Wir danken den National Institutes of Health (1R21CA138373 und Stand Up to Cancer (SU2C) für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit. HY ist dankbar für das Geschäftsjahr 2009 Elion Award von der American Association of Cancer Research, ein Kimmel Scholar Award der Sidney Kimmel Stiftung für Cancer Research (SKF-08 bis 101) und der National Science Foundation Fakultät Early Career Award (NSF0954819).

1. Cloning Überlegungen <ol><li> Kommerziell hergestellte Oligonukleotide, die die TMD von Interesse durch NheI und BamHI Restriktionsstellen und 5&#39;-phosphorylierten flankiert können in pTox7 (modified in unserem Labor durch Insertion von einem Basenpaar direkt nach dem BamHI 14) (Abbildung 3) verdaut nacheinander ligiert werden mit BamHI und NheI. Ein Beispiel Oligonukleotid ist unten dargestellt: 5&#39;ctagcTMDSEQUENCEg3 &quot; 3 &#39;gTMDSEQUENCEcctag5 &quot; </li></ol> Die TMD-Sequenz sollte 12-24 Rückstände (kürzere Sequenzen wird vermutlich durch den Vektor kodierten hydrophobe Reste verlängert werden). Um die Schnittstelle zu untersuchen, sollten vier Varianten des TMD-Design erstellt, wo sequenzielles Rest Insertionen und Deletionen gleichzeitige Rückstände Ergebnis in Rotation der TMD bezogen auf ToxR. 15,16 Schließlich wird die Arabinose-Konzentration zwischen 0,001 und 0,01% variiert werden sollten (w / v) zu Ermittlung der Konzentration, wo maximale Unterschiede in β-Galactosidase-Signale zwischen verschiedenen TMD Sequenzen beobachtet werden; Testen verschiedener Expression wird empfohlen, unter welchen Bedingungen unterschiedliche Affinitäten am besten unterschieden werden identifizieren können. Neben Arabinose und Antibiotika, können 0,4 mM IPTG verwendet werden, um Unterschiede in der Affinität zwischen verschiedenen TMDs zu verbessern. Die ToxR Messung sollten mindestens in vierfacher Ausfertigung durchgeführt werden. Der ganze Vorgang sollte mindestens dreimal mit verschiedenen Plasmid-Transformationen wiederholt werden. 2. Das Wachstum von Bakterienkulturen <ol><li> Vorsichtig auftauen FHK12 kompetente Zellen (200 ul) auf Eis und Überführung in eine 15 ml Kultur Röhre. Add Plasmid-DNA (200 ng) und inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 30 min. </li><li> Hitze-Schock-Zellen durch Inkubation für 90 s bei 42 ° C, durch Inkubation auf Eis für 2 min folgte. </li><li> Add SOC Media (800 ul) und inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C unter Schütteln (300 rpm) für eine h. </li><li> Impfen 5 ml LB-Medium mit Chloramphenicol (30 ug / ml) und Arabinose (0,0025% w / v) mit 50 ul der Transformation Mischung in 15 ml Kulturröhrchen in dreifacher Ausfertigung. Inkubieren Proben bei 37 ° C unter Schütteln (300 rpm) für 20 h. (Alternativ 5 ul der Kultur kann zu 100 ul Medium in einer 96-Well-Platte zu impfen. Diese Methode ist nützlich, wenn es mit einer großen Anzahl von Proben, obwohl Fehler wird etwas höher sein. Um die Verdunstung, die führen würde vermeiden um Fehler, füllen Sie die äußersten Brunnen mit Medien, sondern verwenden sie nicht für die Proben. Schließlich, Doppel-wrap die Verbindung zwischen dem Deckel und die Platte mit Parafilm). </li></ol> 3. Die Messung der β-Galactosidase-Aktivität <ol><li> Heizen Sie den Platten-Leser bis 28 ° C. </li><li> Übertragen Sie die Z-Buffer in ein Reservoir mit einem großen Pipettenspitze, achten Sie darauf, nehmen nur die obere (wässrige Schicht). Transfer 100 ul frisch zubereitet Z-buffer/chloroform in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Transfer-5 ul jeder Kultur in die Vertiefungen der Platte in vierfacher Ausfertigung. Lassen Sie die Kultur von vier Brunnen, die als leere dienen wird. </li><li> Messen Sie die OD 595 von der Platte auf die Zelldichte zu bestimmen. </li><li> Add 50 ul Z-buffer/SDS in alle Vertiefungen der Platte. Schütteln Sie die Platte in der Platte-Reader für 10 min auf die Zellen zu lysieren. Sicherstellen, dass die Zell-Suspensionen sind nach der Lyse klar und wiederholen das Schütteln Schritt, wenn erforderlich. Unvollständige Lyse schlägt die Z-buffer/chloroform nicht frisch zubereitet. </li><li> Dann werden 50 ul frisch zubereiteten Z-buffer/ONPG in alle Vertiefungen und kehren die Platte auf die Platte Leser und messen OD 405 alle 30 s für 20 min. </li><li> Berechnen Sie β-Galactosidase-Aktivität mit der folgenden Gleichung (wir erinnern uns, um die leeren subtrahieren). Das Verhältnis von OD 405 / min sollte anhand aller Datenpunkte in der OD 405 Bereich von 0,0 bis 1,0 unter Verwendung eines linearen Modells angepasst werden. <img src="files/ftp_upload/2721/2721eq1.jpg" alt="Gleichung 1" /> Miller Einheiten unterscheiden sich manchmal, wenn an verschiedenen Tagen aufgenommen. Deshalb sollte eine Referenz zu konstruieren, wie GpA in jeder Prüfung zu messen. Die Werte können für die Normalisierung der ToxR Werte verwendet werden. </li></ol> 4. Steuerung für die Proteinexpression <ol><li> Führen Western-Blot, auch Protein-Expression von Konstrukten zu überprüfen. Kombinieren Sie 50 ul des dreifachen Kulturen und Zentrifuge (2000 rpm, 4 min) in einer Mikrozentrifuge. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette resuspendieren und die verbleibende Pellet in 2 x Probe Ladepuffer. </li><li> Last 7,5 ul auf einem Standard 8% Gel und Durchführung Elektrophorese bei 125 V für 1 Stunde 5 min. Nach der Übertragung mit anti-MBP HRP-konjugierten Antikörper inkubiert und zu visualisieren, die chimäre Protein ist bei ca. 70 kDa mit einigen Abbauprodukte manchmal um 48 kDa zu sehen beobachtet. Endogene MBP ist auch bei 45 kDa beobachtet (siehe Abbildung 5). </li></ol>5. Control für Proper Membraninsertion Eine Zelllinie Mangel an Maltose bindendes Protein verwendet wird, um eine ordnungsgemäße Membraninsertion des chimären TMD konstruieren zu beurteilen. Wenn auf Minimalmedium mit Maltose gewachsen als alleinige Kohlenstoff-Quelle, Ausdruck nur Zellen eine Membran-Integral-Ausdruck Produkt mit Maltose-Bindungsprotein richtig in das Periplasma befindet sind in der Lage zu wachsen. <ol><li> Transform PD28-Zellen (wie bei FHK12 Zellen beschrieben) und impfen 2 ml LB-Medium. Wachsen die Zellen bei 37 ° C unter Schütteln (300 rpm) über Nacht. </li><li> Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 3500 rpm, 10 min, 4 ° C und Waschen durch Resuspendieren in PBS (2 ml) durch vorsichtiges Pipettieren mit einer großen Spitze oder sanfte Vortexen. Pellet den Zellen (wie oben), mit PBS waschen ein zweites Mal, Pellet-und schließlich in PBS (1 ml) resuspendieren. </li><li> Verwenden Sie 25 ul der resuspendierten Zellen in 5 ml Minimalmedium in dreifacher Ausfertigung und bei 37 zu impfen ° C unter Schütteln (300 rpm). Nehmen OD 595 Lesungen zwischen 15-25 h, ca. alle 2 Stunden durch die Übertragung von 200 ul von jeder Probe in eine 96-Well-Platte und das Lesen mit dem Platten-Leser. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel für die Verwendung des ToxR transkriptionelle Reporter-Assay auf die Oligomerisierung Neigung von Transmembrandomänen in Abbildung 4 zu analysieren. Bisher haben wir die Oligomerisierung von Transmembrandomänen von untersuchten die multispanning Membran-Integral-Protein latent membrane protein-1 (LMP-1) durch verschiedene Techniken, darunter ToxR 14 Transmembrandomäne fünf (TM5) wurde gezeigt, dass eine starke Neigung zur Oligomerisierung aufweisen.; Diese zeichnet sich durch hohe Miller Units, vergleichbar mit der positiven Kontrolle, GPA, eine gut etablierte Dimerisierung Sequenz gezeigt. Eine Mutation in TM5, D150A, reduziert die Fähigkeit der Sequenz oligomerisieren. LMP-1 TM1 nicht wesentlich oligomerisieren und weist einen sehr niedrigen Miller Einheit Signal, gerade über das Signal für leere, nicht-transformierten Zellen FHK12. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Cartoon Darstellung der ToxR Reporter-Assay. Transmembrandomäne (TMD) angetrieben Oligomerisierung Ergebnisse in Dimerisierung von ToxR und Aktivierung von LacZ Transkription. Das Genprodukt von LacZ, können β-Galactosidase als Maß für die Neigung einer TMD zu oligomerisieren quantifiziert werden. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die hydrolytische Spaltung von ONPG von β-Galactosidase Ergebnisse in die Produktion von dem Licht absorbierenden Spezies o-nitrophenolat (ONP). <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Plasmidkarte von pToxR7. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Representative ToxR transkriptionelle Reporter-Assay Analyse der Oligomerisierung Neigung der latent membrane protein-1 Transmembrandomänen. Transmembrandomäne 5 (TM5) oligomerisiert stark, während Transmembrandomäne 1 (TM1) zeigt nur eine schwache Wechselwirkung. Mutation D150A in TM5 reduziert seine Fähigkeit zur Oligomerisierung. GPA ist als eine positive Kontrolle Sequenz für starke Dimerisierung enthalten. Blank stellt transformierten FHK12 Zellen. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Western Blot für die Proteinexpression. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. PD28 Komplementation Test auf korrekte Membraninsertion in das Periplasma zu kontrollieren. Negative Kontrolle stellt ein Konstrukt Mangel an Maltose bindendes Protein.

<ol><li>Parker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+heptahelical+G+protein+coupling+receptors%3A+a+case+for+association+using+transmembrane+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Mini+Rev+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).</li>
<li>Mo, W., Zhang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+human+ATP-binding+cassette+transporters+and+its+potential+significance+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).</li>
<li>von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+topology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein topology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).</li>
<li>Van Horn, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+nuclear+magnetic+resonance+structure+of+membrane-integral+diacylglycerol+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase.</a> Science. 324, 1726-1729 (2009).</li>
<li>Hattori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mg%282%2B%29-dependent+gating+of+bacterial+MgtE+channel+underlies+Mg%282%2B%29+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis.</a> Embo J. 28, 3602-3612 (2009).</li>
<li>Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+distributions+in+integral+membrane+protein+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid distributions in integral membrane protein structures.</a> Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).</li>
<li>Deber, C. M., Goto, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+proteins+into+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding proteins into membranes.</a> Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).</li>
<li>Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+detection+of+hetero-association+of+glycophorin-A+and+its+mutants+within+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane.</a> J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).</li>
<li>Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p, Fritz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerisation+of+the+glycophorin+A+transmembrane+segment+in+membranes+probed+with+the+ToxR+transcription+activator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator.</a> J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).</li>
<li>Russ, W. P., Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOXCAT%3A+a+measure+of+transmembrane+helix+association+in+a+biological+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).</li>
<li>Berger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+motif+for+integrin+transmembrane+helix+association%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Consensus motif for integrin transmembrane helix association.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).</li>
<li>Oates, J., King, G., Dixon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+oligomerization+behavior+of+PDGFbeta+receptor+transmembrane+domain+and+its+regulation+by+the+juxtamembrane+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).</li>
<li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains%3A+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li>
<li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene%2C+latent+membrane+protein+1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , Forthcoming (2010).</li>
<li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+of+the+transmembrane+domain+of+Integrin+alphaIIb+subunit+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes.</a> J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).</li>
<li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li>
<li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li>
</ol>

Die ToxR transkriptionelle Reporter-Assay ist eine einfache Möglichkeit, transmembrane Sequenzen mit dem Potenzial, oligomerisieren identifizieren. Da die Wechselwirkungen innerhalb der bakteriellen inneren Membran stattfindet, umgeht diesen Test die Probleme mit der Gültigkeit der Untersuchung von Systemen in Membran-Mimetikum-Umgebungen. Da das Klonen von mehreren TMDs in einem einzigen Plasmid leicht können parallel ausgeführt werden und der gesamte Test kann in 96-Well-Platte-Format durchgeführt werden, kann dieser Test für hohen Durchsatz-Analyse einer großen Zahl von Protein-Sequenzen verwendet werden. 17 Sobald ein Interaktion erkannt wurde, kann der Schlüssel funktionellen Reste von Mutationsanalyse abgefragt werden, so dass Abbildung der strukturellen Merkmale beteiligt. In vielen Fällen ist kristallographische Analyse der Transmembranproteine ​​problematisch und erfordert alternative Instrumente wie die ToxR Assay auf die molekularen Grundlagen der Funktion zu etablieren.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> BamHI Restriktionsenzym </td><td> Invitrogen </td><td> 15201023 </td><td> Invitrogen Enzyme erwiesen sich als effizienter als alternative Lieferanten </td></tr><tr><td> NheI Restriktionsenzym </td><td> Invitrogen </td><td> 15444011 </td><td> Invitrogen Enzyme erwiesen sich als effizienter als alternative Lieferanten </td></tr><tr><td> 15 mL Kulturröhrchen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 bis 956-1J </td><td></td></tr><tr><td> SOC-Medium </td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td> Bis das entsprechende Volumen auf und sterilisiert durch Autoklavieren. </td></tr><tr><td> LB-Medium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L7275 </td><td> Bis das entsprechende Volumen auf und sterilisiert durch Autoklavieren. </td></tr><tr><td> Chloramphenicol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CO 3 78 </td><td> Stammlösung von 30 mg / mL in Ethanol in Gefrierschrank gelagert </td></tr><tr><td> Arabinose </td><td> Fluka </td><td> 10839 </td><td> Stammlösung von 2,5% (w / v) in Wasser im Gefrierschrank gelagert </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Mallinckrodt Chemicals </td><td> 6858-06 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 .7 H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 63138 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranosid (ONPG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 73660 </td><td></td></tr><tr><td> Z-Puffer </td><td></td><td></td><td> 16,1 g Na 2 HPO 4 5.5g NaH 2 PO 4 0,75 g KCl 0.246g MgSO 4 Machen Sie bis zu 1 l, pH 7,0 </td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200 mL β-Mercaptoethanol, 2 mL Chloroform, machen bis zu 20 ml mit Z-Buffer. Vortex für 1 min, Zentrifuge für 1 min bei 800 Umdrehungen pro Minute. Machen Sie für jede Platte frisch. </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 160 mg SDS in 10 mL Z-Puffer </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> 40 mg ONPG in 10 mL Z-Buffer. Machen Sie für jede Platte frischer </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-MBP monoklonalen Antikörper (HRP-konjugiert) </td><td> NEB </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td> Minimal-Medien mit Maltose </td><td></td><td></td><td> 1 x M9-Salze, 0,4% Maltose, 1 mg / mL Thiamin, 2 mM MgSO 4 </td></tr><tr><td> 96-well Flachboden Platte </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td> Plate-Reader </td><td> Beckman Coulter </td><td> DTX880 Multimode-Detektor </td><td></td></tr><tr><td> Wasserbad </td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td> Schüttelinkubator </td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transmembrane domain oligomerization propensity determined by toxr assay

Die vereinfachte Sicht von Protein Transmembrandomänen lediglich als Anker in Phospholipid-Doppelschichten ist längst widerlegt. In vielen Fällen membrandurchspannende Proteine ​​hochentwickelten Wirkmechanismen entwickelt. 1-3 Ein Weg in die Membranproteine ​​modulieren ihre Strukturen und Funktionen können durch direkten und konkreten Kontakt der hydrophoben Helices bilden strukturierte transmembrane Oligomere. 4,5 Großteil der jüngsten Arbeit über die Verteilung der Aminosäuren bevorzugt in der Membran-Umgebung im Vergleich zu wässrigen Lösung und die verschiedenen intermolekularen Kräfte, die Fahrt Protein-Assoziation. 6,7 Trotzdem Studien der molekularen Erkennung an der Transmembrandomäne von Proteinen immer noch hinter denen der Schwerpunkt gefunden wasserlöslichen Regionen. Eine große Hürde bleibt: Trotz der bemerkenswerten Spezifität und Affinität, die transmembrane Oligomerisierung erreichen können, 8 direkte Messung ihrer Vereinigung ist eine Herausforderung. Traditionelle Methoden angewendet, um das Studium integrale Membranprotein-Funktion kann durch die inhärenten Unlöslichkeit der Sequenzen unter Prüfung behindert werden. Biophysikalische Erkenntnisse aus dem Studium synthetischer Peptide, die Transmembrandomänen gewonnen werden können nützliche strukturelle Einsicht. Allerdings ist die biologische Relevanz des Waschmittels mizellaren oder Liposomen-Systeme in diesen Studien verwendet werden, um Zellmembranen imitieren oft in Frage gestellt; tun Peptide Annahme eines nativen Struktur unter diesen Bedingungen und hat ihre funktionale Verhalten wirklich die Wirkungsweise in einer nativen Membran ? Um die Wechselwirkungen von Transmembran-Sequenzen in natürlichen Phospholipid-Doppelschichten Studie entwickelten die Langosch Labor ToxR transkriptionelle Reporter-Assays. 9 Die Transmembrandomäne von Interesse, wie eines chimären Proteins mit Maltose-Bindungsprotein für die Lage auf dem Periplasma und ToxR ausgedrückt wird, um einen Bericht zu der Grad der Oligomerisierung (Abbildung 1). In den letzten zehn Jahren mehrere andere Gruppen (zB Engelman, DeGrado, Shai) weiter optimiert und wandte diese ToxR Reporter-Assay. 10-13 Die verschiedenen ToxR Assays haben sich zu einem Goldstandard, um Protein-Protein-Interaktionen in Zellmembranen zu testen. Wir hier zeigen einen typischen experimentellen Betrieb in unserem Labor, die vor allem folgende Protokolle, die von Langosch entwickelt durchgeführt. Diese allgemein anwendbare Methode für die Analyse der Transmembrandomäne Selbstassoziation in E. sinnvoll coli, wo β-Galaktosidase Produktion verwendet werden, um die TMD Oligomerisierung Neigung zu beurteilen ist. Bei TMD-induzierte Dimerisierung bindet ToxR die ctx-Promotor verursacht up-Regulierung des LacZ Gen für β-Galactosidase. Eine kolorimetrische Ablesung wird durch Zugabe von ONPG zu lysierten Zellen erhalten. Hydrolytische Spaltung von ONPG von β-Galactosidase Ergebnisse in die Produktion von dem Licht absorbierenden Spezies o-nitrophenolat (ONP) (Abbildung 2).

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Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Ein effizientes Verfahren zur Oligomerisierung Neigung der Single-Pass-Transmembrandomänen (TMD) zu beurteilen ist beschrieben. Chimäre Proteine, bestehend aus dem TMD fusioniert ToxR sind in einer E. coli-Stamm-Reporter zum Ausdruck gebracht. TMD-induzierte Oligomerisierung Ursachen Dimerisierung von ToxR, Aktivierung der Transkription und Produktion von der Reporter-Proteins,-Galactosidase.

Transmembrandomäne Oligomerisierung Anschaffungsneigung durch ToxR Assay ermittelt

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

transmembrane-domain-oligomerization-propensity-determined-toxr

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K Aufrufe.  University of Colorado at Boulder. Ein effizientes Verfahren zur Oligomerisierung Neigung der Single-Pass-Transmembrandomänen (TMD) zu beurteilen ist beschrieben. Chimäre Proteine, bestehend aus dem TMD fusioniert ToxR sind in einer E. coli-Stamm-Reporter zum Ausdruck gebracht. TMD-induzierte Oligomerisierung Ursachen Dimerisierung von ToxR, Aktivierung der Transkription und Produktion von der Reporter-Proteins,-Galactosidase.

Serie: Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Forschung

Genetik

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biochemie

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

Nachweis von Toxin Translokation in den Host-Cytosol von Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Immunologie und Infektion

Demonstration of the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility Tool for Rapid Assessment of Protein Conservation

The US Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) tool is a fast, freely available, online screening application that allows researchers and regulators to extrapolate toxicity information across species. For biological targets in model systems such as human cells, mice, rats, and zebrafish, toxicity data are available for a variety of chemicals. Through the evaluation of protein target conservation, this tool can be used to extrapolate data generated from such model systems to thousands of other species lacking toxicity data, yielding predictions of relative intrinsic chemical susceptibility. The latest releases of the tool (versions 2.0-6.1) have incorporated new features that allow for the rapid synthesis, interpretation, and use of the data for publication plus presentation-quality graphics.
Among these features are customizable data visualizations and a comprehensive summary report designed to summarize SeqAPASS data for ease of interpretation. This paper describes the protocol to guide users through submitting jobs, navigating the various levels of protein sequence comparisons, and interpreting and displaying the resulting data. New features of SeqAPASS v2.0-6.0 are highlighted. Furthermore, two use-cases focused on transthyretin and opioid receptor protein conservation using this tool are described. Finally, SeqAPASS&#39; strengths and limitations are discussed to define the domain of applicability for the tool and highlight different applications for cross-species extrapolation.

Here, we present a protocol to utilize the latest version of the US Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) tool. This protocol demonstrates the application of the online tool to rapidly analyze protein conservation and provide customizable and easily interpretable predictions of chemical susceptibility across species.

Demonstration der Sequenzausrichtung zur Vorhersage über Spezies hinweg Suszeptibilitätstool zur schnellen Bewertung der Proteinkonservierung

The US Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) tool is a fast, freely available, online ...

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion cofactors triggering a dimer-dodecamer transition. Upon metal ion binding, several structural modifications occur in the active site and at the interaction interface, shaping dimers to promote the self-assembly. To observe such modifications, stable oligomers must be isolated prior to structural study. Reported here is a method that allows the purification of stable dodecamers and dimers of TmPep1050, an M42 aminopeptidase of T. maritima, and their structure determination by X-ray crystallography. Dimers were prepared from dodecamers by removing metal ions with a chelating agent. Without their&#160;cofactor, dodecamers became less stable and were fully dissociated upon heating. The oligomeric structures were solved by the straightforward molecular replacement approach. To illustrate the methodology, the structure of a TmPep1050 variant, totally impaired in metal ion binding, is presented showing no further breakdown of dimers to monomers.

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

This protocol has been developed to study the dimer-dodecamer transition of TmPep1050, an M42 aminopeptidase, at the structural level. It is a straightforward pipeline starting from protein purification to X-ray data processing. Crystallogenesis, data set indexation, and molecular replacement have been emphasized through a case of study, TmPep1050H60A H307A variant.

Röntgenkristallographie zur Untersuchung des oligomeren Zustandsübergangs der Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between biomolecules in vitro as well as within cells. In FRET, the efficiency of energy transfer, measured by changes in fluorescence intensity or lifetime, relates to the distance between two fluorescent molecules or labels. Determination of dynamics and conformational changes from the distances are just some examples of applications of this method to biological systems. Under certain conditions, this methodology can add to and enhance existing X-ray crystal structures by providing information regarding dynamics, flexibility, and adaptation to binding surfaces. We describe the use of FRET and associated distance determinations to elucidate structural properties, through the identification of a binding site or the orientations of dimer subunits. Through judicious choice of labeling sites, and often employment of multiple labeling strategies, we have successfully applied these mapping methods to determine global structural properties in a protein-DNA complex and the SecA-SecYEG protein translocation system. In the SecA-SecYEG system, we have used FRET mapping methods to identify the preprotein-binding site and determine the local conformation of the bound signal sequence region. This study outlines the steps for performing FRET mapping studies, including identification of appropriate labeling sites, discussion of possible labels including non-native amino acid residues, labeling procedures, how to perform measurements, and interpreting the data.

The study details the methodology of FRET mapping including the selection of labeling sites, choice of dyes, acquisition, and data analysis. This methodology is effective at determining binding sites, conformational changes, and dynamic motions in protein systems and is most useful if performed in conjunction with existing 3-D structural information.

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: Eine neue Methodik zur Aufklärung globaler Strukturmerkmale

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient association of pore-forming and auxiliary subunits, lateral diffusion, and clustering with other proteins. However, the relationship between lateral diffusion and function is poorly understood. To approach this problem, we describe how lateral mobility and activity of individual channels in supported lipid membranes can be monitored and correlated using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Membranes are fabricated on an ultrathin hydrogel substrate using the droplet interface bilayer (DIB) technique. Compared to other types of model membranes, these membranes have the advantage of being mechanically robust and suitable for highly sensitive analytical techniques. This protocol measures Ca2+ ion flux through single channels by observing the fluorescence emission of a Ca2+-sensitive dye in close proximity to the membrane. In contrast to classical single-molecule tracking approaches, no fluorescent fusion proteins or labels, which can interfere with lateral movement and function in the membrane, are required. Possible changes in ion flux associated with conformational changes of the protein are only due to protein lateral motion in the membrane. Representative results are shown using the mitochondrial protein translocation channel TOM-CC and the bacterial channel OmpF. In contrast to OmpF, the gating of TOM-CC is very sensitive to molecular confinement and the nature of lateral diffusion. Hence, supported droplet-interface bilayers are a powerful tool to characterize the link between lateral diffusion and the function of ion channels.

Single-Molecule Imaging of Lateral Mobility and Ion Channel Activity in Lipid Bilayers using Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol describes how to use TIRF microscopy to track individual ion channels and determine their activity in supported lipid membranes, thereby defining the interplay between lateral membrane movement and channel function. It describes how to prepare the membranes, record the data, and analyze the results.

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

High-resolution imaging techniques have shown that many ion channels are not static, but subject to highly dynamic processes, including the transient ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Biologie

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Transmembrandomäne Oligomerisierung Anschaffungsneigung durch ToxR Assay ermittelt

Zusammenfassung

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Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine in bakteriellen Konjugation

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine durch Transmissionselektronenmikroskopie

Nachweis von Toxin Translokation in den Host-Cytosol von Surface Plasmon Resonance

Demonstration der Sequenzausrichtung zur Vorhersage über Spezies hinweg Suszeptibilitätstool zur schnellen Bewertung der Proteinkonservierung

Röntgenkristallographie zur Untersuchung des oligomeren Zustandsübergangs der Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: Eine neue Methodik zur Aufklärung globaler Strukturmerkmale

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Genetische und biochemische Ansätze für

Transmembrandomäne Oligomerisierung Anschaffungsneigung durch ToxR Assay ermittelt

Zusammenfassung

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Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

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Nachweis von Toxin Translokation in den Host-Cytosol von Surface Plasmon Resonance

Demonstration der Sequenzausrichtung zur Vorhersage über Spezies hinweg Suszeptibilitätstool zur schnellen Bewertung der Proteinkonservierung

Röntgenkristallographie zur Untersuchung des oligomeren Zustandsübergangs der Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: Eine neue Methodik zur Aufklärung globaler Strukturmerkmale

Einzelmolekül-Bildgebung der lateralen Mobilität und Ionenkanalaktivität in Lipiddoppelschichten mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Genetische und biochemische Ansätze für

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine in bakteriellen Konjugation

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine durch Transmissionselektronenmikroskopie