Wir danken der UMass Durchflusszytometrie Kern: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu und Tammy Krupoch. Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) und NIH CA T32-130807 (JRS) finanziert. Core-Ressourcen durch die Diabetes Endocrinology Research Center gewähren DK32520 unterstützt wurden ebenfalls verwendet.

1. Harvesting von Geweben <ol><li> Bereiten Röhrchen mit 2 bis 5 ml kaltem Färbepuffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Zusatz von 0,2% BSA und 5 mM Glucose). Keep Röhrchen auf Eis vor der Gewebe zu ernten. </li><li> Cull Mäusen nach geeigneten genehmigten Protokoll (z. B. CO 2-Inhalation durch Genickbruch folgte). </li><li> Draw Blut durch Herzpunktion in EDTA-oder Heparin-Blut-Sammlung Rohre für eine spätere Analyse, z. B. von Hämatokrit, Retikulozyten oder CBC-Analyse. </li><li> Ernte der Milz und Knochen, indem Gewebe aus jeder Maus in ein separates Röhrchen, die in Schritt 1 vorbereitet. Einfacher Zugang zu Milz ist von der linken Seite. Für das Knochenmark, die Ernte eines oder beider Oberschenkel. Keep geerntet Gewebe auf Eis. </li><li> Wenn gewünscht, wiegen die Milz. Mäuse Einwirkung einer Erythropoetin-Stress-Reaktion geeignet sind, einen signifikanten Anstieg in Milzgewicht zeigen. </li></ol> 2. Vorbereitung von Milzzellen <ol><li> Mit einem vorbefeuchtete 3 ml Spritzenkolben, schieben Sie die Milz, oder ein Teil der Milz (idealerweise 0,1 Gramm oder weniger, das entspricht ungefähr 10 8 Zellen) durch ein 40 um sterile Zellsieb (Fisherbrand Katalog-Nummer 22363547 oder andere) platziert auf einem 50 ml konischen Rohr. Halten Sie das Röhrchen auf Eis während dieses Vorgangs. Waschen Sie die Zellen durch das Sieb mit einer Gesamtfläche von 2 ml Färbepuffer. </li><li> Gently Pipette die angespannte Zellsuspension aufzubrechen jede kleine Klumpen. Falls erforderlich, erneut belasten die Zellen. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal durch Zentrifugieren und in kaltem Puffer resuspendieren. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Typische Ausbeuten sind 1-2 x 10 8 Zellen / Milz. Für Durchflusszytometrie-Analyse, aliquot 1 bis 2.000.000 Zellen pro Probe, entweder in FACS Färbung Röhrchen (BD Falcon Polystyrol Rundboden-Röhrchen, 352008) oder U-Boden 96-Well-Platte (BD Falcon 353910). Beispiel Färbung Volumen 200 ul, um eine endgültige Zellkonzentration von 0,5 bis 1 x 10 7 Zellen / ml oder 1-2 x 10 6 Zellen / 200 ul Probe. </li></ol> 3. Vorbereitung von Knochenmarkzellen <ol><li> Bereiten Sie 1 oder 3 ml Spritzen mit einem angehängten 26G Nadel, mit kaltem Färbepuffer vorgefüllt. </li><li> Entfernen Sie Muskeln, die an den Oberschenkelknochen, so dass der Knochen deutlich sichtbar zu machen. </li><li> Mit scharfen chirurgischen Schere, schneiden Sie beide Enden des Oberschenkelknochens, so nah wie möglich an den Enden der Knochen. Dies sollte ein kleines Loch an jeder abgeschnittene Ende zeigen, was in das Knochenmark Hohlraum, der durch die Länge des Oberschenkelknochens läuft. </li><li> Mit dem Fertigspritzen in Schritt 1 Führen Sie die Nadel durch eines dieser Löcher, und sanft spülen das Knochenmark durch das Loch am anderen Ende, in ein Rohr. </li><li> Dissoziieren die gespülten Zellen durch vorsichtiges Pipettieren, und durch ein 40 um Sieb für die Milz vor (siehe Abschnitt 2.1). </li><li> Wash Zellen zweimal durch Zentrifugation in kalten Färbepuffer </li><li> Zählen Sie die Zellen und Zellen, wie in Abschnitt 2.4. Typische Ausbeuten sind ungefähr 10 7 Zellen pro Femur. </li></ol> 4. Vorbereitung der fötalen Leberzellen <ol><li> Zur Vorbereitung timed-trächtigen weiblichen Mäusen, Einrichten Mäusen zur Paarung in den Abend, zu untersuchen auf Vaginalpfropf vor 10 Uhr des folgenden Tages, der Tag, an dem die Vaginalpfropf erkannt wird als Tag 0,5. Veterinary Mitarbeiter können möglicherweise Ermittler, die nicht mit dieser Technik, um schwangere Frauen zu identifizieren, zu unterstützen. Eine Schwangerschaft kann auch durch die Überwachung der Maus Gewicht bestimmt werden. </li><li> Timed-schwangeren weiblichen Mäusen werden an den Tagen 12,5 bis 14,5 der Schwangerschaft getötet. Die Uterushörner in eine Petri-Schale mit eiskaltem Kulturmedium oder Färbepuffer entfernt. </li><li> Die Embryonen werden von jedem Gebärmutter entfernt und die fetale Leber präpariert. Ein Binokular ist für Embryonaltag 12,5 (E12.5) oder jünger erforderlich. </li><li> Livers kann getrennt werden mechanisch durch Pipettieren in Puffer und werden entweder einzeln in 96-Well-Platten verarbeitet, oder zusammen, je nach experimentellen Anforderungen zusammengefasst. </li><li> Eine fetale Leber bei E13.5 hat ~ 10 7 Zellen. Die Zellen werden zweimal in Färbepuffer gewaschen und bei 1-2 x 10 6 Zellen / 200 ul Probe für die durchflusszytometrische Analyse. </li></ol> 5. Antikörper-Färbung für die Durchflusszytometrie <ol><li> Bereiten Sie eine primäre Antikörper-Färbung Pre-Mix für alle Proben verwendet werden, mit Ausnahme von Kontrollproben, mit folgendem Inhalt: <ul><li> ChromePure Rabbit IgG (Jackson, 015-000-003), bis zu einer Endkonzentration von 200μg/ml. Prüfen Sie die Lager-Konzentration auf der Flasche (es kann variieren). Dies wird verwendet, um Fc-Rezeptoren in Zellen der Maus blockieren; alternative Arten, die dafür verwendet werden können, sind IgG-oder Ratten-IgG. Species Wahl wird durch die mögliche Anwesenheit in der Färbung Protokoll sekundäre Antikörper gegen primäre Ratte / Maus / Kaninchen-Antikörper, in welchem ​​Fall diese Arten nicht verwenden können gerichtet bestimmtd als blockierende Antikörper. Alternativ können 5% Kaninchenserum auch anstelle von gereinigtem IgG verwendet werden. Eine weitere Alternative ist die Verwendung von monoklonalen Antikörpern oder Fab-Fragmente an der Maus Fc-Rezeptoren gerichtet. Das grundlegende Protokoll unten enthält keine Sekundärantikörper und so IgG von jeder der drei Arten verwendet werden kann. </li><li> CD71-FITC, verdünnt 1:200 (stock 0,5-Promillegrenze, BD-Biosciences, 553266) </li><li> TER119-PE, 1:200 (Lager 0.2mg/ml, BD-Biosciences, 553673) verdünnt </li><li> Jede weitere Antikörper an der Oberfläche Epitope von Interesse gerichtet, z. B. Antikörper an Fas oder FasL (siehe 1,2) gerichtet. Mix der Antikörper-Lösung vorsichtig durch Invertieren des Röhrchens 2-3 mal. </li></ul></li><li> Add 200 ul der Pre-Mix für jede Zelle Probe und sanft wieder aussetzen Zellen. </li><li> Bereiten Kontrolle Zellproben wie folgt: <ul><li> &quot;Ungefärbte &#39;: Diese Zellen sind in Färbepuffer links und bilden den Hintergrund Autofluoreszenz der Zellen. </li><li> &#39;Single color&#39; steuert: eine solche Kontrolle ist für jeden Antikörper / Farbe in das verwendete Protokoll benötigt. Die Zellen in dieser Kontrollen sind entweder mit einem direkt konjugierten Primärantikörper gefärbt, oder sowohl mit einem primären Antikörper und einem konjugierten sekundären Antikörper. Diese Kontrollen dienen dazu, für die spektrale Überlappung zwischen den Kanälen zu korrigieren. </li><li> &quot;Fluorescence minus eins&quot; (FMO) steuert: eine solche Kontrolle ist für jeden Antikörper / Farbe in das Protokoll erforderlich: die Zellen werden mit allen Farben / Antikörper in das Protokoll mit Ausnahme der Farbe gefärbt / Antikörper, bei denen dies der FMO-Steuerung. Die FMO-Steuerung für einen bestimmten Kanal bietet den wahren Hintergrund für diesen Kanal. Es können auch nicht-spezifische Antikörper der gleichen Isotyp und konjugiert mit der gleichen Fluoreszenz-Markierung wie der Test Antikörper (Isotyp-Kontrolle). </li></ul></li><li> Inkubieren Proben und entsprechende Kontrollen in den primären Antikörper auf Eis Fleck für 45 &#39;bis 1 Stunde im Dunkeln (put Alufolie abdecken auf Eis-Eimer). </li><li> Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 3 ml Färbepuffer jedem Probenröhrchen und Spin für 3 &#39;bis 5&#39; bei etwa 400 xg bei 4 ° C. Bei Verwendung von 96-Well-Platten, waschen Sie die Zellen dreimal in einem Volumen von 200 ul. </li><li> Wenn relevant, gelten sekundären Antikörper-Färbung. Übernehmen und waschen wie für den ersten Antikörper-Färbung. </li><li> Gegebenenfalls ist ein Fleck mit Annexin V am Ende der Inkubationszeit aufgetragen, mit einem HEPES-Puffer, wie in der Anleitung des Herstellers. Dieser Fleck ist für 15 Minuten bei Raumtemperatur angewendet, oder für 1 Stunde auf Eis. </li><li> Die Zellen sind für die Durchflusszytometrie-Analyse in Färbelösung mit einem Zell-undurchlässige DNA-Farbstoff resuspendiert, um tote Zellen auszuschließen. Mehrere DNA-Farbstoffe sind verfügbar, einschließlich Propidiumiodid, 7-Amino-Actinomycin D (7AAD) oder DAPI. Die Wahl aus den Reihen dieser hängt von der verfügbaren Kanäle, da die Kanäle für spezifische Antikörper-Färbung genommen und Kanälen auf dem Durchflusszytometer. 7AAD von BD-Biosciences (559925) gewonnen und nach den Anweisungen des Herstellers. Für DAPI-Färbung, einen Bestand von 1mg/ml in Dimethylformamid (DMF) aus Pulver (Roche, Kat. Nr. 236276), halten bei -20 ° C und verdünnt 1:10.000 bis 1:15.000 in Färbepuffer. </li></ol> 6. Durchflusszytometrische Sortierung <ol><li> Die Zellen werden mit Antikörpern gegen CD71, TER119, Abstammung Marker und eine Lebensfähigkeit Farbstoff als für durchflusszytometrische Analyse (Abschnitt 5) beschrieben gekennzeichnet. Zellkonzentration während Kennzeichnung kann auf 5 erhöht werden x 10 7 / ml. </li><li> Mix ein gleiches Volumen an jedem der folgenden Antikörper an die Linie Master-Mix zu machen: <ul><li> FITC Rat Anti-Maus-CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553848 </li><li> FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553087 </li><li> FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553061 </li><li> FITC Rat Anti-Mouse CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557396 </li><li> FITC Rat Anti-Maus-Ly-6G und Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553126 </li><li> Verwenden Sie die Master-Mix auf 1:80 (Dies ist gleichbedeutend mit 1:400 Verdünnung der einzelnen Antikörper Bestände, die alle 0,5 mg / ml sind). </li></ul></li><li> Verwenden Niederdruck-Sortier-Bedingungen und große Düsen. Für die Aria (BD Biosciences) Wir verwenden 100 μ Düse, 20 psi Druck. </li><li> Sammlung Puffer: PBS mit Zusatz von 20% Fetal Bovine Serum. </li><li> Zur Überprüfung der Reinheit der sortierten Populationen, erneut eine kleine Teilmenge von jeder Probe in einem Puffer, der eine Lebensfähigkeit Farbstoff enthält (7AAD oder ähnliches). </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: CD71/Ter119 Färbung der erwachsenen Knochenmark oder Milz identifiziert eine Entwicklungsstörung Sequenz von vier Untergruppen, etikettiert ProE, Erya, EryB und EryC (Abbildung 1) 1. Morphologisch sind diese zunehmend reifen Erythroblasten entsprechen. Abbildung 1 zeigt die Gating-Sequenz an der Datenanalyse Bühne, die sehr kleine Veranstaltung (einschließlich Kerne, roten Blutkörperchen), aggregierten Zellen und tote Zellen verworfen. Expression von Zelloberflächen-Proteine ​​können gleichzeitig für jede dieser Teilmengen gemessen werden, indem die entsprechenden Antikörper zur gleichen Zeit wie TER119 und CD71 Färbung. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel von Zell-Oberflächen-Expression des Todes-Rezeptor Fas 1. Diese Messung wurde in Mäusen mit Epo gespritzt durchgeführt oder in Kontroll-Mäusen mit Kochsalzlösung injiziert. Es ist offensichtlich, dass Epo Fas Ausdruck unterdrückt in der Erya Bevölkerung in vivo 1. Expression von intrazellulären Proteinen oder Zellzyklus-Status kann auch für die Zellen in jeder Teilmenge gemessen werden. Abbildung 2 zeigt repräsentative Zellzyklus-Analyse von frisch geernteten Knochenmarkszellen. Diese Messungen erfordern neben Zelloberflächenfärbung mit CD71 und TER119, die Fixierung und Permeabilisierung von Zellen für den intrazellulären Kennzeichnung (siehe Diskussion Abschnitt). In fetale Leber, sind nicht-erythroiden Zellen zuerst durch Gating auf &quot;Lin-&quot; Zellen, die negativ sind für CD41, Mac-1, Gr-1, B220 und CD3 (Abbildung 3) ausgeschlossen. Die restlichen Zellen sind unterteilt in 6 Teilmengen, S0 bis S5. Die genaue Muster der Zellen in der fötalen Leber ist abhängig von embryonalen Alter (siehe Diskussion Abschnitt). Ein Vertreter des Zellzyklus Analyse der S3 Teilmenge in E13.5 fetale Leber wird angezeigt (Abbildung 4). <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1 Die CD71/Ter119 erythroiden Teilmengen in Mäusemilz A. Gating-Strategie:.. Milzzellen wurden verarbeitet und gekennzeichnet mit Antikörpern an CD71, TER119 und Fas gerichtet. Diese Abbildung zeigt die Analyse-Strategie nach der Datenerfassung fort. Histogramm I zeigt alle erfassten Ereignisse. Die Diagonale Tor repräsentiert Ereignisse, die wahrscheinlich einzigen Zellen, ohne Dubletten oder größere Aggregate werden. Cells in diesem Tor sind weitere in Histogramm II analysiert. Hier sehr kleine Veranstaltungen, wahrscheinlich Kerne oder Schmutz sind ausgeschlossen. Die gated Zellen werden in Histogramm III, wo DAPI-positive Zellen, die wahrscheinlich sind membranpermeabel apoptotischen Zellen, von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden angezeigt. Histogramm IV zeigt die resultierende Population von lebensfähigen Milzzellen. Die ProE Tor enthält CD71 hohen TER119 intermediären Zellen. TER119 hohen Zellen werden weiter in Histogramm analysiert V. Hier CD71 hohen Zellen in weniger reifen, großen &#39;Erya &quot;Erythroblasten (CD71 hohen TER119 hohen FSC hoch) und kleiner, reifer&#39; EryB&quot; Erythroblasten (CD71 hohen TER119 hohen FSC niedrig) unterteilt . Die reifsten Erythroblasten Teilmenge EryC (CD71 niedrigen TER119 hohen FSC low). Histogramm VI zeigt Zelloberflächen-Fas Ausdruck, insbesondere in den Erya Teilmenge, bei Mäusen in den Grundzustand (Injektion von Kochsalzlösung) und Mäuse, die mit einer Einzeldosis von Epo gespritzt. Die Färbung mit Fas-Antikörper wurde gleichzeitig mit der CD71/Ter119 Färbung durchgeführt. B. Cytospin Präparate von Zellen aus jeder der angegebenen Teilmengen sortiert. Die Zellen wurden mit Giemsa gefärbt und mit Diaminobenzidin, erzeugt diese eine braune mit Hämoglobin Fleck. Cytospin Daten ursprünglich in Liu et al., Blood. 2006 Jul 1, 108 (1) :123-33. Epub 2006 Mar 9. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Zellzyklus-Analyse von CD71 hohen TER119 hohen Erythroblasten im Knochenmark der Maus. Die Mäuse wurden intraperitoneal mit BrdU injiziert und Milz oder Knochenmark wurden 30 bis 60 Minuten später geerntet. Die Zellen wurden fixiert und permeabilisiert und abgesehen davon, dass für CD71 und TER119 gebeizt, wurden BrdU-Einbau in die DNA-Replikation mit einem monoklonalen Antikörper an BrdU gerichtet gefärbt (Fixierung, Permeabilisierung und BrdU-Färbung Protokoll wurde nach Herstellerangaben). BrdU-positive Zellen in S-Phase des Zyklus. Interphase-Zellen sind BrdU-negative und kann in G1 oder G2 / M Phasen gelöst werden, mit dem DNA-Farbstoff 7AAD. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3 CD71/Ter119 erythroiden Teilmengen in Maus fetale Leber A. Gating-Strategie:.. Fötalen Leberzellen wurden für CD71, TER119 beschriftet und ein Cocktail von FITC-markierter Antikörper bei nicht-erythroiden Linie Marker (&quot;Lin&quot;) inszeniert. Lebensfähige Zellen (7AAD-negativ) wurden für Lin Ausdruck analysiert und die Lin-Zellen werden weiter in die S0 bis S5 erythroiden Teilmengen unterteilt. Jüngere, ist E13 fetale Leber von weniger reifen Erythroblasten, die durch das Fehlen von Zellen in den reifen S4/S5 Teilmengen gezeigt zusammen. B. Cytospin Präparate von Zellen aus jeder der angegebenen Teilmengen sortiert. Die Zellen wurden mit Giemsa gefärbt und mit Diaminobenzidin, erzeugt diese eine braune mit Hämoglobin Fleck. Cytospin Daten ursprünglich published in Pop et al, PLoS Biol 8 (9):. e1000484. doi: 10.1371/journal.pbio.1000484. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Zellzyklus-Analyse der fötalen Leber erythroiden Teilmengen. Schwangere Mäuse wurden mit BrdU injiziert und fötalen Lebern wurden 30 bis 60 Minuten später geerntet fixiert, permeabilisiert und gefärbt mit Antikörpern gegen CD71, TER119 und BrdU. Zellzyklus-Status der S3-Zellen gezeigt.

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	<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis.">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li><li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry.">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li><li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis.">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis.">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li><li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+dysplasia,+megaloblastic+anemia,+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction.">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li><li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells.">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li></ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Massachusetts Medical School IACUC eingesetzten Ausschusses durchgeführt.

Die durchflusszytometrische Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung aller zellulären Funktion, die mit einem Fluoreszenz-konjugierte spezifische Antikörper oder Liganden, einschließlich Zelloberflächenmarker, Proteinexpression, das Überleben der Zelle, Zell-Signal mit Hilfe phospho-spezifische Antikörper 3 und Zellzyklus-Status nachgewiesen werden kann. Diese Messungen können in jedem der eine Reihe von Differenzierungs-Bühne spezifische Teilmengen erfolgen, die im Rahmen von frisch isolierten erythropoetische Gewebe. Diese Methode ermöglicht somit Beurteilung der funktionellen und molekularen Veränderungen auf verschiedenen Ebenen des erythropoetischen Systems, in Reaktion auf eine breite Palette von Erythropoetin Reize oder als Folge von genetischen Mutationen. Keine Antikörper ist ohne Kreuzreaktivität und Kreuzreaktivität kann gewebespezifisch. Es ist daher wichtig, um zu überprüfen, auch für bereits getesteten Antikörper, ihre Spezifität im Rahmen der erythropoetischen Gewebe, entweder mit einer null oder knock-down Zellen-Modell. Zellen aus bestimmten erythroiden Teilmengen können RNA oder Transkriptom-Analyse sortiert werden. Sortieren Experimente sollten niedrige Sortierung Drücke und große Düsen, um die Schubspannung auf die Zellen zu minimieren. Wir empfehlen Zelle Reinheit und Lebensfähigkeit nach jedem Sortierung Experiment. Zu beachten ist, im Falle von Multiparameter Durchflusszytometrie, ist der wahre Hintergrund für jede Farbe ihre &quot;FMO&quot;-Regelung (siehe 5.3), die beinhaltet neben Autofluoreszenz, den Hintergrund durch spektrale Überlappung von allen anderen Farben. Bei der Analyse der Bühne, muss eine Teilmenge-spezifische &quot;FMO&quot; Kontrolle verwendet werden. Grad der Differenzierung der Erythroblasten im Strom-zytometrisch definierten Teilmengen Die durchflusszytometrische ProE / Erya / EryB / EryC Teilmengen werden in Form von Zell-Oberflächen-Marker Ausdruck und Vorwärtsstreuung definiert. Während es wahrscheinlich ist, dass jede dieser Teilmengen in etwa die gleiche morphologische Erythroblasten der Grad der Differenzierung in eine Vielzahl von Mausmodellen entspricht, empfehlen wir die Überprüfung dieser bei der Prüfung ein neues Mausmodell. Zellen aus jedem der Flow-zytometrisch definierten Teilmengen sollten sortiert und Zytospin Präparate untersucht morphologischen Inszenierung von Erythroblasten. Obwohl die CD71/Ter119 Teilmengen Erythroblasten ähnliche Differenzierung Stadium enthalten, bleibt ein gewisses Maß an Heterogenität innerhalb jeder Teilmenge. In der ersten Anwendung des CD71/Ter119 Methode, teilten wir TER119 + Zellen in den Regionen I bis IV auf ihre CD71 Expression basiert. Die genauen Grenzen zwischen diesen Bereichen wurden willkürlich 4 bestimmt. Wir zugegeben Zellgröße Informationen, um die Analyse, in der Form der Vorwärtsstreuung Parameter. Dies erlaubte uns, TER119 hohen Zellen in Untergruppen aufteilen, indem Sie natürliche Bevölkerungsentwicklung Konturen 1 (Abbildung 1). Dieser Ansatz führte in Populationen von gleichmäßiger Reifung und in reproduzierbarer Ergebnisse, und wurde kürzlich von anderen Forschern 5,6,7 angepasst. Die Erya Teilmenge kann weiter unterteilt, wo gewünschte 7. Eine Gruppe schlug vor, die Verwendung von CD44 an Stelle der CD71 8. Obwohl CD44 ist weniger nützlich bei der Lösung frühen Erythroblasten Stadien kann es zu lösen später Erythroblasten Teilmengen mit mehr Präzision. Beide Marker können daher verwendet werden, oder alternativ ihrer Wahl kann die spezifische Teilmengen von Interesse ab. Eine alternative Strategie beschäftigt multispektralen Bildgebung mit der ImageStream Technologie (Amnis Corporation, Seattle, WA) 9. Es ermöglicht die gleichzeitige und schnelle Übernahme von sowohl morphologischen und durchflusszytometrische Daten auf Tausenden von Zellen. Es ist wahrscheinlich der &quot;Goldstandard&quot; geworden in Bezug auf molekulare Analyse der Phase-spezifische Erythroblasten, da die morphologischen Kriterien, nach denen der Grad der Differenzierung definiert ist direkt gemessen werden kann. Doch in der heutigen Zeit ist diese Technologie weniger weit verbreitet als konventionelle Durchflusszytometrie, und leidet unter zwei Nachteile: es nicht zulassen, Zellsortierung, und es ist auf eine geringere Anzahl der durchflusszytometrischen Parameter beschränkt. Intrazelluläre Antigene Detektion von intrazellulären Proteinen oder BrdU erfordert Zelle Fixierung und Permeabilisierung. Die genaue Fixierung und Permeabilisierung Verfahrens beruht auf der intrazellulären Antigen in Frage. Wir nutzen die LIVE / DEAD Fixierbarer Dead Cell Stain (Molecular Probes) während der Fixierung Verfahren zur Unterscheidung von toten Zellen lebensfähig. Zu beachten ist, Permeabilisierung mit Waschmitteln in der Regel wirkt sich auf die TER119 Signal, das teilweise Waschmittel löslich. Wir überwinden diese Schwierigkeit mit sanften Reinigungsmitteln (wie z. B. das Saponin-based &#39;perm / wash &quot;-Puffer von BD Biosciences). Wir haben auch für TER119 sowohl vor als Makel, und nach der Fixierung und Permeabilisierung Verfahren, um die TER119 sig optimierennal. Alternativ ist es möglich, lebende Zellen von jeder der CD71 / TER119 Teilmengen zuerst sortieren und führen Fixierung und Permeabilisierung separat auf gereinigten Zellen aus jeder Teilmenge (siehe zB den Zellzyklus-Analyse in der fötalen Leber) 10. Fetale Leber CD71/Ter119 Teilmengen Die CD71/Ter119 Färbungsmuster in fötaler Leber ist abhängig von embryonalen Alter 2 (Abbildung 3). Wir unterteilen fötalen Leberzellen in 6 Teilmengen, S0 bis S5 10. Zu Beginn der definitive Erythropoese in fötaler Leber an embryonalen Tag 11 (E11) werden die Zellen in Untergruppen S0 und S1 konzentriert und sind weitgehend erythroiden Kolonie-bildenden Zellen (CFU-E). Mit der Embryonalentwicklung, Differenzierung CFU-E Zellen in Proerythroblasten und Reifung Erythroblasten und allmählich bevölkern Teilmengen S2 bis S5 (Abbildung 3). Subsets S1 bis S5 sind fast vollständig von erythroiden Zellen der endgültigen Linie zusammen. Diese Untergruppen sind in der EpoR abwesend - / - fetale Leber. Eine kleine Anzahl von TER119 + Zellen in der fötalen Leber zu den primitiven (Dottersack) erythroiden Linie entsprechen. Diese Zellen sind in EpoR scheinbare - / - fetale Leber, wo keine definitive Linie Erythroblasten entstehen, sondern durch E13.5 Form von weniger als 1% der TER119 +-Zellen in Wildtyp-fetale Leber 10. Die S0-Teilmenge ist heterogen. Bei E13.5 sind 70% der S0-Zellen erythroiden Zellen an der CFU-e Bühne, kurz vor dem Beginn der EpoR Abhängigkeit 10. Der Rest sind früher Vorläuferzellen sowie Zellen anderer hämatopoetischer Linien, vor allem Megakaryozyten und Makrophagen, diese Zellen können sortiert oder gated aus 10 (Abbildung 3). Interpretation von Veränderungen in der Häufigkeit der erythroiden Teilmengen Änderungen in der Häufigkeit der erythroiden Teilmengen sollten mit Vorsicht interpretiert werden. Eine Veränderung in der Frequenz von Zellen in einer bestimmten Untergruppe kann aufgrund ihrer veränderten Apoptoserate, verändert Laufzeit durch diese Teilmenge, oder alternativ kann aufgrund von Änderungen in der Anzahl der Zellen in anderen Teilmengen. Eine häufige Ursache für erhöhte Häufigkeit von frühen Erythroblasten Teilmengen ProE und Erya ist erythropoetischen Stress von mehreren Ursachen 1. Ähnliche Ergebnisse wurden in den 1960er Jahren durch Einsicht in Erythroblasten Morphologien während der Stressreaktion 11 notiert. Der genaue Grund für den Anstieg in der relativen Häufigkeit von früher Vorläufer bei Stress ist nicht klar, aber in Teil kann aufgrund der verbesserten Überleben von diesen Vorläufern bei Stress 1.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Fas-Biotin </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554256 </td></tr><tr><td> Streptavidin-APC </td><td> Molecular Probes </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 um sterile Zellsieb </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> Polystyrol Rundboden-Röhrchen für FACS-Färbung </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td></tr><tr><td> U-Boden 96-Well-Platte </td><td> BD Falcon </td><td> 353910 </td></tr><tr><td> ChromePure Rabbit IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71-FITC (stock 0,5-Promillegrenze) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553266 </td></tr><tr><td> TER119-PE (stock 0.2mg/ml) </td><td> BD-Biosciences </td><td> 553673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD-Biosciences </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> DAPI Pulver </td><td> Roche </td><td> 236276 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Maus-CD41 MWReg30 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553848 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553087 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557396 </td></tr><tr><td> FITC Rat Anti-Maus-Ly-6G und Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553126 </td></tr><tr><td> FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553061 </td></tr><tr><td> APC BrdU Flow Kit </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557892 </td></tr><tr><td> Annexin V-Biotin </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556418 </td></tr></tbody></table>

identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay

Das Studium der Erythropoese möchte verstehen, wie rote Blutkörperchen sind aus früheren hämatopoetischen Vorläuferzellen und erythroiden gebildet. Genauer gesagt, ist die Rate der roten Blutkörperchen Bildung durch das Hormon Erythropoietin (Epo), dessen Synthese durch Hypoxie ausgelöst geregelt. Eine Bedrohung für die ausreichende Sauerstoffversorgung des Gewebes führt zu einem raschen Anstieg der Epo, Fahren eine Erhöhung der Erythropoese-Rate, ein Verfahren, wie der erythropoetischen Stress-Reaktion bekannt. Der daraus resultierende Anstieg der Zahl der zirkulierenden roten Blutkörperchen verbessert Gewebe Sauerstoffzufuhr. Eine effiziente erythropoetischen Stress-Reaktion ist daher entscheidend für das Überleben und die Wiederherstellung von physiologischen und pathologischen Bedingungen wie Höhenlage, Anämie, Blutungen, Chemotherapie oder Stammzelltransplantation. Die Maus ist ein Schlüssel-Modell für das Studium der Erythropoese und ihre Reaktion auf Stress. Maus definitive (Erwachsenen-Typ) Erythropoese findet in der fetalen Leber zwischen embryonalen Tage 12.5 und 15.5, in der Neugeborenen-Milz und in der Erwachsenenbildung Milz und Knochenmark. Klassische Methoden zur Identifizierung erythroiden Vorläuferzellen im Gewebe verlassen sich auf die Fähigkeit dieser Zellen zu steigen, um red cell Kolonien geben, wenn in Epo-haltigen halbfesten ausplattiert. Ihre erythroiden Vorläuferzellen Nachkommen werden auf der Basis morphologischer Kriterien identifiziert. Keiner von diesen klassischen Methoden erlauben den Zugriff auf eine große Anzahl von Differenzierungs-Stadium-spezifischen erythroiden Zellen für die molekulare Untersuchung. Hier präsentieren wir Ihnen eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und Differenzierung Studium-stage-spezifischen erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt im Zusammenhang mit der frisch isolierten Maus Gewebe. Der Test beruht auf der Zell-Oberflächenmarker CD71, TER119, und auf der durchflusszytometrischen &#39;forward-scatter&#39; Parameter ist das eine Funktion der Größe der Zellen. Die CD71/Ter119 Assay verwendet werden, um erythroiden Vorläuferzellen während ihrer Antwort auf erythropoetischen Stress in vivo-Studie werden zum Beispiel bei anämischen Mäusen oder Mäusen in sauerstoffarmen Bedingungen untergebracht. Es kann auch verwendet werden, um erythroiden Vorläuferzellen direkt in das Gewebe von genetisch veränderten adulten Mäusen oder Embryonen zu studieren, um die spezifische Rolle der modifizierten molekularen Signalweg in Erythropoese zu beurteilen.

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Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und molekulare Analyse von Differenzierungs-Stadium-spezifische murine erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt in frisch geernteten Maus Knochenmark, Milz oder fetale Leber. Der Test beruht auf der Zelloberfläche Marker CD71, TER119 und Zellgröße.

Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

identification-analysis-mouse-erythroid-progenitors-using-cd71ter119

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

32.0K Aufrufe.  University of Massachusetts Medical School. Eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und molekulare Analyse von Differenzierungs-Stadium-spezifische murine erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt in frisch geernteten Maus Knochenmark, Milz oder fetale Leber. Der Test beruht auf der Zelloberfläche Marker CD71, TER119 und Zellgröße.

Serie: Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

A Quantitative Assay für Insulin-exprimierenden Koloniebildende Vorläufern

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, uncoupling of metabolism to generate heat, and secretion of adipokines to regulate whole-body homeostasis and immune responses. Emerging research is identifying important regional differences in the developmental, molecular, and functional profiles of adipocytes located in discrete depots throughout the body. Different properties of the depots are medically relevant since metabolic diseases often demonstrate depot-specific effects. This protocol will provide investigators with a detailed anatomic atlas and dissection guide for the reproducible and accurate identification and excision of diverse mouse adipose tissues. Standardized dissection of discrete adipose depots will allow detailed comparisons of their molecular and metabolic characteristics and contributions to local and systemic pathologic states under various nutritional and environmental conditions.

Adipocytes exist in discrete depots and have diverse roles within their unique microenvironments. As regional differences in adipocyte character and function are uncovered, standardized identification and isolation of depots is crucial for advancement of the field. Herein, we present a detailed protocol for the excision of various mouse adipose depots.

Identifizierung und Zerlegung von diversen Maus-Adipose-Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...