Diese Studie wurde zum Teil durch die Regierung von Victoria ist OIS Programm, das National Health and Medical Research Council of Australia Programm-und Projektmanagement Zuschüsse (JPF Chin-Dusting) und Postgraduate-Stipendium (D Michell) unterstützt.

1. Isolating Halsschlagadern <ol><li> Euthanase10 Wochen alte Sprague Dawley Ratten über CO 2 / O 2 Ersticken. </li><li> Excise links und rechts Arteria carotis communis mit Aorta und Herz sicherzustellen minimal Dehnung der Gefäße. </li><li> In eiskalten Krebs-Puffer trennen die Halsschlagadern aus der Aorta und Herz und führen in der Nähe Dissektion. </li><li> Halten Sie isolierten Gefäßen in Krebs auf Eis vor der Montage. </li></ol> Ca. Zeit = 45 Minuten 2. Priming des Schiffes Kammer <ol><li> An der proximalen und distalen Anschlüsse des Schiffes Kammer bündig Krebs-Puffer bei einem physiologischen pH durch Infusion Carbogen Gas (95% O 2, 5% CO 2) aufrechterhalten durch den Puffer bei 37 ° C. </li><li> Stellen Sie sicher, Schläuche und Kanülen sind komplett gespült und ausgerichtet sind. </li><li> Flush Kreb-Puffer durch das P1 (proximal) und P2 (distalen) Wandler. Close Hähne keine Luftblasen in den Wandlern zu gewährleisten. </li><li> Schließen Sie die Sensoren an den entsprechenden Anschlüssen und wieder bündig mehr Krebs-Puffer gewährleistet keine Luftblasen. Close abgreift, um die Kammer. </li></ol> Ca. Zeit = 15 Minuten 3. Durch das Aufdrücken des Schiffes Kammer <ol><li> Schalten Sie Druckgeräte: Druck Servo-, Druck-Monitor, Schlauchpumpe (Abbildung 1). </li><li> Mit der Schlauchpumpe auf Druck und der Druck auf Servo automatisch ablaufenden Krebs-Puffer durch den Schlauch bei 20 mmHg (Zifferblatt bei 1), sodass keine Luftblasen. </li><li> Die Leitungen zu den geschlossenen P2 Wandler. Der Druck wird sich stabilisieren. </li><li> Öffnen P2 tippen, um das Schiff Kammer zu spülen, keine Blasen schließen Sie dann ab. </li><li> Füllen Sie das Bad mit Krebs-Puffer (5 bis 7 mL). </li></ol> Ca. Zeit = 10 Minuten 4. Montage des Schiffes <ol><li> Unter einem Binokular statt schwarzem Polyester Bande auf jede Kanüle (Abbildung 2). </li><li> Bewegen Sie Kanülen und Kanüle Inhaber auseinander und montieren ¼ Gefäß (Aortenbogen Ende) auf die P1 Kanüle. Stellen Sie sicher nicht, das Schiff zu reißen. </li><li> Mit einer Spritze mit Krebs-Puffer gefüllt sanft spülen überschüssiges Blut aus dem Gefäß über P1 Wandler. Schließen Sie P1 an die Kammer. </li><li> Sichere Schiff in den P1 Kanüle mit dem Polyester Krawatte. </li><li> Bewegen Kanülen / Kanüle Inhaber näher für die Montage auf der P2-Kanüle. </li><li> Berg distale Ende des Schiffes (~ ¼ der Länge) auf distalen Kanüle. Sicherer mit Polyester-Krawatte. </li></ol> Ca. Zeit = 20 Minuten 5. Durch das Aufdrücken des Schiffes <ol><li> Passen Sie die Kanüle Inhaber keine beugen oder strecken in das Schiff zu sichern. </li><li> Mit P1 und P2 geschlossen, um die Kammer-Schalter der Druck Servo von automatisch auf manuell. Überprüfen Sie auf der Druck-Servo gibt es keine kontinuierliche Abnahme der Druck innerhalb von 10 Sekunden. Wenn ja, ist ein Leck auftritt und die Anschlüsse und Sensoren benötigen, um im Platz zu sichern. </li><li> Passen Sie den Druck Servo zurück zur automatischen öffnen P2 in die Kammer. Unter dem Mikroskop beobachten, das Schiff ausdehnen, wenn der Hahn in die Kammer geöffnet wird. </li><li> Schalten Sie den Druck Servo-Handbuch. Kontrollieren Sie wieder für eine kontinuierliche Abnahme des Drucks innerhalb von 10 Sekunden. Wenn ein Leck vorhanden ist dann ist das System nicht dicht Druck und es wird wahrscheinlich ein Loch in das Schiff sein. </li><li> Zurück zur automatischen Öffnen P1 in die Kammer. Auf die manuelle Einstellung zu überprüfen, dass der Druck stabil bleibt. </li><li> Wenn kein Leck, auf manuelle Einstellung zu erhöhen Rad 2 (40 mmHg). </li><li> Passen Sie die automatische und beobachten das Schiff unter dem Mikroskop. Wenn nötig, passen Sie die Kanülenhalter keinen Knick in der vessel.Check auf Undichtigkeiten auf manuelle Einstellung zu gewährleisten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,6 bis 5,7 erhöht die Wählscheibe auf 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) und so weiter, bis der gewünschte Druck erreicht ist. </li></ol> Ca. Zeit = 15 bis 30 Minuten 6. Inkubation des unter Druck stehenden Behälter <ol><li> Verbinden Sie den Temperaturregler eingestellt auf 37 ° C. </li><li> Mit einem zweiten Schlauchpumpe perfuse Krebs-Puffer (1 mL / min) in das Gefäß Kammer Bad. </li><li> Connect Aspirator an die Kammer sicher, dass nur die oberste Schicht des Bades entfernt wird. </li><li> Inkubieren unter Druck stehenden Behälter bei 37 ° C für 1 Stunde mit dem Druck auf automatisch. </li><li> Überprüfen Sie den Druck nicht undicht ist (Umschalten auf manuelle) in regelmäßigen Abständen. </li><li> Die Auswirkungen der verschiedenen pharmakologischen Interventionen können durch einfaches Hinzufügen der Verbindung zum Bad während der Inkubation beobachtet werden. </li></ol> Ca. Zeit = 1 Stunde 7. Perfusion der unter Druck stehenden Behälter mit Vollblut <ol><li> Während der Inkubation erhalten mindestens 7,5 mL Vollblut / Schiff in 40 U Heparin / ml Blut gesammelt. Inkubieren in einem 50 ml Falcon bei 37 ° C. </li><li> 10 Minuten vor dem Ende der ter Inkubation Label Blut mit VybrantDil (1:1000) für 10 Minuten bei 37 ° C im Dunkeln. </li><li> Nach 10 Minuten sammeln Blut in eine Spritze Clearing keine Blasen und legen auf eine Spritzenpumpe mit einem Heizmantel auf 37 ° C. </li><li> Schließen Sie P1 Wandler, um die Kammer / Schiff und verbinden Spritze und Ablaufschlauch. </li><li> Purge Blut bei 1000 ul / min durch den Ablaufschlauch keine Luftblasen zu entfernen. </li><li> Öffnen P1 in die Kammer. Der Druck Servo wird automatisch angepasst, um gewünschten Druck zu halten. </li><li> Perfundieren Blut bei 100 ul / min. </li><li> Mit einem Fluoreszenz-Mikroskop gekoppelt mit einer digitalen Kamera aufnehmen zwei Felder des perfundierten Gefäß für 15 Sekunden bei 1, 3, 5, 7,5 und 10 Minuten. </li><li> Beitrag Perfusion endothelialen Integrität und Funktion kann über pharmakologische Techniken wie Myographions und Adhäsionsmolekül Expression kann immunhistochemisch bestimmt werden, um weiter zu validieren die entzündliche Reaktion zu beurteilen. </li></ol> Ca. Zeit = 15 Minuten 8. Repräsentative Ergebnisse: Eine schematische Darstellung der Druckkammer Aufbau ist in Abbildung 1 dargestellt. Mit einer Digitalkamera gekoppelt mit einem Fluoreszenzmikroskop Ergebnisse können sofort per Live-Video-Aufnahmen sichtbar gemacht werden. Vertreter Videobilder werden in Abbildung 3, wo Leukozyten gelten als Anhänger des Endothels, wenn sie 10 Sekunden lang stationär geblieben zu sehen sind. Mit Video-Aufnahmen auf Endlosschleife eingehalten Zellen können als Mittelwert pro Feld gezählt werden. Während beide niedrig sind (Abbildung 3A) und hoch (Abbildung 3B) Druck ein gewisses Maß an Haftung verursachen einen signifikanten Anstieg der Leukozyten-Adhäsion an der höheren intraluminalen Druck gesehen, und das ist auch quantitativ (Abbildung 4) demonstriert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" /> Abbildung 1. Unter Druck ex vivo Schiff Kammer schematisch. Ein kanülierten Schiff verbunden mit einem proximalen (P1) Wandler und einem distalen (P2) Wandler, dass der Blutdruck ermöglicht, innerhalb des Behälters manipuliert werden. Perfusion wird durch die P1 Wandler und Druck über P2 Wandler gewartet. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" /> Abbildung 2. Cannuala mit Krawatten. Schwarze Polyester-Verbindungen sind zu jeder Kanüle befestigt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vertreter von Videobildern. Dynamische Zelladhäsion (roter Pfeil) unter Fluoreszenz bei 80 mmHg (A) und 120 mmHg (B) nach 10 Minuten Perfusion. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" /> Abbildung 4. Leukozytenadhäsion in Sprague Dawley Halsschlagadern nach 1 Stunde Inkubation bei niedrigen (80 mmHg) und hohem Druck (120 mmHg). *** P &lt;0,001, wie 2-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen mit Bonferroni post hoc Test analysiert.

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	<li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors.">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li><li>Szczech, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+and+cardiovascular+outcomes+in+acute+severe+hypertension.">Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension.</a> Circulation. 121, 2183-2191 .</li><li>Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+elevated+blood+pressure+and+its+management+on+the+short-term+outcome+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke.</a> Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).</li><li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure.">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> JAMA. 275, 1557-1562 (1996).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Riou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+pressure+promotes+monocyte+adhesion+to+the+vascular+wall.">High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall.</a> Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).</li><li>Ley, K., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial,+not+hemodynamic,+differences+are+responsible+for+preferential+leukocyte+rolling+in+rat+mesenteric+venules.+Circ+Res.">Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res.</a> 69, 1034-1041 (1991).</li><li>Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment.">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13, 587-596 (2007).</li><li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation.">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).</li><li>Eberth, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+pulsatility+in+hypertensive+carotid+artery+growth+and+remodeling.">Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling.</a> J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).</li><li>Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+activates+an+endothelial+potassium+channel+to+release+an+endogenous+nitrovasodilator.">Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator.</a> J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).</li></ol>

Das Studienprotokoll wurde von der Alfred Medical Research and Education Precinct Animal Ethics Committee und der Alfred Hospital Ethics Committee genehmigt.

Dies ist eine modifizierte Methode zur Leukozyten-Adhäsion an das Endothel in intakten isolierten Blutgefäßen unter Druckbedingungen in Echtzeit zu studieren. Perfusion des Schiffes Kammer allein ermöglicht eine schnelle Validierung von pro-inflammatorischen Stämme von großen Mäusen und Ratten Schiffe. Aktivieren Druck Manipulation ermöglicht dynamische Zell-Interaktionen von niedrig bis sehr hoch intraluminalen Druck, damit eine bessere Mimik-Ing physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen eingehalten werden. Durchmesser der Gefäße können ebenfalls gemessen mit einer ausreichenden Zell-Imaging-Programm und damit Scherströmung und kann ermittelt werden und somit manipuliert werden. Mit seiner Myographions Fähigkeiten, fügen pharmakologische Interventionen in das Bad gelegt weitere Dimension der experimentellen Bedingungen möglich mit diesem Modell ermöglicht Untersuchungen von mechanistischen und Signalwege. Während endothelial Erhaltung kann nicht während der Druck Manipulation bestätigt werden, können Reaktionen auf ACh und PE post Perfusion 9 geführt werden. Anzumerken ist, dass dieses Setup die Auswirkungen der intraluminale Druck auf Zell-Zell-Interaktionen nicht die Auswirkungen des pulsierenden Blutflusses noch systolische oder diastolische Druck zeigt werden. Hinzu kommt, dass akute Druckänderungen auf Leukozytenadhäsion beobachtet wurden, kann dieses Setup auch genutzt werden, um bei chronischen Druck-Effekte (dh die Erhöhung Inkubationszeiten und mit einem chronischen Druck Tiermodell) zu suchen. Sprague Dawley Arteria carotis communis werden in dieser Einrichtung aber gezeigt, andere Stämme und Arten können mit entsprechenden Anpassungen an die Kanüle Größe verwendet werden. In der Tat ist es wichtig zu beachten, dass das Alter und Gewicht der Tiere Gefäßgröße beeinflussen und damit, dass die Einrichtung muss für jedes Schiff individuell angepasst werden. Close und sorgfältige Dissektion des Bindegewebes kann Visualisierung der Leukozyten immens verbessern.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes / Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Carl Zeiss, Inc </td><td> SteREO Discovery V.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 2000 Spritzenpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> Digitalkamera und Controller </td><td> Hamamatsu ORCA-ER </td><td> C4742-95 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenz-Beleuchtungssystem </td><td> Lumen Dynamics </td><td> X-Cite 120 </td><td></td></tr><tr><td> Vessel Kammer </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> Pressure Servo Controller und Schlauchpumpen </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> PS - 200 </td><td></td></tr><tr><td> Perfusion Pressure Monitor </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 x Druckaufnehmer </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td> Temperaturregler </td><td> Living Systems Instrumentation </td><td> TC-01 </td><td></td></tr><tr><td> Schlauchpumpen </td><td> Instech Laboratories, Inc </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil Zell-Kennzeichnung Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> Verwenden 1:1000 </td></tr></tbody></table>

imaging leukocyte adhesion to the vascular endothelium at high intraluminal pressure

Worldwide, Bluthochdruck wird berichtet, dass in etwa ein Viertel der Bevölkerung und ist der führende biomedizinische Risikofaktor für die Mortalität weltweit. In den Gefäßen Hypertonie ist mit einer endothelialen Dysfunktion und erhöhte Entzündung führt zu Arteriosklerose und verschiedenen Krankheiten wie chronischen Nierenerkrankungen 2, 3 und Schlaganfall Herzinsuffizienz 4 zugeordnet. Ein erster Schritt in Gefäßentzündungen führt zu Arteriosklerose ist die Haftung Kaskade, die die Rollen, Anbindehaltung, die Einhaltung und anschließende Transmigration von Leukozyten durch das Endothel handelt. Rekrutierung und Akkumulation von Leukozyten an das Endothel wird durch eine Hochregulation von Adhäsionsmolekülen wie vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intrazelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) und E-Selektin sowie Erhöhungen in vermittelter Zytokin-und Chemokin-Freisetzung und eine Hochregulation von reaktiven Sauerstoff-Spezies 5. In-vitro-Methoden wie z. B. statische Haftung Assays helfen, die Mechanismen der Zell-Zell-Adhäsion beteiligt sowie die Analyse von Zell-Adhäsionsmoleküle zu bestimmen. Methoden in der früheren in vitro Studien verwendet haben gezeigt, dass akute Erhöhungen der Druck auf das Endothel kann Monozytenadhäsion, eine Hochregulation von Adhäsionsmolekülen und Entzündungsmarker 6 hingegen, ähnlich wie bei vielen in-vitro-Assays, diese Erkenntnisse noch nicht in Echtzeit durchgeführt führen unter physiologischen Strömungsverhältnisse, noch mit Vollblut. Daher sind in-vivo-Untersuchungen zunehmend in Tiermodellen genutzt werden, um vaskuläre Entzündungen und die Bildung von Zahnbelag zu demonstrieren. Intravital Mikroskopie ist mittlerweile weit verbreitet, um Leukozytenadhäsion, Walzgut, Migration und Transmigration 7-9 zu bewerten. Bei der Kombination der Auswirkungen von Druck auf die Leukozyten an endotheliale Adhäsion der in-vivo-Studien sind weniger umfangreich. Eine solche Studie untersucht die Echtzeit-Effekte von Strömungs-und Scherung auf arterielle Wachstum und Umbau, sondern Entzündungsmarker waren nur über Immunhistochemie 10 beurteilt. Hier präsentieren wir ein Modell für die Aufnahme Leukozytenadhäsion in Echtzeit in intakten Druck Blutgefäße mit Vollblut Perfusion. Die Methodik ist eine Modifikation eines Ex-vivo-Perfusion Schiff Kammer-Modell 9, die Echtzeit-Analyse von Leukozyten-Endothel-adhäsiven Wechselwirkungen in intakten Behältern ermöglicht. Unsere Modifikation ermöglicht die Manipulation der intraluminale Druck bis 200 mmHg Berücksichtigung Studie nicht nur unter physiologischen Strömungsverhältnisse, sondern auch Druckbedingungen. Während der Druck Myographie Systeme zuvor unter Beweis gestellt haben, um Gefäßwand und Lumen Durchmesser 11 sowie Gefäß Kontraktion zu beobachten ist dies das erste Mal zeigen, Leukozyten-Endothel-Interaktionen in Echtzeit. Hier zeigen wir die Technik mit Halsschlagadern von Ratten entnommen und Kanüle eingeführt, um eine maßgeschneiderte Flusskammer gekoppelt mit einem Fluoreszenzmikroskop. Das Schiff Kammer ist mit einem großen unteren Deckglas so einem großen Durchmesser Objektiv mit kurzer Arbeitsabstand zum Bild des Schiffes ausgestattet. Darüber hinaus können ausgewählte Agonisten und / oder Antagonisten eingesetzt zur weiteren Untersuchung der Mechanismen, die Zelladhäsion werden. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber Intravitalmikroskopie sind keine Beteiligung von invasiven Chirurgie und somit ein höherer Durchsatz erreicht werden kann. Diese Methode ermöglicht auch die Verwendung von lokalisierten Inhibitor Behandlung, um die gewünschte Gefäß während intravital nur ermöglicht systemische Inhibitor Behandlung.

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Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Dies ist eine Methode zur Leukozyten-Adhäsion an das Endothel in geerntet Druckbehälter zu visualisieren. Die Technik ermöglicht das Studium vaskulären Haftung unter Scherströmung mit unterschiedlichen intraluminale Drücke bis 200 mmHg damit nachahmen-Ing den pathophysiologischen Bedingungen des hohen Blutdrucks.

Imaging Leukozytenadhäsion an das vaskuläre Endothel bei hohen intraluminalen Druck

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.7K Aufrufe.  Monash University. Dies ist eine Methode zur Leukozyten-Adhäsion an das Endothel in geerntet Druckbehälter zu visualisieren. Die Technik ermöglicht das Studium vaskulären Haftung unter Scherströmung mit unterschiedlichen intraluminale Drücke bis 200 mmHg damit nachahmen-Ing den pathophysiologischen Bedingungen des hohen Blutdrucks.

Serie: Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Die Beurteilung stomatäre Response to Bakterienzellen Live mit Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...