destilliertem Wasser. 15% PEG-8000 in der Reaktionsmischung stark stimuliert die Erkennung, die Erhöhung der effektiven Konzentrationen der Bestandteile Vol. Ausgrenzung. </li><li> Proteinase K (Roche) 20 mg / ml Stammlösung in destilliertem Wasser. Lagerung bei - 20 ° C. Bei der Reaktion verwenden 50mg/ml Lösung in PBS, aus dem Lager vorbereitet. Dürfen nicht wiederverwendet werden. </li><li> Vectashield mit DAPI (Vector Laboratories). </li><li> Natriumbicarbonatpuffer: 50m M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8,2. </li><li> 22x22mm oder 22x40mm Glas oder Kunststoff Deckgläser. Plastic Deckgläser sind während der Reaktion vorzuziehen, da sie einere leichter aus dem Abschnitt zu entfernen. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

Natürlich vorkommende bio-molekulare Maschinen arbeiten in jeder lebenden Zelle und zeigt eine Vielzahl von Designs 1-6. Doch die Entwicklung von künstlichen molekularen Maschinen konzentriert sich auf Geräte, die gerichtete Bewegung, dh molekularen Motoren, und auf deren abgespeckte mechanische Teile (Räder, Achsen, Anhänger usw.) 7-9. Dies ahmt die Makro-Maschinen, auch wenn die physikalischen Eigenschaften essentiell für diese Geräte, wie Trägheit und Impulserhaltung, nicht verwendbar sind in der Nanowelt Umgebungen 10. Alternative Entwürfe, die sich nicht an die mechanische macromachines Systeme und Einsatz von Mechanismen in der Evolution von biologischen Molekülen entwickelt, können die Vorteile der spezifischen Bedingungen der Nanowelt zu nehmen. Außerdem Anpassung tatsächlichen biologischen Molekülen für die Zwecke der Nano-Design reduziert mögliche Gefahren der Nanotechnologie-Produkte darstellen können. Hier zeigen wir die Montage und Anwendung eines solchen Bio-fähigen konstruieren, wieemi-künstlichen molekularen Gerät, das ein natürlich vorkommendes molekulare Maschine kombiniert mit künstlichen Komponenten. Von der Enzymologie Sicht ist unser Bau eines Designer-Fluoreszenz-Enzym-Substrat-Komplex zusammen, um eine bestimmte nützliche Funktion zu erfüllen. Diese Versammlung ist per Definition eine molekulare Maschine, wie es ein 12 enthält. Doch die Integration mit dem entwickelten Teil - leitet wieder an eine neue Aufgabe, Kennzeichnung DNA-Schäden 12 - Leuchtstofflampen zwei Haarnadel. Unsere Konstruktion montiert aus einem 32-mer DNA und ein Enzym Vaccinia-Topoisomerase I (VACC TOPO). Die Maschine nutzt dann sein eigenes Material zu zwei fluoreszenzmarkierten Detektor-Einheiten (Abbildung 1) zu fertigen. Eine der Einheiten (grüne Fluoreszenz) führt VACC TOPO kovalent an seiner 3&#39;-Ende und eine andere Einheit (rote Fluoreszenz) befestigt ist ein kostenloser Haarnadel mit einem Terminal 3&#39;OH. Die Geräte sind kurzlebig und schnell wieder zusammenbauen in den ursprünglichen Bau, der anschließend recleaves.In Abwesenheit von DNA-Brüchen dieser beiden Einheiten kontinuierlich zu trennen und religate in zyklischer Weise. In Gewebeschnitten mit DNA-Schäden, die Topoisomerase-tragenden Detektoreinheit selektiv beimisst blunt-ended DNA-Brüchen mit 5&#39;OH (DNase II-Typ Pausen) 11,12, Fluoreszenzmarkierung sie. Das zweite Enzym-freien Haarnadel nach Oligonukleotid-Spaltung gebildet wird, eine 5&#39;PO 4 blunt-ended break (DNase I-Typ Pausen) 11,12 ligieren, wenn T4 DNA-Ligase ist in der Lösung vorhanden 13,14. Wenn T4 DNA-Ligase zu einem Gewebeschnitt oder einer Lösung mit DNA mit 5&#39;PO 4 blunt-ended Pausen hinzugefügt wird, reagiert der Ligase mit 5&#39;PO 4 DNA Enden, bilden semi-stabilen Enzym-DNA-Komplexe. Die stumpfen Enden Haarnadeln wird mit diesen Komplexen freigesetzt Ligase und kovalente Verknüpfung Haarnadeln, um DNA interagieren, damit die Kennzeichnung 5&#39;PO 4 blunt-ended DNA-Brüche. Diese Entwicklung verdeutlicht eine neue praktische Annäherung an the-Design von molekularen Maschinen und bietet einen nützlichen Sensor zur Detektion von Apoptose und DNA-Schäden in fixierten Zellen und Geweben.

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Wir zeigen die Montage und Anwendung eines molekularen Maßstab Gerät durch eine Topoisomerase Protein versorgt. Das Konstrukt ist ein bio-molekularen Sensor, der im Wesentlichen zwei Arten von DNA-Brüchen in Gewebeschnitten Etiketten durch Anbringen von zwei unterschiedlichen Fluorophoren an ihren Enden.

In-vitro-Assembly von Semi-künstliche molekulare Maschine und ihre Verwendung zum Nachweis von DNA-Schäden

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

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Nanyang Technological University

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Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

11.5K Aufrufe.  Baylor College of Medicine. Wir zeigen die Montage und Anwendung eines molekularen Maßstab Gerät durch eine Topoisomerase Protein versorgt. Das Konstrukt ist ein bio-molekularen Sensor, der im Wesentlichen zwei Arten von DNA-Brüchen in Gewebeschnitten Etiketten durch Anbringen von zwei unterschiedlichen Fluorophoren an ihren Enden.

Serie: In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Falten und Charakterisierung eines Bio-responsive Robot von DNA-Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Forschung

Chemie

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of programmed DNA breaks in lymphocytes. The Ataxia-Telangiectasia Mutated kinase (ATM), ATM- and Rad3-Related kinase (ATR) and the catalytic subunit of DNA-dependent Protein Kinase (DNA-PKcs) are among the first that are activated upon induction of DNA damage, and are central regulators of a network that controls DNA repair, apoptosis and cell survival. As part of a tumor-suppressive pathway, ATM and ATR activate p53 through phosphorylation, thereby regulating the transcriptional activity of p53. DNA damage also results in the formation of so-called ionizing radiation-induced foci (IRIF) that represent complexes of DNA damage sensor and repair proteins that accumulate at the sites of DNA damage, which are visualized by fluorescence microscopy. Co-localization of proteins in IRIFs, however, does not necessarily imply direct protein-protein interactions, as the resolution of fluorescence microscopy is limited. 
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is a novel technique that allows the direct visualization of protein-protein interactions in cells and tissues with unprecedented specificity and sensitivity. This technique is based on the spatial proximity of specific antibodies binding to the proteins of interest. When the interrogated proteins are within ~40 nm an amplification reaction is triggered by oligonucleotides that are conjugated to the antibodies, and the amplification product is visualized by fluorescent labeling, yielding a signal that corresponds to the subcellular location of the interacting proteins. Using the established functional interaction between ATM and p53 as an example, it is demonstrated here how PLA can be used in suspension cell cultures to study the direct interactions between proteins that are integral parts of the DNA damage response.

Here, it is demonstrated how the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) can be used to detect and visualize the direct protein-protein interactions between ATM and p53 in suspension cell cultures exposed to genotoxic stress.

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Biochemie

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

Die Selbstorganisation von Complex zweidimensionale Formen von Einzelstrang-DNA-Fliesen

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in parallel computing2,3 , recognize and bind molecular or cellular targets4,5 , catalyze chemical reactions6,7 , and generate calculated responses in a biological system8,9. Importantly, nucleic acids can be programmed to self-assemble into 2D and 3D structures10-12, enabling the integration of all these remarkable features in a single robot linking the sensing of biological cues to a preset response in order to exert a desired effect.
Creating shapes from nucleic acids was first proposed by Seeman13, and several variations on this theme have since been realized using various techniques11,12,14,15 . However, the most significant is perhaps the one proposed by Rothemund, termed scaffolded DNA origami16. In this technique, the folding of a long (&gt;7,000 bases) single-stranded DNA 'scaffold' is directed to a desired shape by hundreds of short complementary strands termed 'staples'. Folding is carried out by temperature annealing ramp. This technique was successfully demonstrated in the creation of a diverse array of 2D shapes with remarkable precision and robustness. DNA origami was later extended to 3D as well17,18 .
 
The current paper will focus on the caDNAno 2.0 software19 developed by Douglas and colleagues. caDNAno is a robust, user-friendly CAD tool enabling the design of 2D and 3D DNA origami shapes with versatile features. The design process relies on a systematic and accurate abstraction scheme for DNA structures, making it relatively straightforward and efficient.
In this paper we demonstrate the design of a DNA origami nanorobot that has been recently described20. This robot is 'robotic' in the sense that it links sensing to actuation, in order to perform a task. We explain how various sensing schemes can be integrated into the structure, and how this can be relayed to a desired effect. Finally we use Cando21 to simulate the mechanical properties of the designed shape. The concept we discuss can be adapted to multiple tasks and settings.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here, we describe how DNA origami can be utilized to design a robotic robot capable of sensing biological cues and responding by shape shifting, subsequently relayed to a desired effect.

Entwerfen einer Bio-responsive Robot von DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

Biotechnik

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genetik

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

<meta charset="utf8"></head><body>Präzisions-DNAzyme-Nanomaschinen für die diskriminative RNA- und DNA-Analyse

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei DNA-Nanosensoren – Bewältigung der Herausforderungen bei Empfindlichkeit und Selektivität beim molekularen Nachweis

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m resolution, show great potential in various fields of nanotechnology such as the molecular reactors, drug delivery, and nanoplasmonic systems. The reconfigurable DNA accordion rack, which can collectively manipulate a 2D or 3D nanoscale network of elements, in multiple stages in response to the DNA inputs, is described. The platform has potential to increase the number of elements that DNA nanomachines can control from a few elements to a network scale with multiple stages of reconfiguration.
In this protocol, we describe the entire experimental process of the reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes. The protocol includes a design rule and simulation procedure of the structures and a wet-lab experiment for synthesis and reconfiguration. In addition, analysis of the structure using TEM (transmission electron microscopy) and FRET (fluorescence resonance energy transfer) is included in the protocol. The novel design and simulation methods covered in this protocol will assist researchers to use the DNA accordion rack for further applications.

We describe the detailed protocol for design, simulation, wet-lab experiments, and analysis for a reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes.

Design und Synthese eines rekonfigurierbaren DNA-Akkordeon-Racks

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

In-vitro-Assembly von Semi-künstliche molekulare Maschine und ihre Verwendung zum Nachweis von DNA-Schäden

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Falten und Charakterisierung eines Bio-responsive Robot von DNA-Origami

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

Die Selbstorganisation von Complex zweidimensionale Formen von Einzelstrang-DNA-Fliesen

Entwerfen einer Bio-responsive Robot von DNA Origami

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

Design und Synthese eines rekonfigurierbaren DNA-Akkordeon-Racks