Wir danken Lab Mitglieder Jeffrey Adijanto, Tina Banzon, Rong Li, Qin Wan, Congxiao Zhang, Jing Zhao, Connie Zhi, Awais Zia, Natalia Strunnikova um Hilfe bei der Charakterisierung dieser Zellkulturen. Besonderer Dank geht an Jing Zhao, Connie Zhi und Tina Banzon für ihre Hilfe bei der Aufrechterhaltung große Bestände von Zellkulturen. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Intramural Research Program unterstützt.

1. Humane, fötale Gewebe Alle menschlichen Gewebe Forschung folgt den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki und der NIH Institutional Review Board. Fetal Augen sind von einem unabhängigen Auftraggeber, Advanced Bioscience Resources (ABR, Alameda, CA) erhalten, aus zufälligen Spender bei 16 bis 22 Wochen der Schwangerschaft, in RPMI-1640 Medium mit Röhren (von ABR) gestellt, auf Eis gepackt, und geliefert von einem über Nacht Priorität Lieferservice. Gewebe lebensfähig bleiben bis zu 48 Stunden nach der Enukleation. 2. Zellkulturmedium MEM-alpha modifiziertes Medium (Sigma-Aldrich) als Basismedium verwendet werden, um 5% vorbereiten und 15% Serum-haltigen Medien für die Kultivierung von RPE-Zellen (RPE Medium; Tabelle 1 unten). <table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Sigma </td><td> Gibco </td><td> Betrag </td><td> Lagerung </td></tr><tr><td> MEM, Alpha-Modifikation </td><td> M-4526 </td><td></td><td> 500 mL </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> N1 ergänzen </td><td> N-6530 </td><td></td><td> 5 mL </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 mL </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Glutamax - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 mL </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Nicht essentielle Aminosäuren </td><td> M-7145 </td><td></td><td> 5 mL </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> THT * </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td> Taurin </td><td> T-0625 </td><td></td><td> 125 mg </td><td></td></tr><tr><td> Hydrocortison </td><td> H-0396 10 </td><td></td><td> 10 ug </td><td></td></tr><tr><td> Triiod-thyronin </td><td> T-5516 </td><td></td><td> 0,0065 pg </td><td></td></tr><tr><td> Rinderfötenserum ** </td><td></td><td></td><td> 5% oder 15% </td><td> -80 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Humanem fötalen RPE Medium Komponenten zur Darstellung von 500 mL Medium * THT wird durch Auflösen von Taurin-Hydrocortison-Triiod-thyronin in 1 1,5 mL PBS, bevor Sie das Medium aus. Mehrere Aliquots hergestellt und bei -80 ° C bis Kultivierung Vorbereitung des Kulturmediums zu vereinfachen. ** Fötales Rinderserum ist nicht von Sigma-Aldrich oder Gibco erhalten. Rinderfötenserum in Medien Herstellung verwendet wird aus Atlanta Biologicals (Norcross, GA) erhalten. Jede Flasche des Serums hitzeinaktiviertem (56 ° C für 1 Stunde) vor dem Gebrauch. Um sicherzustellen, Zellkultur Konsistenz große Mengen an Serum aus der gleichen Charge gekauft und in -20 ° C bis sie für die Vorbereitung von Medien verwendet werden. Oder 12 - - Well-Platten für ein paar Wochen in Medien mit 20% FBS aus verschiedenen Chargen dünn gesät Zellen aus einer bestimmten Charge von hfRPE Zellen sind in 24 angewachsen. Der am schnellsten wachsende melanated Zellen mit den meisten klassischen RPE Morphologie (Kopfsteinpflaster) deuten auf eine geeignete Serum viel, dass für die Zellkultur eingesetzt werden können. Zellkulturmedium enthält außerdem: N1 Supplement (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / mL, Glutamax / Penicillin-Streptomycin 1:100 mL / mL (Gibco) und essentielle Aminosäure-Lösung (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / mL. Darüber hinaus Hydrocortison (20 ug / L), Taurin (250 mg / L) und Triiod-thyronin (0,013 g / L) (THT) ist vor durch Auflösen dieser drei Komponenten in PBS bis zu einer Endkonzentration von 1:500 vorbereitet (ml / ml). Aliquots von THT sind bei 80 ° C gelagert, bis auf die RPE zugesetzt. 3. Cell Culture Nach Erhalt intakt sind Globen in der Antibiotika-Antimykotikum-Lösung gespült (verdünnt auf 10X;.. Kat.-Nr. 15240-096; Invitrogen) plus Gentamicin (1 mg / mL) für 3 bis 5 Minuten (Abbildung 1 unten). <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Nach der Inkubation Antibiotika off zweimal mit Medium wie HBSS oder PBS gespült. Ein Auge Globus an der Zeit ist, 10 cm Petrischale mit beschichtet mit Sylgard-184 (WPI) übertragen und gesichert mit 27G Nadeln. Mit Clearcut Sideport Messer (Alcon) wird ein Schnitt durch die Lederhaut unter dem Ziliarkörper (3.1 der Entfernung vom Auge Äquator an der vorderen Fläche) hergestellt. Dieser Schnitt wird verwendet, um einen kreisförmigen Schnitt zur Entfernung der vorderen Augenabschnitt zu starten. Dieser Schnitt erfolgt mit einem Wolfram-Karbid beschichtet gebogenen Iris Schere mit einem Messer Wellenschliff (FST). Vor der Entfernung des vorderen Teil des Auges, ist ein Schnitt durch den Glaskörper, um zu verhindern Lösen der retina aus der RPE am hinteren Pol. In 5% Serum enthaltenden Medium für 40-60 Minuten; Nach dem vorderen Teil des Auges entfernt wird, wird der hintere Pol mit Dispase-I-Lösung (.. Roche Diagnostics, Indianapolis, IN 2 U / mL, Kat. Nr. 04942086001) inkubiert in 37 ° C-5% CO 2. Nach Dispase Behandlung werden die hinteren Pole eine HBSS in Petrischalen mit Silikon-Polsterung (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI) übertragen und seziert in Quadranten oder größere Stücke ausreichend abflachen Gewebe. Dann wird die Netzhaut ist vorsichtig mit einer Pinzette entfernt. Einzel-Zell-RPE-Schichten wurden aus in Blätter geschält und direkt in kaltes Trypsin-EDTA (Gibco, # 25200-056)-Lösung gesammelt. Nach dem RPE erhoben werden, sind Rohre mit Gewebe in Trypsin-EDTA versiegelt und in Wasserbad für 10-15 Minuten bei 37 ° C. Nach 10 Minuten Inkubation werden die Rohre kräftig geschüttelt, um RPE in kleinen Gruppen zu trennen. Wenn die Trennung nicht vollständig ist, werden die Rohre wieder in Wasserbad für weitere 5 Minuten gesetzt. Nach Trypsin-EDTA Inkubation werden die Rohre für möglich un-gelösten gemischt Zellhaufen inspiziert. Jede beobachtete Cluster entfernt werden mit feinen Spitzen Glas Pasteur Pipette. Nach Abzentrifugieren (1,4 Umdrehungen pro Minute auf klinischen Zentrifuge für 4 min), sind hfRPE Zellen in 15% RPE Medien resuspendiert und dann in Flaschen Primaria (Beispiel: Kat.-Nr. 08-772-45; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.. ). Dieses Medium ist nach 1 Tag mit 5% Serum-haltigen RPE Medium ersetzt, und nachträgliche Änderungen vorgenommen wurden alle 2 bis 3 Tagen. Nach 3 bis 4 Wochen wurde die Zellen konfluent und gleichmäßig pigmentiert. Sie werden dann in 0,25% Trypsin-EDTA für 10 bis 15 Minuten mit Trypsin behandelt, in 15% Serum-haltigen RPE Zellkulturmedium resuspendiert und ausgesät auf klare Zellkultureinsätzen bei 150 bis 200K Zellen pro Well (Transwell; Corning Costar, Corning, NY), mit 12-mm Durchmesser Einsätze, 0,4-um Poren-, Polyester-Membranen (Beispiel: Kat.-Nr. 07-200-161, Fisher Scientific)... Vor der Aussaat wurden die Vertiefungen mit menschlichen extrazellulären Matrix (.. 10 ug in 150 ul HBSS pro Loch, Kat. Nr. 354237; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) beschichtet und gehärtet mit UV-Licht in der Motorhaube für 2 Stunden. In einigen Fällen wurde die Trypsinierung Verfahren für ein zweites Mal wiederholt, um die Zellen, die nicht nach dem ersten Trypsinierung habe lösen zu sammeln. Das gleiche Protokoll (ohne Beschichtung mit ECM) wurde zur Kultivierung von Zellen auf den Flaschen verwendet, um die P1 Population von Zellen zu generieren. Diese Zellen wurden in Experimenten verwendet werden, wenn sie insgesamt Gewebewiderstand von ≥ 200 Ω • cm 2 hatten und gleichmäßig pigmentiert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">Bitte hier klicken für ein größeres Bild 1</a> . 4. Step by Step Procedures <ol><li> Bereiten 12-Well-Platte mit mehreren Lösungen (für jedes Auge 4 Brunnen erforderlich): <ol class="lalpha"><li> add 10x Antibiotika Antimykotika-Lösung - 1 gut / Auge </li><li> add PBS / HBSS-Lösung für Spülen - 2 Brunnen / Auge </li><li> add Dispase-Lösung - 1 gut / Auge </li></ol></li><li> Bereiten Sie sezieren Petrischale mit dem Auspacken 5 Fixierung Nadeln und füllte es mit HBSS </li><li> Entpacken Sie die Augen und legen Sie sie in Antibiotika-Antimykotikum-Lösung für 3-5 Minuten (hergestellt in Schritt 1) </li><li> Spülen Sie die Augen in zwei Brunnen (hergestellt in Schritt 1) ​​mit PBS / HBSS, übertragen Sie sie anschließend zu zerlegen Gericht. </li><li> Trim übermäßigen Muskel-und Bindegewebe um das Auge herum </li><li> Mit 27G Nadeln sichern (Pin auf Silizium-Basis) in den Augen seziert Gericht passen sie in einer Weise, wo Hornhaut nach oben zeigt. </li><li> Mit Sideport Messer machen Schnitt unterhalb Hornhaut, wo Rundschnitt beginnt </li><li> Mit Iris Schere machen um das Auge herum geschnitten, dann mit derselben Schere durch Glaskörper schneiden und heben vorderen Teil des Auges entfernt. Hinweis: in den Schritten 3 bis 8 vermeiden übermäßige mechanische Druck auf Augapfel. </li><li> Transfer offenen Auges in Dispase-Lösung (hergestellt in Schritt 1) </li><li> Inkubieren Augenmuschel für 40-60 Minuten bei 37 ° C mit 5% CO 2 </li><li> Ersetzen HBSS-Lösung in Sezieren Schüssel mit frischem eins. </li><li> Transfer-Auge von Dispase Lösung Sezieren Gericht. </li><li> Position Auge in Petrischale (Augapfel Tasse nach oben) und mit zwei 27G Nadeln. </li><li> Heben teilweise getrennt Netzhaut und mit Retina-Schere Netzhaut weg von den Sehnerv. Discard Netzhaut. </li><li> Mit Iris Schere machen einen Einschnitt von der Peripherie des Auges in Richtung des Sehnervs. </li><li> Mit allen fünf 27G Nadeln flach Auge macht RPE Schicht schön gestreckt. </li><li> Mit der Netzhaut Schere machen kreisförmigen Schnitt um Sehnerv Trennung RPE-Schicht von der Bindung an Sehnerv. Hinweis: Schritte 13-17 können mit geringer Vergrößerung oder ohne Stereo-Mikroskop durchgeführt werden </li><li> Passen Stereomikroskop 250x Vergrößerungoder mehr und finden Rand des RPE Blatt in der Nähe des Sehnervs entlang der Schnittlinie von Iris Schere gemacht. </li><li> Mit zwei Zangen separaten RPE-Bruch-Membran von der Aderhaut Gewebeschicht. Sie kann verlangen, ein paar Versuche, entlang der Kante, wo die Verbindung von RPE und Aderhaut am schwächsten ist zu finden. </li><li> Legen Sie RPE Blatt in kaltes Trypsin-EDTA-Lösung in 15 ml-Röhrchen </li><li> Nach dem RPE, Kappe und Transfer Rohre mit Gewebe in Trypsin-EDTA in Wasserbad für 10-15min gesammelt werden, bei 37 ° C. </li><li> Nach 10 min Inkubation, kräftig schütteln 15 ml Röhrchen RPE in kleinen Gruppen zu trennen. Wenn die Trennung nicht vollständig ist, statt Röhren wieder in Wasserbad für weitere 5 Minuten. </li><li> Überprüfen Sie die Rohre für möglich un-gelösten gemischt Zellhaufen. Jeder beobachtet Clustern sollten entfernt mit feinen Spitzen Glas Pasteurpipette werden. </li><li> Spin down (1,4 Umdrehungen pro Minute auf klinischen Zentrifuge für 4 min) hfRPE Zellen zu entfernen Überstand und resuspendieren Zellen in 15% RPE Medien (9 mL insgesamt) </li><li> Legen Sie 3 ml Zellsuspension in Primaria Flaschen 2 mL frisches 15% RPE Medien, statt Kolben in Inkubator bis zum nächsten Tag (37 ° C, 5% CO 2) </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Funktionelle Validierung von hfRPE Zellkultur In früheren Experimenten haben wir diese primären Kulturen verwendet, um den Ausdruck, Polarisation und Funktion der Plasmamembran Transportproteine ​​ermitteln und die spezifische Signalwege, die RPE-Funktion zu regulieren 1-11 Diese Eigenschaften, wie sie gesammelt sind, stellen eine Validierung von Eigenschaften, die angewendet werden können zu jeder Zelle Generation. Die Experimente im Folgenden zusammengefasst identifizieren die Proteine, die transepithelialen Transport von Flüssigkeiten und die Integrität des parazellulären Weg zu bestimmen. Diese in-vitro-Experimente wurden in einem Tiermodell der Netzhaut wieder Wiederbefestigung 6 wurde bestätigt. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Lokalisierung von CFTR in hfRPE Zellen Left oberen Platte:. CFTR wurde in hfRPE Zellen mit Membran-angereicherten Extrakten nachgewiesen. M, Molekulargewichtsmarker, Spur 1, große reifen (Band C) und unreife (Bänder A und B) Center unten: Immunfluoreszenz Lokalisation von CFTR (grünes Etikett) Top rechte Tafel: vergrößerte Querschnittsansicht durch die z-Ebene zeigen.. Maximum-Intensitäts-Projektion durch die z-Achse. ZO-1 (gekennzeichnet als rot) dient als Tight Junction-Marker Abgrenzung apikalen und basolateralen Seiten des RPE. DAPI (blau) beschriftet die Kerne in der Nähe der Basalmembran. ZO-1 wird als gelb / orange, seit seiner roten Etikett Überschneidungen grüne Fluoreszenz von CFTR. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. IFNy-induzierten physiologischen Veränderungen in hfRPE A:. Zugabe von IFN &amp;ggr; auf die basale Bad erhöhten transepithelialen Transport von Flüssigkeiten (J v) über Monoschicht von primären, kultivierten Zellen hfRPE J v als Funktion der Zeit in der oberen Kurve und Netto-Flüssigkeit aufgetragen. Absorption (apikal basal Bad) ist durch positive Werte angegeben; transepithelialen Potenzial (TEP) und Gesamt-Widerstand des Gewebes (R T) als Funktion der Zeit in der unteren Spuren gezeichnet. B: Zugabe von CFTRinh-172 (5 pM), um die basale Bad hemmte die IFNy-stimulierte J v erhöhen. Unten ist ein Beispiel für Tiermodell Experimente bestätigt hfRPE in vitro-Befunde. In diesem Experiment wurde künstlich geschaffen Netzhautablösung deutlich nach Zugabe von IFNg nach außen Augenoberfläche (Abbildung 4 A, B) reduziert. Dieser Effekt kann teilweise durch blockiert werden: (1) Zugabe von cAMP-Blocker (Abbildung 4D), (2) vollständig nach Zugabe von JAK + cAMP-Blocker blockiert. Bilder unten sind unter Verwendung Oktober Scanner. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. In vivo Netzhautablösung Experimente. Die Verfahren für diese in vivo Experimente wurden bereits im Detail 6 beschrieben. In diesen Experimenten wurden Netzhautablösungen in Ratte Auge durch Injektion von 0,5-3 ul modifizierter PBS-Lösung in den subretinalen Raum (SRS), allein oder mit einer Kombination von JAK-STAT-und PKA-Inhibitoren geschaffen. Jedes Experiment hatte eine erste Kontrolle Zeitraum von 40-70 min nach der Erstellung der Netzhautablösung. Während dieser Zeit war die Änderungsrate der Blase Volumen gemessen, um bleb Stabilität zu gewährleisten. Optische Kohärenz Tomographie (Institut für Angewandte Physik der Russischen Akademie der Wissenschaften, Nischni Nowgorod, Russland) wurde verwendet, um den zeitlichen Verlauf der Änderung der Lautstärke in SRS messen. Der zeitliche Verlauf der re-attachment volume Änderung wurde durch die optische Kohärenztomographie (OCT) gemessen. OCT-Bilder aus 4 verschiedenen Experimenten (Platten auf der linken Seite; AD), dass eine Veränderung in Ablösung Größen zeigen (Pfeile in A, B und D) nach der Zugabe von IFN &amp;ggr; an der vorderen Fläche für 40-70 min. Die Abbildungen A und B zeigen, dass IFNy Jv erhöhte sich von seiner Kontrolle Rate (≈ 2 ul • cm 2 • h -1), um 14 und 12 ul • cm 2 • h-1 bzw.. Nach Zugabe von JAK-STAT Signalweg und PKA-Inhibitoren (C und D), die IFNy - induzierte Absorption lagen deutlich auf 0,2 und 7,9 reduziert ul • cm 2 • h-1 bzw.. Die Pfeile zeigen die Grenze der Blase zum Vergleich mit dem Bereich innerhalb der gestrichelten Linie umgeben, (ab Band). Rechten Seite von Abbildung: top panel-Zusammenfassung der gemessenen Jv Raten von mehreren Experimenten, Mitteltafel-Film ( <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">hier klicken</a> ); unteren Panel-3D Abschnitte des Experiments in B. Pseudofarben in blau zusammengefasst zeigt die räumliche Ausdehnung der Ablösung zum Zeitpunkt t = 0 und 40 min nach der Zugabe von INFγ. Alle Tierexperimente wurden in Übereinstimmung mit der Association for Research in Vision and Ophthalmology Aussage durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Animal Care und Verwenden des Ausschusses der National Institutes of Health zugelassen.

<ol><li>Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+paradigm%3A+Retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+stem+cells+or+induced+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. , Forthcoming Forthcoming.</li>
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</ol>

In den vorliegenden Experimenten beschreiben wir zusätzliche Änderungen unserer bereits veröffentlichten Techniken 3 ausgelegt, mehrere Schritte notwendig, um konsistente hfRPE primären Kulturen mit einer höheren Anzahl von verfügbaren Zellen pro Auge produzieren zu rationalisieren. Jede Änderung in der ursprünglichen Verfahren wurde rigoros in mehreren Physiologie und Molekularbiologie Experimenten getestet, um sicherzustellen, dass die Änderungen nicht vorstellen Artefakte und wird ständig von vielen anderen Labors die Verwendung dieser Zellen getestet. Schließlich wurden weitere Experimente die In-vitro-Ergebnisse auf ähnliche Störungen vergleichen in Tiermodellen durchgeführt.

Instruments benötigt für die Präparation Protokoll <ol><li> Stereo-Mikroskop - jeder mit arbeiten Vergrößerung x250 für die Präparation benötigt </li><li> Dissecting Gericht - zB Kimble 100 x 20 mm # 23062 (eine pro-Dissektion) jeder beliebigen Quelle </li><li> Sylgard 184 - WPI Cat. # SYLG184 * * Zur Vorbereitung Sezieren Gericht folgen Sylgard 184 enthalten Mischanleitung, pour gemischte Flüssigkeit Elastomer in Petrischale bis 5-8mm bilden. Lassen Elastomer für mindestens 24 Stunden aushärten. Dish mit ausgehärteten Elastomeren kann sterilisiert mit 70% Ethanol und wieder verwendet werden können (~ 100 mal) </li><li> 27 G Nadeln von BD PrecissionGlide 1 ¼ Länge (5 pro Sektion) einer beliebigen Quelle </li><li> HBSS 1X Lösung mit Ca und Mg-Salze - GIBCO Cat # 14025 500ml (gut für mehrere Sektionen). </li><li> Iris Schere Hartmetall Wellenschliff, gebogen - FST Cat # 14559-11 (eins). </li><li> Retinal Schere - Katena Cat # K4-5300 (eins). </li><li> Pinzetten - z. B. Dumont Pinzette # 5 mit polierten Tipps von WPI Cat # 500085 (2 Stück). </li><li> Sideport Messer - Alcon, Clearcut 1mm, Dual Bevel, abgewinkelt Cat # 8065921540. </li><li> Zentrifugenröhrchen 15ml - (einer pro Auge) einer beliebigen Quelle </li><li> Pasteur Glaspipette - (einer pro-Dissektion) jeder beliebigen Quelle </li><li> Die Platte 12 auch (einer pro-Dissektion) jeder beliebigen Quelle </li><li> Primaria 25cm 2-Kolben - (2-3 pro Auge) einer beliebigen Quelle </li></ol>

experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology

Wir haben eine Zellkultur Verfahren, das große Mengen an konfluente Monolayer von primären humanen fötalen retinalen Pigmentepithels (hfRPE) Kulturen mit morphologischen, physiologischen und genetischen Eigenschaften des nativen humanen RPE produzieren kann entwickelt. Diese hfRPE Zellkulturen weisen schwere Pigmentierung und Elektronenmikroskopie zeigen umfangreiche apikalen Membran Mikrovilli. Die junctional Komplexe wurden mit Immunfluoreszenz Kennzeichnung von verschiedenen Tight Junction-Proteine ​​identifiziert. Epitheliale Polarität und Funktion dieser leicht reproduzierbar primären Kulturen ähneln zuvor Säugetieren Modelle von nativen RPE, einschließlich der menschlichen untersucht. Diese Ergebnisse wurden durch die Entwicklung von therapeutischen Interventionen in mehreren Tiermodellen für menschliche Auge Krankheit verlängert. Wir haben uns auf Strategien zur Beseitigung von abnormalen Flüssigkeitsansammlung in der Netzhaut oder subretinalen Raum konzentriert. Die extrazelluläre subretinalen Raum trennt die Photorezeptor äußeren Segmente und der apikalen Membran des RPE und ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Netzhaut-Anhänge und eine ganze Reihe von RPE / Netzhaut-Interaktionen.

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Wir bieten eine reproduzierbare Methode zur Kultivierung konfluente Monolayer von menschlichen fetalen retinalen Pigmentepithelzellen (hfRPE) Zellen, die Morphologie, Physiologie, Polarität und Protein-und Genexpression von adulten nativen Gewebe aufweisen. Diese Arbeit hat zu einem Tiermodell verschiedener Augenerkrankungen erweitert worden.

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.3K Aufrufe.  National Institutes of Health. Wir bieten eine reproduzierbare Methode zur Kultivierung konfluente Monolayer von menschlichen fetalen retinalen Pigmentepithelzellen (hfRPE) Zellen, die Morphologie, Physiologie, Polarität und Protein-und Genexpression von adulten nativen Gewebe aufweisen. Diese Arbeit hat zu einem Tiermodell verschiedener Augenerkrankungen erweitert worden.

Serie: Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms remain elusive mainly due to the lack of a good in vivo model for studying BEST1 and its mutations under physiological conditions. BEST1 encodes an ion channel, namely BESTROPHIN1 (BEST1), which functions in retinal pigment epithelium (RPE); however, the extremely limited accessibility to native human RPE cells represents a major challenge for scientific research. This protocol describes how to generate human RPEs bearing BEST1 disease-causing mutations by induced differentiation from human pluripotent stem cells (hPSCs). As hPSCs are self-renewable, this approach allows researchers to have a steady source of hPSC-RPEs for various experimental analyses, such as immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp, and thus provides a very powerful disease-in-a-dish model for BEST1-associated retinal conditions. Notably, this strategy can be applied to study RPE (patho)physiology and other genes of interest natively expressed in RPE.

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Here we present a protocol to differentiate retinal pigment epithelium (RPE) cells from human pluripotent stem cells bearing patient-derived mutations. The mutant cell lines may be used for functional analyses including immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp. This disease-in-a-dish approach circumvents the difficulty of obtaining native human RPE cells.

Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Forschung

Genetik

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal pigmented epithelium (RPE) is a key pathobiological event in AMD. To understand the mechanisms that lead to RPE dysfunction, mouse models can be utilized by researchers. It has been established by previous studies that mice can develop RPE pathologies, some of which are observed in the eyes of individuals diagnosed with AMD. Here, we describe a phenotyping protocol to assess RPE pathologies in mice. This protocol includes the preparation and evaluation of retinal cross-sections using light microscopy and transmission electron microscopy, as well as that of RPE flat mounts by confocal microscopy. We detail the common types of murine RPE pathologies observed by these techniques and ways to quantify them through unbiased methods for statistical testing. As proof of concept, we use this RPE phenotyping protocol to quantify the RPE pathologies observed in mice overexpressing transmembrane protein 135 (Tmem135) and aged wild-type C57BL/6J mice. The main goal of this protocol is to present standard RPE phenotyping methods with unbiased quantitative assessments for scientists using mouse models of AMD.

Mouse models can be useful tools for investigating the biology of the retinal pigmented epithelium (RPE). It has been established that mice can develop an array of RPE pathologies. Here, we describe a phenotyping protocol to elucidate and quantify RPE pathologies in mice using light, transmission electron, and confocal microscopy.

Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain the overall health and structural integrity of the photoreceptors. The RPE is polarized, exhibiting apically and basally located receptors or channels, and performs vectoral transport of water, ions, metabolites, and secretes several cytokines.
In vivo noninvasive measurements of RPE function can be made using direct-coupled ERGs (DC-ERGs). The methodology behind the DC-ERG was pioneered by Marmorstein, Peachey, and colleagues using a custom-built stimulation recording system and later demonstrated using a commercially available system. The DC-ERG technique uses glass capillaries filled with Hank&#8217;s buffered salt solution (HBSS) to measure the slower electrical responses of the RPE elicited from light-evoked concentration changes in the subretinal space due to photoreceptor activity. The prolonged light stimulus and length of the DC-ERG recording make it vulnerable to drift and noise resulting in a low yield of useable recordings. Here, we present a fast, reliable method for improving the stability of the recordings while reducing noise by using vacuum pressure to reduce/eliminate bubbles that result from outgassing of the HBSS and electrode holder. Additionally, power line artifacts are attenuated using a voltage regulator/power conditioner. We include the necessary light stimulation protocols for a commercially available ERG system as well as scripts for analysis of the DC-ERG components: c-wave, fast oscillation, light peak, and off response. Due to the improved ease of recordings and rapid analysis workflow, this simplified protocol is particularly useful in measuring age-related changes in RPE function, disease progression, and in the assessment of pharmacological intervention.

Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Here, we present a method for recording light-evoked electrical responses of the retinal pigment epithelium (RPE) in mice using a technique known as DC-ERGs first described by Marmorstein, Peachey, and colleagues in the early 2000s.

Direktgekoppeltes Elektroretinogramm (DC-ERG) zur Aufzeichnung der lichtbeschworenen elektrischen Reaktionen des retinalen Pigmentepithels der Maus

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

Chemie

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

Netzhautexplantat der adulten Mausnetzhaut als Ex-vivo-Modell zur Untersuchung neurovaskulärer Netzhauterkrankungen

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

Medizin

Charakterisierung und morphologische Dynamik von kultiviertem primärem murinem RPE

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Autor im Rampenlicht: Effiziente Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen aus adulten Mäusen für die Retinopathie-Forschung

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Neurowissenschaften

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Biologie

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Primärkultur von retinalen Pigmentepithelzellen des Schweins

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and vision. Proteins on the RPE apical surface are tightly associated with proteins on the photoreceptor outer segment surface, making it difficult to consistently separate the RPE from the photoreceptors/retina. We developed a method to efficiently separate the retina from the RPE of human eyes to generate complete RPE/choroid and retina flatmounts for separate cellular analysis of the photoreceptors and RPE cells. An intravitreal injection of a high-osmolarity solution of D-mannitol, a sugar not transported by the RPE, induced the separation of the RPE and retina across the entire posterior chamber without causing damage to the RPE cell junctions. No RPE patches were observed attached to the retina. Phalloidin labeling of actin showed RPE shape preservation and allowed morphometric analysis of the entire epithelium. An artificial intelligence (AI)-based software was developed to accurately recognize and segment the RPE cell borders and quantify 30 different shape metrics. This dissection method is highly reproducible and can be easily extended to other animal models.

We describe a method to efficiently separate retinal pigment epithelium (RPE) from the retina in human eyes and generate whole RPE/choroid flatmounts for histological and morphometric analyses of the RPE.

Effiziente und konsistente Generierung von retinalen Pigmentepithel-/Aderhaut-Flatmounts aus dem menschlichen Auge für die histologische Analyse

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Experimentelle Modelle für das Studium der retinalen Pigmentepithelzellen Physiologie und Pathophysiologie

Zusammenfassung

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Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen

Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

Direktgekoppeltes Elektroretinogramm (DC-ERG) zur Aufzeichnung der lichtbeschworenen elektrischen Reaktionen des retinalen Pigmentepithels der Maus

Netzhautexplantat der adulten Mausnetzhaut als Ex-vivo-Modell zur Untersuchung neurovaskulärer Netzhauterkrankungen

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Effiziente Dissektion und Kultur der primären Maus retinalen Pigmentepithelzellen

Primärkultur von retinalen Pigmentepithelzellen des Schweins

Effiziente und konsistente Generierung von retinalen Pigmentepithel-/Aderhaut-Flatmounts aus dem menschlichen Auge für die histologische Analyse