Die Autoren möchten an das Labor von Prof. Anthony Windebank für die gemeinsame Nutzung ihrer Expertise auf DRG Dissektion und Kultur zu danken, sowie Prof. Shaochen Chen für hilfreiche Diskussionen über die DMD-Setup. Diese Arbeit wurde teilweise durch Tulane University und Zuschüsse aus dem Louisiana Board of Regents finanziert (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) und der NIH (NS065374).

1. DMD-Setup <ol><li> Die DMD Bord, UV-Lichtleiter (mit Kollimator) und 4x Objektiv sind alle senkrecht auf einer Schwingungsisolierung Tisch montiert. </li><li> Das UV-Licht führen sollte so eingestellt sein, dass das Licht den Spiegel Array trifft in einem Winkel von 45 ° gegenüber der Ebene der Spiegel, und 24 ° unterhalb der Ebene der Spiegel (Abbildung 1). </li><li> Das Objektiv ist so montiert, dass der Abstand von der DMD auf das Objektiv der Brennweite mit dem Objektiv verbunden entspricht. </li><li> Eine inverse Mikroskop unter dem Objektiv, so dass das gebündelte Licht von der DMD reflektiert wird, kann sichtbar gemacht werden durch das Mikroskop gelegt. Der Abstand vom Objektiv, um die Polymerisation Oberfläche sollte ungefähr dem Arbeitsabstand des Objektivs entspricht. Die Bühne auf dem Mikroskop kann dann verwendet werden, um diesen Abstand anzupassen, um fein Fokus des Bildes werden. Dieser Abstand kann je nach der gewählten Polymerisationstemperatur Oberfläche. </li></ol> 2. Dual-Hydrogel-Konstrukte für das Tissue Explantation Kulturen A. DRG Explantation Haftung <ol><li> Streichen Sie die Wände des 6-well Kollagen beschichteten Zellkultur-Einsätze (Corning) mit Regen-X, wobei darauf zu achten die Membran selbst zu vermeiden. (Alternativ kann auch eine hydrophobe Barriere Stift verwendet werden.) </li><li> Hydrate Einsätze über Nacht mit 1,5 ml Haftung Medium in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. Adhesion Medium Neurobasalmedium mit 10% fötalem Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 0,5 mM L-Glutamin und 20 pg / mL NGF. </li><li> Ernte embryonalen Spinalganglien (DRG) von E-15 Rattenbabys. DRG sollte auf Kollagen beschichtet 6-well-Einsätze beschichtet werden, so viele wie vier pro Einsatz. </li><li> Inkubieren Einsätze für 2 Stunden bis zur DRG Einhaltung der Membran zu ermöglichen. </li></ol> B. Dynamische Maske Photopolymerisation Eine digitale Mikrospiegel (DMD) ist ein 1024 x 768 Array einzelner Spiegel, ähnlich wie in der Projektion Fernsehgeräte, die selektiv reflektiert das Licht auf Spiegel Position. Für unsere Zwecke ist der DMD zu Muster ultravioletten (UV) Licht auf photovernetzbaren Hydrogele verwendet, wodurch vorgebbare Hydrogel-Geometrien in eine einfache und schnelle Weise. Abbildung 1 zeigt den Aufbau des DMD-und UV-Licht-Pfad. Obwohl unsere DMD ist eine eigenständige Einheit, kann das Gerät auch für den Einsatz mit vielen vorhandenen Mikroskope integriert werden. <ol><li> Entfernen Sie alle überschüssige Flüssigkeit aus einfügen, und fügen Sie 500 ul der Polymerisationsmedium Inneren des Einsatzes. Polymerisation Medium enthält 10% PEG (MW 1000) und 0,5% Irgacure 2959 in Neurobasalmedium mit 20 ug / mL NGF und 1% Pen / Strep ergänzt aufgelöst. </li><li> Den Einsatz unter dem DMD-Gerät auf einem Regen-X behandelt Glasträger. </li><li> Legen Sie das entsprechende Schwarz-Weiß-Bild, das als &quot;Fotomaske&quot; auf dem DMD eingesetzt werden, durch den Einsatz der mitgelieferten ALP-3 grundlegenden GUI-Programm. Für unsere Zwecke war ein gabelnden Form gewählt, um für die Umsetzung der Neuriten Leitsysteme ermöglichen. </li><li> Mit einem inversen Mikroskop zur Visualisierung, richten Sie das Gewebe Explantate mit den entsprechenden Speicherort auf der Photomaske mit einer sichtbaren Lichtquelle reflektieren die DMD. </li><li> Schalten Sie das sichtbare Lichtquelle für die UV-Lichtquelle, und beleuchten die PEG-Lösung bis Vernetzung ausreichend ist. (Für den gegebenen Bedingungen und 5,0 Watt / cm 2 trifft auf den DMD, Vernetzung kann in weniger als 55 Sekunden abgeschlossen sein.) Wiederholen Sie für alle vier DRG an dem Einsatz. </li><li> Wash jeder Einsatz dreimal mit sterilem DPBS und 1% Pen-Strep. </li><li> Fügen Sie 1,5 ml Wachstumsmedium unter der Zellkultur-Einsätzen, und lassen Sie sie in einen Inkubator für 30 Minuten ausgleichen. Growth Medium Neurobasalmedium mit 2% B-27, 1% Pen / Strep, 0,5 mM L-Glutamin und 20 pg / mL NGF. </li></ol> C. Secondary Hydrogel Puramatrix <ol><li> Für neuronale Anwendungen, beträgt 1% Puramatrix nach den Anweisungen des Herstellers zu 0,15% in sterilem H 2 O verdünnt und ergänzt mit 1 pg / mL löslich Laminin. </li><li> Alle überschüssige Medien müssen von der PEG Hohlräume, die die DRG Explantate enthalten, mit einem sterilen Wattestäbchen, Kimwipe oder Mikropipette entfernt werden. </li><li> Puramatrix ist es, die PEG Hohlräume mit einer Mikropipette zugesetzt, um den leeren Raum ohne überzulaufen füllen. Je nach Porenvolumen, typischerweise ~ 1 ul pro Konstrukt verwendet wird. </li><li> Puramatrix beginnt der Prozess der Selbstorganisation sofort bei Kontakt mit einer physiologischen Kochsalzlösung, dh die geschwollenen PEG, aber 1,5 ml Wachstumsmedium wird unter dem Einsatz aufgenommen und in den Inkubator für eine Stunde auf insgesamt Gelierung zu gewährleisten. </li><li> Zunächst Puramatrix leicht sauer ist, so verändern die Medien nach einer Stunde, damit der pH-Wert ins Gleichgewicht. </li><li> Medien Veränderungen sind etwa alle 48 Stunden erforderlich. Achten Sie darauf, dass alle Medienaufgenommen unter dem Einsatz, um die Integrität der mechanisch schwach Puramatrix schützen. </li></ol> Agarose <ol><li> Für neuronale Anwendungen ist Agarose auf eine 1% ige Lösung in Wachstumsmedium verdünnt und in einem 60 ° C Wasserbad, bis die Agarose vollständig gelöst hat (~ 1 h). Die Lösung wird dann mit 1 pg / mL löslich Laminin ergänzt. </li><li> Alle überschüssige Medien müssen von der PEG Hohlräume entfernt werden. </li><li> Agarose ist die PEG Hohlräume hinzugefügt, um den leeren Raum ohne überzulaufen füllen. Je nach Umfang der Leere, in der Regel ca. 1 mL pro Konstrukt wird verwendet. </li><li> 1,5 ml Wachstumsmedium vorgekühlte (8 ° C) in einer 6-Well-Platte und die Agarose mit Einsätzen an den gekühlten Medien überführt und im Kühlschrank bei 8 ° C für mindestens 3 Minuten auf Agarose zu ermöglichen Gel. </li><li> Schließlich sind die Einsätze auf 1,5 mL vorgewärmtes Nährmedium (37 ° C) überführt und im Brutschrank bei 37 ° C, mit den Medien erforderlichen Änderungen alle 48 Stunden. </li></ol> 3. Dual-Hydrogel 3D-Zell-Encapsulation Dual-Hydrogel-Verkapselung ist angebracht, wenn mit jeder sich selbst organisierenden Gel. Die photovernetzbaren Gel, in diesem Fall PEG, dient als strukturelle Unterstützung für die geometrische Darstellung des sich selbst organisierenden Gel, zum Beispiel Puramatrix oder Agarose. Einige der Methoden, insbesondere die Art des Gels und die Wahl der Photomaske, wird auf den jeweils gewünschten Anwendung ab. <ol><li> Legen Sie eine entsprechende Maske auf dem DMD. Für unsere Anwendung das Überleben der Zelle, wir haben einfach eine zylindrische Präsentation Puramatrix in der Bildgebung von Zellen zu unterstützen. Forscher studieren Zellsignalisierung interessiert sein könnte in einem Kompartiment Geometrie für die Verbreitung von chemotaktischen Molekülen ermöglichen. Zusätzlich wurde eine grobe Annäherung an eine Arterie dargestellt, um mögliche Anwendung Blutgefäß Forschung zu vertreten. </li><li> Behandeln Sie die Wände aus einem Polyester Zellkultureinsatzes mit Regen-X und unter DMD auf Regen-X beschichtete Folie. </li><li> Add 500 ul der Polymerisation Medium, um die Einlage. Induce PEG Vernetzung durch Bestrahlung mit UV-Licht für 55 Sekunden. </li><li> Wash dreimal mit sterilem DPBS und 1% Pen-Strep. </li><li> Entfernen Sie alle überschüssige Medien aus dem PEG Hohlräume. </li><li> Spin down Zellen in die gewünschte Dichte zu einem Pellet. Es muss darauf geachtet, alle Mittel aus dem Zellpellet vor dem Mischen zu entfernen, da Puramatrix beginnt self-assembly sofort bei Kontakt mit einer Salzlösung werden. Suspend die Zellen im Inneren 0,15% Puramatrix in sterilem H 2 O verdünnt mit 10% Saccharose. </li><li> Spritzen Sie die Puramatrix / Zelle / Saccharose-Gemisch im Inneren Hohlräume in PEG. </li><li> Fügen Sie 1,5 ml Wachstumsmedium unter dem Einsatz, und lassen Sie Gel in Inkubator für 1 Stunde. </li><li> Ändern Medien nach einer Stunde, und ~ alle 48 Stunden danach. </li></ol> 4. Einzel-Hydrogel 3D-Zell-Encapsulation Ein einziger Hydrogel Kapselung wäre angemessen für jede Situation, wo die Zellen im Inneren kann ein photovernetzbaren Hydrogel untersucht werden. <ol><li> Legen Sie eine entsprechende Maske auf dem DMD. Für das Überleben der Zelle Studien haben wir wieder wählte eine grundlegende runde Maske, um einen Zylinder darstellen. Masken ähnlich wie in Methode 4 gezeigt werden konnte wieder für die entsprechende Forschung Feld angelegt werden. </li><li> Gönnen ein Polyester Zellkultureinsatzes mit Regen-X und unter DMD auf Regen-X beschichtete Folie. </li><li> Zellen bei jeder gewünschten Konzentration kann direkt an die 10% PEG-Lösung zugegeben werden, gut mischen, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten. </li><li> Add 500 ul der Polymerisation Medium, um die Einlage. Induce PEG Vernetzung durch Bestrahlung mit UV-Licht für 55 Sekunden. </li><li> Wash dreimal mit sterilem DPBS und 1% Pen-Strep. </li><li> Füllen Sie mit Nährmedium sowohl unterhalb als auch auf der Oberseite des Einsatzes, ändert sich jeden ~ 2 Tage. </li></ol> 5. Thin Film Hydrogel-Polymerisation <ol><li> Legen Sie eine entsprechende Maske auf dem DMD. </li><li> Gönnen eine Kollagen-beschichtete Polyester-Zellkultur-Einsatz mit Regen-X, und am Regen-X beschichtete Folie. </li><li> Ausreichend Polymerisationsmedium gerade bedeckt den Boden des Einsatzes (~ 250-300 ul für 6-Well-Platte-Einsätze). Lassen Sie die Medien, um den Einsatz Membran für 30-45 Minuten bei Raumtemperatur durchziehen. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Polymerisationsmedium aus dem Einsatz mit einer Mikropipette oder Kimwipe. Fügen Sie eine ausreichende Menge an UV-transparent Öl vollständig bedecken den Boden des Einsatzes. Lassen Sie die Einlage für 15-30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, lange genug für die Öl zu einer deutlichen Schicht über dem Polymerisationsmedium Sättigung des Einsatzes Membran bilden. </li><li> Den Einsatz und schieben Sie unter der DMD. Induce PEG Vernetzung durch Bestrahlung mit UV-Licht. Aufgrund der geringen Dicke der PEG-Schicht kann die Vernetzung in weniger als 15 Sekunden bei 5,0 Watt / cm 2 trifft auf den DMD abgeschlossen sein. </li><li&gt; Waschen Sie die Einlage dreimal mit sterilem DPBS und 1% Pen-Strep. (Wenn das Fortbestehen eines öligen Rückstandes ist ein Anliegen, können Sie ein mildes Reinigungsmittel wie Tween 20 (1%) auf den Waschpuffer hinzugefügt werden.) </li><li> Bewahren Sie den Einsatz in einer 6-well Gewebekulturplatte. Add Wachstum mittel-bis suspendierten Zellen, in der gewünschten Konzentration und Pipette ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension in der Zellkultur einfügen, um die gewünschte Zelldichte zu erhalten. Dann fügen Sie genug Wachstumsmedium unter dem Einsatz vollständig zu erhalten Lebensfähigkeit der Zellen (~ 1,5 mL). </li><li> Nach 48 Stunden vergangen sind, waschen Sie die Einlage dreimal mit sterilem DPBS und 1% Pen-Strep keine unadhered Zellen zu entfernen. Ändern Medien etwa einmal alle 48 Stunden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Beispiele für Dual-Hydrogel-Konstrukten, die DRG Explantate werden in Abbildung 2 dargestellt. Beachten Sie, dass zelluläre Migration und Neuriten Erweiterung der Zelle permissive Region des dualen Hydrogel-Konstrukt ist begrenzt. Abbildung 3 zeigt dissoziierten Zellen ähnlich im Dual-Hydrogel-Konstrukte gekapselt. Aufgrund der dynamischen Natur des DMD Photomaske ist die Geometrie für Kapselung nur durch die Abmessungen und die Auflösung der Optik beschränkt. Verkapselung von Zellen wurde auch in einem einzigen photopolymerisierbaren Hydrogel, PEG möglich ist, und eine Live / Dead Lebensfähigkeit Test wurde durchgeführt, wie in Abbildung 4 zeigt. Encapsulation in PEG ist nur als Beispiel gemeint, wie PEG stellt kein ideales Umfeld für Nervenzellen. Daher ist die Lebensfähigkeit der Zellen in unserem PEG-Konstrukte realisiert verständlicherweise gering. Schließlich werden Beispiele zur Nutzung dünne PEG-Filme als gemusterte restriktive Schicht für die Zelladhäsion auf Zellkultur-Einsätzen in Abbildung 5 dargestellt. Darüber hinaus werden Beispiele für mögliche &quot;schlechte&quot; Ergebnisse in Abbildung 6 angeboten. Die Ergebnisse stellen nur einen kleinen Bruchteil der möglichen Anwendungen der Methoden in unserem Labor entwickelt. Sie sollen die Benutzerfreundlichkeit und Vielseitigkeit und die Lebensfähigkeit unseres Ansatzes zu demonstrieren, und könnte als &quot;proof of principle&quot; behandelt werden, für die Forscher ihre eigenen möglichen Anpassungen zu entwickeln. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Lichtweg für die Photolithographie verwendet. Kleines Bild: Das UV-Licht beleuchtet die DMD in einem Winkel von 45 ° und 24 ° unterhalb der Ebene des Spiegels Array. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Labeled Wachstum und die Vermehrung in DRG mit Dual-Hydrogel-Konstrukte. AD) Bilder porträtieren polymerisiert PEG-Konstrukte (grau) mit Neuriten mit Beta III Tubulin (grün), DAPI gefärbten Zellkerne (blau) gekennzeichnet. Die DRG Explantate werden in Puramatrix enthalten und befindet sich in der kreisförmigen Bereiche des Musters, mit Neuriten wachsen in Richtung der Bifurkation (s). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Dual-Hydrogel-Konstrukten, die Zellen mit Calcein AM, ein Live-Zell-Marker, nach 48 Stunden in Wachstumsmedium gekennzeichnet. AD) Verschiedene PEG Formen, mit Puramatrix mit dissoziierten DRG-Neuronen (~ 5x10 3 Zellen / ml) gefüllt. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Einzel-Hydrogel-Konstrukt, das lebende Zellen mit Calcein AM (grün) und toten Zellen mit Ethidium Homodimer-1 (rot) nach 24 Stunden in Wachstumsmedium beschriftet (5x10 3 Zellen / ml) markiert. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Zelle restriktive PEG als dünner Film mit einer &quot;Testbild&quot;, um selektiv haften dissoziierten Zellen, die Kollagen-beschichtete Membran durchlässiger unterstützt polymerisiert. A, B) Lebende Zellen werden nach 48 Stunden mit Calcein AM (grün) gekennzeichnet, während tote Zellen mit Ethidium Homodimer-1 (rot) gekennzeichnet sind. Minimal Zelladhäsion tritt in den Bereich mit der dünnen PEG-Film. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Repräsentative Bilder unerwünschten Ergebnissen führen. A) Teilweise Polymerisation von PEG, was zu einem unbrauchbaren PEG konstruieren. Unsachgemäße Polymerisation kann durch die Anwesenheit eines Meniskus in der Pre-Polymer-Medium, unzureichende Mengen an Polymerisationsmedium, unzureichende UV-Bestrahlung oder unsachgemäße Brennpunkt der Optik auftreten. B) Bild porträtiert polymerisiert PEG-Konstrukte (grau) mit Neuriten mit Beta III Tubulin (grün), DAPI gefärbten Zellkerne (blau) gekennzeichnet. Die Neuriten konnten außerhalb der gemusterten PEG-Kanäle wachsen. Dies geschieht häufig in der Bedingung, dass Puramatrix Overflows auf dem PEG Teil während der Injektion.

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Das hier beschriebene Verfahren kann von jedem Forscher, die einfache und reproduzierbare Zellkultur-Systeme verwendet werden. Theoretisch aufgrund der Vielzahl von photopolymerisierbare Hydrogele zur Verfügung, könnte der Umgebung zugeschnitten für den Einsatz mit jedem Zelltyp, darunter ganze Gewebe Explantate zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht die Dual-Hydrogel-System für verbesserte räumliche Steuerung in der Präsentation der Selbst-Polymerisation von Hydrogelen, die zu amorphen Formen auf ihren eigenen neigen. Die daraus resultierende &quot;2.5D&quot; mikrostrukturierten Hydrogel-Konstrukte bieten eine 3D-Matrix für neuronale Wachstum in einem 2D-Konfiguration, die praktische mikroskopische Auswertung ermöglicht vorgestellt. Der Untergrund, auf dem die Gele polymerisiert werden kann auch variiert werden, was eine größere Kontrolle in experimentellen Designs. Unsere Methoden sind für die Verwendung mit Zellkultur durchlässig unterstützt optimiert, da haben wir eine verbesserte Rentabilität (Abbildung 4) im Vergleich zur Polymerisation auf Glasplättchen (Daten nicht gezeigt). Jedoch können auch andere Polymerisation Flächen werden eher für unterschiedliche Anwendungen: Fertigung auf Glasplättchen in der Mikrofluidik Experimente oder Zellverbandes Formationen, zum Beispiel verwendet. Unsere Erfahrungen mit diesen Systemen Kultur hat zur Identifizierung von potenziellen Problembereichen geführt. Erstens sind sorgfältige Techniken erforderlich, um die Sterilität der Konstrukte zu erhalten. Aufgrund der sperrigen Natur des DMD-Setup, ist es schwierig, Polymerisation Schritte unter sterilen Bedingungen arbeiten. Zur Bekämpfung dieses Problems ist die Spülschritt in den beschriebenen Methoden hilfreich, und Antibiotika sollten in allen Medien verwendet werden. Darüber hinaus ist die endgültige Dicke und Form der polymerisierten konstruieren stark abhängig von der Flüssigkeit Verhalten der Pre-Polymer-Mischung, und das Vorhandensein eines Meniskus kann in Gel-Konstrukte, die zu dünn oder unvollständig polymerisiert (Abbildung 6) sind das Ergebnis. Zwei Schritte können unternommen werden, um die Bildung eines Meniskus in der Zellkultur-Einsätze zu minimieren. Für dicke Hydrogele (&gt; 200 Mikrometer), eine einfache Beschichtung von Regen-X um die Innenwand des Einsatzes ist ausreichend. Doch wie kurz erwähnt, für dünne Konstrukte (&lt;200 um) beschrieben, ist eine Ölschicht erforderlich, um beide zu minimieren des Meniskus und negieren Sauerstoff Abschrecken der radikalischen Polymerisation. Resolution wurde festgestellt, dass abhängig von der Dicke, mit einer Abnahme der Strukturgröße mit immer dickeren Gelen realisiert. Die Auflösung variiert je nachdem, ob die Funktion ein positives oder negatives Relief dargestellt in dem Hydrogel. Allerdings erzielten wir eine ausreichende Auflösung für Konstrukte mit minimalen Strukturbreiten in der Größenordnung von ~ 100 pm nur mit Mikroskop-Objektive als Fokussieroptik. Unsere Experimente haben gezeigt, dass die Dual-Hydrogel-Konstrukte beschrieben hier eine hervorragende Basis für die Bildung von grundlegenden In-vitro-Modelle von Neuritenwachstum und Beratung zu vertreten. Die Mikrostrukturierung verwendete Technik ist eine Anpassung der bestehenden Methoden 18,19, aber unser Set-up betonte ein einfach zu bedienendes Design implementieren und wurde für die Produktion von Dual-Hydrogel-Konstrukte auf Zellkultur-Einsätze optimiert, Zellkultur-Inserts wurden von entscheidender Bedeutung für die Verbesserung der Lebensfähigkeit der Zellen sowie als Vernetzer rund zuvor anhaftendem Gewebe Explantate. Der Umfang der Ergebnisse wird um die Interessen unserer Labor beschränkt, aber wir glauben, dass die Methoden in dieser Publikation beschrieben werden als nützlich erweisen, um Forscher auf der Suche nach einem relativ billig, schnell und einfach zu bedienen Methode für die Herstellung von 3D-Zellkultur Modelle.

<table><tbody><tr><td>Digital Micromirror Device</td><td>Texas Instruments</td><td>DLPD4X00KIT</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Coated Transwell Permeable Support </td><td>Corning</td><td>3491</td><td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td></tr><tr><td>Polyester Transwell Permable Support</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Puramatrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1000</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15178</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td>0298913AB</td><td></td></tr><tr><td>Oil</td><td>Have used both canola oil and silicon oil</td><td></td><td>Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation</td></tr><tr><td>OmniCure Series 1000</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of micropatterned hydrogels for neural culture systems using dynamic mask projection photolithography

Zunehmend werden gemusterte Zellkultur-Umgebungen zu einer relevanten Technik, um zelluläre Eigenschaften zu studieren, und viele Forscher glauben an die Notwendigkeit für 3D-Umgebungen, um in vitro-Experimenten, die besser in vivo Qualitäten 1-3 Mimik darstellen. Studien in Bereichen wie der Krebsforschung 4, Neural Engineering 5, Herzphysiologie 6 und Zell-Matrix-Interaktionen 7,8 haben gezeigt, das Verhalten der Zelle unterscheidet sich wesentlich von traditionellen Monolayerkulturen und 3D-Konstruktionen. Hydrogele sind als 3D-Umgebungen aufgrund ihrer Vielfalt, Vielseitigkeit und die Fähigkeit, maßgeschneiderte molekulare Zusammensetzung durch Funktionalisierung 9-12 verwendet. Zahlreiche Techniken existieren für die Erstellung von Konstrukten als Zell-unterstützenden Matrizen, einschließlich Elektrospinnen 13, Elastomer-Stempel 14, Inkjet-Druck 15, additive Photostrukturierungsverfahren 16, statische Photomaske Projektions-Lithografie 17 und dynamische Maske Mikrostereolithographie 18. Leider beinhalten diese Verfahren mehrere Produktionsschritte und / oder Geräte nicht ohne weiteres zu herkömmlichen Zell-und Gewebekultur-Methoden. Die Technik in diesem Protokoll verwendeten passt die beiden letztgenannten Methoden, mit Hilfe eines digitalen Mikrospiegel (DMD), um dynamische Photomasken für die Vernetzung von geometrisch bestimmten Poly-(Ethylenglykol) (PEG)-Hydrogele, durch UV-initiierte radikalische Polymerisation induziert erstellen. Die daraus resultierende &quot;2.5D&quot;-Strukturen bieten eine eingeschränkte 3D-Umgebung für neuronale Wachstum. Wir beschäftigen ein Dual-Hydrogel-Ansatz, bei dem PEG dient als Zell-restriktiven Region liefern Struktur einer ansonsten formlose, aber Zell-permissive selbst organisierenden Gel entweder Puramatrix oder Agarose hergestellt. Der Prozess ist eine schnelle einfache Schritt Fabrikation, die in hohem Maße reproduzierbar und leicht angepasst für den Einsatz mit konventionellen Zellkultur-Methoden und Substraten. Ganze Gewebe Explantate wie embryonalen Spinalganglien (DRG), können in das duale Hydrogel-Konstrukte für experimentelle Tests wie Neuritenwachstum integriert werden. Darüber hinaus können dissoziierten Zellen in der photovernetzbaren oder selbst Polymerisation Hydrogel verkapselt werden, oder selektiv auf die durchlässige Trägermembran mit Zell-restriktiven Photostrukturierungsverfahren eingehalten werden. Mit der DMD, haben wir Hydrogel-Konstrukte bis ~ 1 mm dick, aber dünner Film (&lt;200 um) PEG-Strukturen wurden durch Sauerstoff Abschrecken der radikalischen Polymerisationsreaktion begrenzt. Daraufhin haben wir eine Technik entwickelt, unter Verwendung einer Schicht von Öl über die Polymerisation Flüssigkeit, die dünn PEG-Struktur Polymerisation erlaubt. In diesem Protokoll, beschreiben wir die rasche Erstellung von 3D-Hydrogel-Systeme zur Herstellung von mikrostrukturierten neuronalen Zell-und Gewebekulturen. Die Dual-Hydrogel-Konstrukte zeigten hier vertreten vielseitig in-vitro-Modellen, die nützlich für Studien im Bereich der Neurowissenschaften mit Überleben der Zelle, Migration und / oder Neuritenwachstum und-richtlinien können. Außerdem ist, wie das Protokoll kann für viele Arten von Hydrogelen und Zellen arbeiten, sind die potenziellen Anwendungen sowohl vielfältig und umfangreich.

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Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Einfache Techniken für die schnelle Herstellung von mikrostrukturierten neuronalen Kultur-Systeme mit Hilfe eines digitalen Mikrospiegel für die dynamische Maske Projektion Lithographie auf regelmäßige Zellkultursubstraten beschrieben. Diese Kultur-Systeme können mehr Vertreter des natürlichen biologischen Architektur, und die beschriebenen Techniken könnten für zahlreiche Anwendungen angepasst werden.

Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogele für Neural Kultur-Systeme mit Dynamic Mask Projektion Photolithographie

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.7K Aufrufe.  Tulane University. Einfache Techniken für die schnelle Herstellung von mikrostrukturierten neuronalen Kultur-Systeme mit Hilfe eines digitalen Mikrospiegel für die dynamische Maske Projektion Lithographie auf regelmäßige Zellkultursubstraten beschrieben. Diese Kultur-Systeme können mehr Vertreter des natürlichen biologischen Architektur, und die beschriebenen Techniken könnten für zahlreiche Anwendungen angepasst werden.

Serie: Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Forschung

Biotechnik

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

Vorbereitung der neuronalen Co-Kulturen mit Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Neurowissenschaften

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), their ultimate clinical use has been hampered by the lack of biologically-relevant degradation observed for most smart materials. This is particularly true for temperature-responsive hydrogels, which are almost uniformly based on polymers that are functionally non-degradable (e.g., poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) or poly(oligoethylene glycol methacrylate) (POEGMA)). As such, to effectively translate the potential of thermoresponsive hydrogels to the challenges of remote-controlled or metabolism-regulated drug delivery, cell scaffolds with tunable cell-material interactions, theranostic materials with the potential for both imaging and drug delivery, and other such applications, a method is required to render the hydrogels (if not fully degradable) at least capable of renal clearance following the required lifetime of the material. To that end, this protocol describes the preparation of hydrolytically-degradable hydrazone-crosslinked hydrogels on multiple length scales based on the reaction between hydrazide and aldehyde-functionalized PNIPAM or POEGMA oligomers with molecular weights below the renal filtration limit. Specifically, methods to fabricate degradable thermoresponsive bulk hydrogels (using a double barrel syringe technique), hydrogel particles (on both the microscale through the use of a microfluidics platform facilitating simultaneous mixing and emulsification of the precursor polymers and the nanoscale through the use of a thermally-driven self-assembly and cross-linking method), and hydrogel nanofibers (using a reactive electrospinning strategy) are described. In each case, hydrogels with temperature-responsive properties similar to those achieved via conventional free radical cross-linking processes can be achieved, but the hydrazone cross-linked network can be degraded over time to re-form the oligomeric precursor polymers and enable clearance. As such, we anticipate these methods (which may be generically applied to any synthetic water-soluble polymer, not just smart materials) will enable easier translation of synthetic smart materials to clinical applications.

Protocols are described for the fabrication of degradable thermoresponsive hydrogels based on hydrazone cross-linking of polymeric oligomers on the bulk scale, microscale, and nanoscale, the latter for preparation of both gel nanoparticles and nanofibers.

Herstellung von abbaubaren Thermoresponsive Hydrogele auf mehreren Längenskalen über reaktive Extrusion, Mikrofluidik, Selbstmontage und Elektrospinnen

While various smart materials have been explored for a variety of biomedical applications (e.g., drug delivery, tissue engineering, bioimaging, etc.), ...

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single cell resolution. Current state-of-the-art single cell micropatterning techniques involve soft lithography and micro-contact printing, which is a powerful technology, but requires trained engineering skills and certain facility support in microfabrication. These limitations require a more accessible technique. Here, we describe a simple alternative lithography-free method: stencil-based single cell patterning. We provide step-by-step procedures including stencil design, polyacrylamide hydrogel fabrication, stencil-based protein incorporation, and cell plating and culture. This simple method can be used to pattern an array of as many as 2,000 cells. We demonstrate the patterning of cardiomyocytes derived from single human induced pluripotent stem cells (hiPSC) with distinct cell shapes, from a 1:1 square to a 7:1 adult cardiomyocyte-like rectangle. This stencil-based single cell patterning is lithography-free, technically robust, convenient, inexpensive, and most importantly accessible to those with a limited bioengineering background.

This protocol introduces a lithography-free micropatterning method that is simple and accessible to those with a limited bioengineering background. This method utilizes customized laser-cut stencils to micropattern extracellular matrix proteins in a shape of interest for modulating cell morphologies. The procedure for micropatterning is demonstrated using induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes.

Einfache Lithographie-freie Einzelzell-Mikromusterung mit Laser-Cut Schablonen

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

Entwicklungsbiologie

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular compartments while circumventing complications arising from natural cell-to-cell variations. To standardize cell shape, cells are either confined in 3D molds or controlled for adhesive geometry through adhesive islands. However, traditional micropatterning techniques based on photolithography and deep UV etching heavily depend on clean rooms or specialized equipment. Here we present an infrared laser assisted micropatterning technique (microphotopatterning) modified from Doyle et al. that can be conveniently set up with commercially available imaging systems. In this protocol, we use a Nikon A1R MP+ imaging system to generate micropatterns with micron precision through an infrared (IR) laser that ablates preset regions on poly-vinyl alcohol coated coverslips. We employ a custom script to enable automated pattern fabrication with high efficiency and accuracy in systems not equipped with a hardware autofocus. We show that this IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol results in defined patterns to which cells attach exclusively and take on the desired shape. Furthermore, data from a large number of cells can be averaged due to the standardization of cell shape. Patterns generated with this protocol, combined with high resolution imaging and quantitative analysis, can be used for relatively high throughput screens to identify molecular players mediating the link between form and function.

The protocol presented here enables automated fabrication of micropatterns that standardizes cell shape to study cytoskeletal structures within mammalian cells. This user-friendly technique can be set up with commercially available imaging systems and does not require specialized equipment inaccessible to standard cell biology laboratories.

Kontrolle der Zellgeometrie durch Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

Mustergenerierung für die Mikromuster-Traktionsmikroskopie

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand distribution and tissue geometry, have been increasingly shown to play critical roles in governing cell phenotype and behavior. However, these environmental cues and their effects on cells are often studied separately using in vitro platforms that isolate individual cues, a strategy that heavily oversimplifies the complex in vivo situation of multiple cues. Engineering approaches can be particularly useful to bridge this gap, by developing experimental setups that capture the complexity of the in vivo microenvironment, yet retain the degree of precision and manipulability of in vitro systems.
This study highlights an approach combining ultraviolet (UV)-based protein patterning and lithography-based substrate microfabrication, which together enable high-throughput investigation into cell behaviors in multicue environments. By means of maskless UV-photopatterning, it is possible to create complex, adhesive protein distributions on three-dimensional (3D) cell culture substrates on chips that contain a variety of well-defined geometrical cues. The proposed technique can be employed for culture substrates made from different polymeric materials and combined with adhesive patterned areas of a broad range of proteins. With this approach, single cells, as well as monolayers, can be subjected to combinations of geometrical cues and contact guidance cues presented by the patterned substrates. Systematic research using combinations of chip materials, protein patterns, and cell types can thus provide fundamental insights into cellular responses to multicue environments.

Traditionally, cell culture is performed on planar substrates that poorly mimic the natural environment of cells in vivo. Here we describe a method to produce cell culture substrates with physiologically relevant curved geometries and micropatterned extracellular proteins, allowing systematic investigations into cellular sensing of these extracellular cues.