Die Forschung hat durch die Wallace H. Coulter Foundation Early Career Award in Translational Research unterstützt. Dank Tim Andrews, Pädiatrische Hämatologie / Onkologie, für die Hilfe bei Blutentnahme. Auch dank Dr. Sam Wellhausen, Durchflusszytometrie Core, James Graham Brown Cancer Center, um Hilfe bei der laufenden Durchflusszytometrie Proben.

Teil 1. Microfluidic Bauelementherstellung Ein Silizium-Master-Form der mikrofluidischen Lyse Gerät wurde mit Standard-Photolithographie-Techniken mit dem Gerät in der University of Louisville Reinraum [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, CA) wurde verwendet, um eine Transparenz-Maske erzeugen (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) zu negativen Repliken der Kanäle zu erstellen. Die mikrofluidischen Lyse Gerät wurde von der Silizium-Master-Form mit weichen lithographischen Techniken mit dem Elastomer Poly (dimethylsiloxan) (; Dow Corning, Midland, MI PDMS) hergestellt. Das Elastomer mit den replizierten Kanäle veröffentlicht wurde, und Channel Access Löcher wurden mit einer 20-Gauge-Nadel (Small Parts, Miramar, FL.) Gestanzt. Die PDMS-Wafer wurde irreversibel auf ein Glasplättchen über Sauerstoff-Plasma gebunden und getestet für Experimente. Part 2. Protokoll für den Betrieb Lyse Gerät Nach dem Mikrofluidiksystem hergestellt worden und getestet wurde, sind Experimente mit Erythrozytenlyse bereit zu beginnen. Im folgenden Abschnitt das Protokoll für die Mikrofluidik-Gerät. 2,1 Probengewinnung <ol><li> Sammeln Sie 4 ml der Blutprobe von V. mediana cubiti, auf der vorderen Unterarm Vene des Patienten mit Heparin als Antikoagulans in zwei 2 ml grüne Spitze vaccutainers. </li><li> Discard ersten 2 ml-Tube, wie es verdrängt reifen Endothelzellen (false positives) enthält. </li><li> Resuspendieren der zweiten Röhre an Heparin mit Blut mischen, indem Sie nach oben und unten; sparen sofort auf Eis. </li><li> Transfer 1 ml Blut in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Prozess der Blutprobe sofort (innerhalb einer Stunde nach der Entnahme). </li></ol> 2,2 Prime Mikrofluidikvorrichtung mit PBS <ol><li> Besorgen Sie sich einen Mikrofluidikvorrichtung verklebt auf Glas. Press-fit Zugang Schlauch (Small Parts, Miramar, FL) von etwas größerem Durchmesser in den Ein-und Ausgang (Abbildung 1). </li><li> Bringen Sie einen 30-Gauge-Injektionsnadel (Small Parts, Miramar, FL), um den Schlauch an jedem der Eingänge, die Bereitstellung der Makro bis Mikro-Schnittstelle. </li><li> Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit 1X PBS und vergewissern Sie sich, um loszuwerden, Blasen, die durch flicking die Nadel der Spritze. Schließen Sie das PBS-geladen 1 ml Spritze mit dem Einlass 1 auf der Mikrofluidikvorrichtung. Drücken Sie die Spritze mit dem 1X PBS vorsichtig von Hand, bis die Lösung fließt aus Einlass 2 und dann sofort Klemme Einlass 2 mit einem Standard-Office-Sammelmappe Clip </li><li> Drücken Sie weiter die 1X PBS, bis die Flüssigkeit erreicht die Auslassöffnung des Mikrofluidik-Gerät. Sobald die Lösung fließt aus der Steckdose, klemmen die Ablaufschlauch mit einem anderen Bindemittel Clip. </li><li> Drücken Sie weiter die 1 ml-Spritze, bis die 1X PBS fließt aus Einlaß 3, und klemmen Sie die Einlass-3-Port mit einem anderen Office-Sammelmappe Clip. Die Mikrofluidik-Gerät ist nun komplett grundiert. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Gerätes zeigt Einlässe für die jeweiligen Lösungen und Auslass. 2.3 Herstellung von Spritzenpumpen und Lösung <ol><li> Zur Kalibrierung der Pumpen folgendermaßen vor: <ol class="lalpha"><li> Für die große Harvard Spritzenpumpe (Harvard, PHD 22/2000 Part # 702000): Der Durchmesser Konfiguration bis 22,5 mm, Durchfluss 600 ul / min eingestellt. </li><li> Für den kleinen Harvard Spritzenpumpe (Harvard, Pico Plus Part # 702213): Der Durchmesser Konfiguration auf 4,61 mm, Durchfluss Set 20 ml / min. </li></ol></li><li> Füllen Sie eine 30 ml Spritze mit sterilem, deionisiertem Wasser. Dies kann durch die Rücknahme der Lösung direkt aus der 50 ml konischen Rohr durchgeführt werden. (Label der Spritze) </li><li> Füllen Sie ein zweites 30 ml Spritze mit 2X Phosphat-gepufferter-Saline (PBS), 2% Paraformaldehyd (PFA) unter Verwendung des Verfahrens in Schritt 9 beschrieben. (Label der Spritze) </li><li> Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit 1X PBS aus der Aliquots in der 15 ml konische Röhrchen gelagert, wobei das Verfahren in Schritt 9 beschrieben. </li><li> Verbinden Sie die 30 ml VE-Wasser Spritze mit dem Einlass 2 und die 30 ml 2X PBS Spritze mit dem Einlass 3 (stellen Sie sicher, don t Trap Luftblasen im Schlauch oder Mikrofluidik-Gerät). Entfernen Sie die Klammer aus Buchten 2 und 3 und den Ablaufschlauch. Verbinden Sie den 1X PBS 1 ml-Spritze in den Einlaß 1. Vermeiden Sie die Einführung Blasen, indem die Nadel der Spritze mit Flüssigkeit, verbinden Sie die Spritze, und schnippte die Nadel der Spritze, um Blasen zu befreien. </li></ol> 2,4 Erythrozytenlyse <ol><li> Stellen Sie alle der Spritzen auf dem richtigen Harvard Pumpen, wie unten beschrieben: <ol class="lalpha"><li> Setzen Sie die zwei 30-ml-Spritzen (eine mit steriler, de-ionisiertes Wasser und das andere mit 2X PBS, 2% PFA) zusammen auf der großen Harvard Spritzenpumpe. </li><li> Stellen Sie die 1 ml-Spritze (mit 1X PBS) auf der kleinen Harvard Spritzenpumpe. </li><li> Setzen Sie den Ablaufschlauch in einem Abfallbehälter (50 ml konische Röhre, w beschriftet istaste). </li></ol></li><li> Schalten Sie den großen Harvard Spritzenpumpe (mit 30 ml Spritzen) und lassen Sie ihn eine Minute lang laufen. (Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen und keine Leckage im Gerät oder in den Schlauch). </li><li> Schalten Sie den kleinen Harvard Spritzenpumpe und lassen Sie es für eine weitere Minute laufen. (Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen und keine Leckage im Gerät oder in den Schlauch). Stoppen Sie die Pumpen. Die Mikrofluidik-Gerät ist jetzt einsatzbereit. </li><li> Entfernen Sie den 1 ml-Spritze mit 1X PBS aus dem kleinen Harvard Spritzenpumpe. </li><li> Nach Abnahme der Blutprobe, füllen Sie die 1 ml Spritze mit 0,05 ml sterile 1X PBS ohne Einschluss von Luftblasen. Anschließend füllen Sie die Spritze mit 0,5 ml Blut aus dem Eppendorf-Röhrchen erhalten. (Die 1 ml-Spritze enthält nun ein Volumen von 0,55 ml Blut und 1X PBS-Puffer.) Hinweis: Halten Sie die Spritze senkrecht beim Ausfüllen zu vermeiden Vermischung der 0,05 ml PBS mit dem Blut. </li><li> Verbinden Sie die Spritze mit dem Blut zu Eingang 1 und montieren Sie die Spritze vorsichtig (zu vermeiden drängen das Blut durch den Schlauch in das Gerät) auf dem kleinen Harvard Spritzenpumpe (die Spritze montiert ist vertikal in die Pumpe). </li><li> Entfernen Sie den Ablaufschlauch aus dem Abfall Rohr und legte einen sauberen 50 ml Zentrifugenröhrchen an seinem Platz und stellte es auf einen Eimer mit Eis. </li><li> Schalten Sie das große Harvard Spritzenpumpe erste und lassen Sie es für 1 Minute laufen. Starten Sie das Sammeln der Probe aus der Steckdose in der 50 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Wechseln Sie auf die kleinen Harvard Spritzenpumpe. </li><li> Nachdem die Blutprobe in der 1 ml Spritze vollständig durch das Gerät gereist, stoppen beide Pumpen. Dies dauert etwa 20 Minuten. </li><li> Centrifuge die gesammelten Proben für 5 Minuten bei 350 xg bei Raumtemperatur mit der Bremse ausgeschaltet. </li><li> Entfernen Sie, indem Sie Pipettenspitze auf der gegenüberliegenden Seite des weißen Pellet Überstand. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, vor allem rote Zelltrümmer, ohne die weiße Pellet. </li><li> Resuspendieren der Probe in 1 ml Flow-Puffer (1X PBS, 1% BSA [Rinderserumalbumin], 2% PFA) durch Auf-und Abpipettieren. Transfer-Probe auf ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Microcentrifuge die gesammelten Proben für 5 Minuten bei 4 xg bei Raumtemperatur. Verwenden derselben Präzision wie vor dem Überstand zu entfernen. </li><li> Resuspendieren der Probe in 1 ml Flow-Puffer durch Vortexen. </li></ol> 2.5 Herstellung für die durchflusszytometrische Analyse <ol><li> Für die Probenanalyse mittels Durchflusszytometrie, 100 ul Probe zu einer Durchflusszytometrie Röhre. </li><li> Um die 100 ul Probe hinzuzufügen angegebenen Antikörper (die korrekte Konzentration). </li><li> Lassen Sie Probe für 30 Minuten bei 40 inkubieren C. </li><li> Zweimal waschen mit Durchfluss-Puffer vor der Durchflusszytometrie. Wash Schritt beinhaltet Zugabe von 250 ul der Strömung Puffer, vortexen, Zentrifugieren für 5 Minuten bei 350 xg und Entfernen mit einer Flüssigkeit wiederum der Durchflusszytometrie Rohr Überstand. </li><li> Das Pellet in 250 ul Puffer fließen. Die Probe wird zur Analyse bereit mittels Durchflusszytometrie. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Vollblut wurde durch die mikrofluidischen Lyse Gerät und Post-Processing-Protokoll ausgeführt wurde, befreien von Erythrozyten und bereichernd zirkulierenden Zellen mit Zellkern (CNCs). Ideal Ergebnisse liefern eine saubere Durchflusszytometrie Streudiagramm mit getrennten CNC Populationen. Unten in Abbildung 2 und 3 angezeigt werden Streudiagramm Vergleiche von einer Vollblut-Probe ohne Erythrozytenlyse und mit Erythrozyten-Lyse durch den mikrofluidischen Protokoll mit den Achsen als forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC) Licht. Man erkennt, dass der mikrofluidischen Bereicherung Protokoll notwendig, um eine saubere Durchflusszytometrie Streudiagramm erhalten wird. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Durchflusszytometrie Streudiagramm Vollblutprobe ohne Erythrozytenlyse mit FSC-und SSC-Achsen. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Durchflusszytometrie Streudiagramm der zirkulierenden Zellen mit Zellkern mit mikrofluidischen Erythrozytenlyse von Populationen mit FSC-und SSC-Achsen beschriftet. Region 1 (rot) stellt Lymphozyten, Region 2 (grün) stellt Monozyten, Region 3 (blau) stellt Granulozyten und Region 4 (lila) ist noch nicht charakterisiert werden. Entfernen von roten Zelltrümmern mit einer Pipette in das Protokoll ist auch wichtig, wenn nötig. Unten in Abbildung 4 ist ein Streudiagramm mit einem Überschuss von roten Zelltrümmern. Obwohl nicht trübt die Streudiagramm wie in Abbildung 2, muss man für den zusätzlichen Veranstaltungen durch Erythrozyten-Bruchstücken bei der Datenanalyse Konto. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Durchflusszytometrie Streudiagramm darstellen roten Zelltrümmern, als Cluster zu sehender Ereignisse in Region 5 (cyan). Färben von Zellen für bestimmte Antikörper Phänotyp Marker erzeugen auch charakteristische Ergebnisse. In den folgenden Figuren sind Antikörper Phänotyp Flecken für 3 verschiedene Leukozyten-Populationen: Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten. Abbildung 5 zeigt Lymphozytenpopulationen geplottet mit Äxten CD3 und CD4. Monozyten und Granulozyten sind in den Abbildungen 6-7 mit den Achsen als FSC gegen CD14 und CD66b gezeigt. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Durchflusszytometrie Streudiagramm darstellen Lymphozyten mit CD3-und CD4-Achsen. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Durchflusszytometrie Streudiagramm darstellen Monozyten mit FSC-und CD14-Achsen. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Durchflusszytometrie Streudiagramm darstellen Granulozyten mit FSC-und CD66b-Achsen.

<ol>
	<li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+(SCD.">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li><li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis.">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li></ol>

Ein automatisiertes mikrofluidischen Blut Lyse-Protokoll wurde berichtet. Im Rahmen des Protokolls sind wichtige Schritte erwähnenswert. In Abschnitt P.2.1, ist es wichtig, das erste Blut Fläschchen, da die Probe enthält verdrängt reife Endothelzellen als Fehlalarme gesammelt zu verwerfen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Blutprobe innerhalb einer Stunde nach Probenentnahme durchgeführt. Priming der mikrofluidischen Gerät in Abschnitt P.2.2, ist es wichtig, zunächst der Blasen zu befreien. Darüber hinaus sollte man vermeiden, die Einführung Blasen beim Anbringen neue Spritzen, um die Nadeln in das Protokoll. Beim Füllen der 1 ml Spritze mit Blut in Abschnitt P.2.4, muss man daran denken, fügen Sie zuerst 1X PBS und das Blut, die alle unter Beibehaltung der Spritze senkrecht zur Mischung der beiden Lösungen zu vermeiden. Vor Beginn der Spritzenpumpe Drücken der Blutprobe sicher, dass die große Spritze Pumpe läuft so ist das System bei voller Geschwindigkeit. Nachdem die Probe beendet ist durch das Gerät und wurde zentrifugiert, vorsichtig so viel Überstand wie möglich, einschließlich der roten Zelltrümmern, ohne die weiße Pellet. Schließlich, in Abschnitt P.2.5 des Herstellers folgen s-Protokoll auf die richtige Konzentration des Antikörpers zu gewährleisten ist es, die 100 ul Probe zugegeben. Anwendungen der Mikrofluidik-Protokoll sind in der klinischen Forschung immens. Abfrage des Immunstatus eines einzelnen in Bezug auf CNCs wichtige Informationen generiert unter der Bedingung der Gesundheit und kann bei der Diagnose und das Verständnis der Pathogenese der Erkrankung zu helfen. Der Zugriff auf diese CNC Bevölkerung durch Blutentnahme ist einfacher und bequemer als menschlichen Ausdruck Analysen mit Tumorgewebe. Zur Untersuchung dieser kernhaltigen Zellen im Umlauf muss man in der Lage sein, die Populationen von anderen Blutbestandteilen einschließlich Erythrozyten, die primäre Funktion der gemeldeten Gerät zu bereichern. Daher würden solche Studien von großem Nutzen, der mikrofluidischen Blut Lyse-Protokoll. Bedeutung der Mikrofluidik-Protokoll tritt in Bezug auf Anwendungen. Da kernhaltigen Zelle Bereicherung in klinischen Studien von Blut erforderlich ist, wird ein Protokoll benötigt wenig Know-how und Benutzer-vermittelten Schritte, die klare und konsistente Ergebnisse liefert wichtig. Die Mikrofluidik-Protokoll gewährleistet die Konsistenz durch Automatisierung und kontrollierte Exposition von Zellen gegenüber rauen Umgebungen. Mit Einheitlichkeit unter klinischen Labors Daten werden direkt vergleichbar [2].

automated microfluidic blood lysis protocol for enrichment of circulating nucleated cells

In diesem Bericht das Protokoll für ein automatisiertes mikrofluidischen Blut Lyse Gerät ist detailliert. Zirkulierende kernhaltigen Zellen (CNCs), einschließlich Leukozyten und Endothelzellen, bieten eine ideale Plattform, um einen aktualisierten Status auf das Immunsystem Zustand eines Individuums. Die Mikrofluidik-Protokoll ermöglicht die Anreicherung von CNCs ohne selektive Zellverlust und Probenvorbereitung Variabilität durch Benutzer-vermittelten Schritte. Kurz gesagt, enthält das Protokoll Bauelementherstellung, Probenentnahme-, Geräte-Setup, und läuft das Blut durch den mikrofluidischen Kammer. Innerhalb des Gerätes Vollblut wird schnell mit VE-Wasser für ca. 10 Sekunden in eine 50 micron x 150 micron mikrofluidischen Kanal gemischt. In dieser Zeitspanne werden die Erythrozyten durch hypotone Bedingungen lysiert. Herringbone Strukturen auf dem Boden des Kanals eine gute Durchmischung und Exposition von Zellen, um eine konstante Umgebung. Verbleibende Zellen sind auf isotone Bedingungen an der Ausfahrt des Gerätes zurück, fixiert mit 2% Paraformaldehyd, zentrifugiert, um Erythrozyten Trümmer CNCs trennen und suspendiert in Flow-Puffer für die Färbung und Analyse mittels Durchflusszytometrie. Die Ergebnisse zeigen, sauber Durchflusszytometrie Streudiagramme mit CNC Populationen gerettet. Bedeutung dieses Gerät und Protokoll kommt in der Studie und das Verständnis der Pathogenese der Erkrankung durch eine Analyse der CNC Populationen. Daher sind Automatisierung, Effizienz und Einfachheit der mikrofluidischen Protokoll demonstriert.

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Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät wurde für den Umlauf kernhaltigen Zelle Bereicherung aus dem peripheren Blut über Erythrozytenlyse dass die Isolierung von hoher Qualität Probe stellt sicher, ohne Zellverlust entwickelt.

Automatisierte Microfluidic Blut Lysis-Protokoll zur Anreicherung von zirkulierenden Zellen mit Zellkern

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

automated-microfluidic-blood-lysis-protocol-for-enrichment

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

12.3K Aufrufe.  University of Louisville. Ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät wurde für den Umlauf kernhaltigen Zelle Bereicherung aus dem peripheren Blut über Erythrozytenlyse dass die Isolierung von hoher Qualität Probe stellt sicher, ohne Zellverlust entwickelt.

Serie: Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Anreicherung von NK-Zellen aus menschlichem Blut mit der RosetteSep Kit von StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Forschung

Biologie

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

Halbautomatische PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung zirkulierender Tumorzellen von nicht-kleinen Lungenkrebspatienten durch Immunfluoreszenz

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Krebsforschung

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioenergetik und die Oxidative Burst: Protokolle für die Isolierung und Bewertung der menschlichen Leukozyten und Thrombozyten

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Immunologie und Infektion

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Automatisierte Zellanreicherung des Cytomegalovirus-spezifischen T-Zellen für die klinische Anwendung mit der Zytokin-Capture-System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource to evaluate a variety of pulmonary diseases, both for research and clinical purposes. However, due to the heterogeneous and viscous nature of patient mucus, there is currently no reliable dissociation method that does not damage the host immune cells in the patient airway secretion. In this research, we introduce a sample preparation method that uses inertial microfluidics for the patient&#39;s immune assessment. Regardless of the heterogeneous fluidic properties of the clinical samples, the proposed method recovers more than 95% of neutrophils from airway secretion samples that are diluted 1,000-fold with milliliters of clean saline. By recirculating the concentrated output stream to the initial sample reservoir, a high concentration, recovery, and purity of the immune cells are provided; recirculation is considered a trade-off to the single-run syringe-based operation of inertial microfluidics. The closed-loop operation of spiral microfluidics provides leukocytes without physical or chemical disturbance, as demonstrated by the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced elastase release of sorted neutrophils.

In this research, we demonstrate a label-free neutrophil separation method from clinical airway secretions using closed-loop operation of spiral inertial microfluidics. The proposed method would expand the clinical in vitro assays for various respiratory diseases.

Markierungsfreie Neutrophilenzahl Anreicherung von Patienten abgeleitet Airway-Sekretion mit Closed-Loop Inertial Mikrofluidik

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...