Quantitative Analyse der Mitochondrien-assoziierten Stabilisierung der endoplasmatischen Retikulummembran (MAM) in einem neuronalen Modell der Alzheimer-Krankheit (AD)

Hier beschreiben wir die Messung der axonalen Transportrate von konstitutiven Stabilisatoren von Mitochondrien-assoziierten endoplasmatischen Retikulum (ER)-Membranen (MAMs) durch Erhöhung oder Aufrechterhaltung der neurotoxischen β-Amyloid (Aβ)-Bildung von Neuronen der Alzheimer-Krankheit (AD) in Echtzeit, um als direkte und quantitative Metrik zur Messung der MAM-Stabilisierung zu dienen und die Entwicklung von AD-Therapeutika zu unterstützen.

Eine Methode zur Quantifizierung der Stabilisierung von Mitochondrien-assoziierten endoplasmatischen Retikulummembranen (MAMs) in einem 3-dimensionalen (3D) neuronalen Modell der Alzheimer-Krankheit (AD) wird hier vorgestellt. Zu Beginn werden frische humane Neuro-Vorläuferzellen ReN-Zellen, die β-Amyloid-Vorläuferprotein (APP) exprimieren, das die familiäre Alzheimer-Krankheit (FAD) enthält, oder naive ReN-Zellen in dünnen (1:100) Matrigel-beschichteten Gewebekulturplatten gezüchtet. Nachdem die Zellen die Konfluenz erreicht haben, werden diese mit Expressionsplasmiden elektroporiert, die für das rote Fluoreszenzprotein (RFP)-konjugierte Mitochondrien-bindende Sequenz von AKAP1(34-63) (Mito-RFP) kodieren, die Mitochondrien oder konstitutive MAM-Stabilisatoren MAM 1X oder MAM 9X detektiert, die enge (6 nm ± 1 nm Lückenbreite) bzw. lose (24 nm ± 3 nm Lückenbreite) MAMs stabilisieren. Nach 16-24 h werden die Zellen geerntet und mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) angereichert. Eine gleiche Anzahl von FACS-angereicherten Zellen wird in die 3-dimensionale Matrix (1:1 Matrigel) ausgesät und 10 Tage lang zu reifen Neuronen differenziert. Lebendzellbilder der 10-Tage-differenzierten Zellen, die die RFP-konjugierten MAM-Stabilisatoren exprimieren, werden unter einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen, das mit einer Lebendzell-Imaging-Kulturkammer ausgestattet ist, in der CO_{2 (} 5 %), Temperatur (37 °C) und Luftfeuchtigkeit (~90 %) beibehalten werden. Zu diesem Zweck führten wir Lebendzellbildgebung und kymographische Analysen durch, um die Motilität von freien Mitochondrien zu messen, die mit Mito-RFP oder ER-gebundenen Mitochondrien von engen oder lockeren Lückenbreiten markiert wurden, die durch MAM 1X bzw. MAM 9X stabilisiert wurden, und zwar im ausgedehntesten neuronalen Prozess jedes ReN GA-Neurons, der mindestens 500 nm lang ist, wobei diese als Axone betrachtet werden.

Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die spezialisierten Mitochondrien-assoziierten endoplasmatischen Retikulumkontakte (MERCs), die biochemisch als Mitochondrien-assoziierte ER-Membranen geerntet werden und oft als MAMs bezeichnet werden ^1,2, eine Rolle bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen spielen, einschließlich AD ^3,4. Diese MAMs bestehen aus cholesterinreichen, lipidfloßartigen Mikrodomänen im ER und der äußeren Membran der Mitochondrien, die durch eine Reihe von Proteinen angebunden sind, die strukturelle und funktionelle Unterschiede zwischen den MAMs erzeugen ^5,6,7. Die kürzlich geprägte MAM-Hypothese postuliert, dass die Zunahme von MAMs zu einer erhöhten Aβ-Produktion und der pathogenen Kaskade von AD führt, einschließlich der Bildung von neurofibrillärem Tangle (NFT), Kalziumdyshomöostase und Neuroinflammation ^3,8. Etwa 5%-20% der Mitochondrien nehmen physischen Kontakt mit dem ER auf, um MAMs^{zu bilden 9}. Die Spaltbreite der MAMs wird durch das glatte bzw. raue ER (sER bzw. rER) bestimmt. Die variable Lückenbreite zwischen sER-Mitochondrien (10-50 nm) und rER-Mitochondrien (50-80 nm) deutet darauf hin, dass die Lückenbreite von MAMs ein langes Spektrum aufweist, das von eng (~10 nm) bis locker (~80 nm)10,11,12,13 reicht. Die MAM-Spaltweite bestimmt die MAM-Funktionen, wie z.B. die Calciumhomöostase und den Lipidtransport ^1,14. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht hat gezeigt, dass die MAMs, die zwischen eng (~10 nm) verbundenen ER und Mitochondrien gebildet werden, sogenannte vollständige MAMs, apoptotisch sind. Im Gegensatz dazu sind MAMs, die zwischen lose verbundenen (~25 nm) ER und Mitochondrien gebildet werden, die als defekte oder mittlere MAM bezeichnet werden, anti-apoptotisch 14,15,16. Die Stabilisierung von MAMs mit einer Lückenbreite von 6 nm ± 1 nm erhöhte die Aβ-Generierung aus einem neuartigen 3-dimensionalen (3D) neuronalen Kulturmodell der AD. Im Gegensatz dazu hat die Stabilisierung von MAMs mit einer Spaltbreite von 24 nm ± 3 nm keinen Einfluss auf die Aβ-Generation¹⁷. Dieser Befund deutet zum ersten Mal darauf hin, dass die Regulierung des Grades der MAM-Stabilisierung, aber nicht die Destabilisierung der MAMs, der Schlüssel zur Regulierung der Aβ-Erzeugung ist. Ein Versuch, MAMs vollständig zu destabilisieren, kann unerwünschte Folgen haben, da MAMs mehrere zelluläre Ereignisse aufrechterhalten, die für das Überleben der Zellen entscheidend sind¹².

Die Modulation von MAMs ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet mit potenziellen Auswirkungen auf verschiedene Erkrankungen, darunter Krebs, Stoffwechselstörungen und neurodegenerative Erkrankungen¹⁸. Trotz der Verfügbarkeit vieler MAM-Modulatoren wurde bisher kein größerer Versuch unternommen, ihre Fähigkeiten zur Destabilisierung von MAMs und zur Senkung der AD-Pathologie zu testen, vor allem, weil die strukturelle Vielfalt der MAMs sie zu einem hochkomplexen System für die Wirkstoffforschung macht. Die neu entwickelte Pharmakologie der Struktursysteme, die die spezifischen Eigenschaften der Wirkstoffziele und ihrer Umgebung berücksichtigt^18,19, sollte jedoch die Schwierigkeiten überwinden und hochwirksame Medikamente entwickeln, die auf MAMs oder MAM-assoziierte Proteine bei AD abzielen. Die Suche nach einem effektiven Modulator der MAM-Stabilisierung erfordert jedoch Methoden, um den Grad der MAM-Stabilisierung genau zu quantifizieren. Traditionelle Techniken wie die Elektronenmikroskopie (EM) oder die hochauflösende Mikroskopie haben Grenzen bei der Bestimmung der MAM-Stabilisierung. Um diese Herausforderungen zu meistern, wäre wahrscheinlich die Entwicklung neuartiger, dynamischerer Bildgebungsverfahren oder biochemischer Assays erforderlich, die quantitative Messungen der MAM-Stabilisierung in lebenden Zellen liefern können. Die fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) von primären Neuronen zeigte, dass das ER dazu neigt, ein Netzwerk um die Mitochondrien zu bilden, das wahrscheinlich die mitochondriale Motilität einschränkt^20,21. Die Störung der mitochondrialen Transportsysteme, entweder retrograd, anterograd oder beides, hatte einen tiefgreifenden Einfluss auf die synaptische und neuronale Funktion²². Daher wird die neuartige Lebendzellbildgebung und kymographiebasierte Analyse der axonalen Geschwindigkeit von ER-gebundenen Mitochondrien, die hier als Metrik zur quantitativen Messung der MAM-Stabilisierung beschrieben wird, die Identifizierung von MAM-Modulatoren erleichtern, die die MAM-Stabilisierungsschwelle auf eine verschieben können, die die Aβ-Erzeugung beibehält oder möglicherweise senkt, anstatt sie zu erhöhen.

Neuronale AD-Kulturmodelle: In dieser Studie wurden Neuronen verwendet, die von menschlichen neuralen Vorläuferzellen der ReN [naive ReN (Millipore)] oder ReN-Zellen abstammen, die familiäre AD (fAD)-Mutationen im Amyloid-Vorläuferprotein (APP)-Gen (APP^Swe/Lon), ReN GA-Zellen, exprimieren. Das dreidimensionale (3D) Kultursystem ReN-GA rekapituliert die AD-Pathologie, nämlich Aβ-Oligomer-getriebene neurofibrilläre Tangles (NFTs) ^23,24. Naive ReN-Zellen sind kommerziell erhältlich. Die ReN GA-Linien wurden von Dr. Doo Y. Kim, außerordentlicher Professor am Massachusetts General Hospital (MGH)23,24,25 bezogen.

Expression von Plasmiden: AKP1 (34-63) und ER-targeting-Sequenz von Ubc 6 (283-303) Proteinen, die direkt mit RFP verknüpft sind (Mito-RFP-ER als MAM 1X bezeichnet) oder einen 9-Aminosäure-Linker (Mito-9X-RFP-ER bezeichnet als MAM 9X) enthalten, der zur Stabilisierung von MAMs von 6 nm ± 1 nm bzw. 24 nm + 3 nm Spaltbreite ausgelegt ist^15,26 (Abbildung 1A).

1. Elektroporation

1. Transfizieren der Zellen mit MAM-Stabilisatoren (1-2 h)
   HINWEIS: Befolgen Sie das vom Hersteller des Nukleosektor-Kits beschriebene Protokoll (Tabelle der Materialien). Bereiten Sie vor Beginn 6-Well-Kulturschalen mit Glasboden vor, die mit DMEM/F12 mit 1 % Matrigel (im Folgenden als Basalmembranmatrix [BMM] bezeichnet) vorbeschichtet sind. Verwenden Sie 2 ml BMM, um jede Vertiefung zu beschichten. Mindestens 1 h bei 37 °C inkubieren. BMM, Medien, Pipettenspitzen und Pipetten sollten vor dem Mischen vorgekühlt werden, um ein Verfestigen von BMM zu verhindern.
   1. Das BMM-Gemisch ansaugen. Ersetzen Sie es durch 2 ml DMEM/F12 bei Raumtemperatur (RT) in jeder Vertiefung.
   2. Kombinieren Sie Nucleofector mit Supplement 1 in einem Verhältnis von 4,5:1 (82 μl:18 μl Nukleofector/Supplement-Verhältnis für 100 μl Lösung). Für jede gewünschte Transfektion werden 100 μl Nukleofector benötigt.
   3. Vortex-DNA. Geben Sie dann für jede Transfektion 1-5 μg DNA (pro Behandlung) in 1-ml-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.
   4. Verwenden Sie Acustase, um eine Platte mit gesunden ReN-GA-Zellen zu ernten.
      HINWEIS: Plattenzellen in Expansionsmedien (Tabelle 1) in 100-mm-Gewebekulturschalen geben und warten, bis die Konfluenz 70-80% erreicht.
      1. Saugen Sie das vorhandene Medium an und waschen Sie es einmal mit 10 mL PBS.
      2. 1 ml Akutase direkt in die Zellen geben und 5-10 Minuten bei 37 °C inkubieren.
      3. Entferne Zellen aus der Schale, indem du vorsichtig auf die Seite der Schale klopfst. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen gelockert und frei fließen.
      4. Akutase mit 10 mL DMEM/F12 neutralisieren und in ein sauberes 15 mL Röhrchen überführen.
      5. Zentrifugieren Sie die erforderliche Anzahl von Zellen bei 274 x g für 5 min und aspirieren Sie den Überstand, um abgestorbene Zellen zu entfernen. Dann resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL DMEM/F12.
   5. Zählen Sie die Zellen, um die Dichte zu bestimmen.
      HINWEIS: In dieser Studie wurde ein automatisierter Zellzähler verwendet, um die Anzahl der Zellen zu zählen. Pro Elektroporation werden 3-5 x 10⁶ Zellen benötigt (z. B. würden 5 Behandlungen 15-25 x 10⁶ Zellen erfordern).
      1. Nehmen Sie 10 μl der suspendierten Zellen und fügen Sie sie auf Seite A einer Zellzählkammer hinzu. Geben Sie dann 10 μl zu Seite B.
         HINWEIS: Fügen Sie die Zellsuspension hinzu, indem Sie die Pipette zur Seite neigen. Vermeiden Sie Blasen, indem Sie nicht über den ersten Anschlag am Kolben der Pipette hinaus drücken.
      2. Nehmen Sie die gefüllte Zählkammer zum Zellzähler und stecken Sie Seite A in den Hauptschlitz an der Vorderseite.
      3. Notieren Sie sich nach dem Drücken von Measure die Anzahl der Zellen pro ml.
      4. Nehmen Sie die Kammer heraus, klappen Sie sie auf Seite B und wiederholen Sie die Schritte 1.1.5.2-1.1.5.3.
      5. Addieren Sie diese beiden Zahlen zusammen, dividieren Sie sie durch 4 (wenn Sie kein Trypanblau verwenden) und multiplizieren Sie die Zahl mit den Millilitern Flüssigkeit, in denen die Zellen suspendiert sind, um die Gesamtzahl der Zellen in der Suspension zu erhalten.
   6. Die erforderliche Anzahl von Zellen bei 274 x g für 5 min zentrifugieren und den Überstand aspirieren.
   7. Das Pellet wird in 100 μl Nukleofektormischung pro Elektroporation resuspendiert. (z. B. 500 μl für 5 Behandlungen).
      HINWEIS: Wenn Sie die Zellen länger als 15 Minuten in der Nukleofector-Lösung belassen, kann dies die Lebensfähigkeit und Gesamtwirksamkeit der Zellen verringern.
   8. 100 μl der Zellsuspension werden in eines der Röhrchen mit der DNA gegeben und durch Pipettieren gemischt.
   9. Das DNA-Gemisch in eine Elektroporationsküvette umfüllen und mit dem mitgelieferten Deckel verschließen. Um Blasenbildung zu vermeiden, neigen Sie die Küvette nach unten und pipettieren Sie langsam.
   10. Wählen Sie das Nucleofector-Programm aus, das für das verwendete Gerät geeignet ist. Verwenden Sie für das in dieser Studie verwendete Gerät das Programm A-033 für die Transfektion. Probieren Sie zur Optimierung alle 5 Nucleofector-Programme aus, um das für jeden Zelltyp am besten geeignete zu ermitteln.
       HINWEIS: Eine Bestätigung für eine erfolgreiche Elektroporation ist sichtbarer Schaum an der Oberseite der Mischung.
   11. Geben Sie sofort mit den mitgelieferten sterilen Pipetten ~500 μL des DMEM aus der vorgefüllten 6-Well-Platte in die Küvette. Einmal vorsichtig mischen und dann die elektroporierten Zellen und das Medium in die entsprechende Vertiefung geben.
       HINWEIS: Nach der Elektroporation sind die Zellen extrem empfindlich, daher ist ein schneller Transfer des Mediums und ein vorsichtiges Pipettieren unerlässlich.
   12. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.8 bis 1.1.11 für alle verbleibenden DNA-Behandlungen.
   13. Die Zellen werden über Nacht bei 37 °C in Gegenwart von CO₂ (5%) inkubiert.
   14. Tauschen Sie am nächsten Tag Medien mit frischen Differenzierungsmedien aus (Tabelle 2) und lassen Sie die Zellen 10 Tage lang differenzieren. Alle 2-3 Tage durch frisches Medium ersetzen.

2. Bildgebung von lebenden Zellen

1. Vorbereitung der Zellen für die Lebendzellmikroskopie (30 min)
   1. Vorbereitung der Lebendzellkammer (vor dem Umsetzen der Zellen in die Kammer)
   2. Stellen Sie sicher, dass der CO_{2 -} Tank und der Luftbefeuchter an der Kammer befestigt sind, die Ventile geöffnet und die Tanks gefüllt sind.
   3. Stellen Sie die Temperatur auf 37 °C, den CO₂ auf 5 % und die Luftfeuchtigkeit auf 95 % ein. (Es kann einige Zeit dauern, bis sich die Niveaus ausgeglichen haben.)
   4. Platzieren Sie eine 6-Well-Platte mit Zellen in der Kammer und stellen Sie den Fokus des Mikroskops ein, bis die Zellen sichtbar werden.
   5. Schalten Sie den Laser ein (Tabelle der Materialien).
   6. Um das RFP-Signal zu erfassen, regen Sie das Fluorophor mit einem 594-nm-Laser an und verwenden Sie eine Emission von 570-640 nm. Verwenden Sie für GFP einen 488-nm-Laser zur Anregung und 510-540 nm-Emission.
   7. Passen Sie mit dem eingebauten Leuchtstofffilter die Signalintensität an, bis das Hintergrundsignal abgeklungen ist (sollte fast durchgehend schwarz sein).
2. Aufnahme von Live-Videos von Axonen (insgesamt 10 h-15 h)
   HINWEIS: Für die Aufnahme von Fluoreszenzbildern mit der NIS Element AR-Software wurde ein inverses konfokales Mikroskop Nikon C2 Eclipse Ti2 verwendet. Verwenden Sie eine 60-fache Vergrößerung bei einer Auflösung von 512 Pixeln und nehmen Sie Videos mit 1 Bild pro Sekunde für 3 Minuten auf, um sauberere Kymographen zu erzeugen.
   1. Finden Sie eine Zelle, die RFP-Biosensoren exprimiert. Exportieren Sie ein Bild der Zelle, um es später zu verwenden, bevor Sie ein Video aufnehmen.
   2. Schneiden Sie den Scanbereich so zu, dass er um das Axon passt. Die Verwendung eines kleineren Scanbereichs reduziert die Bearbeitungszeit des Mikroskops und erleichtert die Kymographie-Generierung erheblich.
   3. Schalten Sie alle Laser aus, damit die Software reibungsloser läuft. Bitte beachten Sie, dass beim Ausführen des Programms mit allen aktiven Lasern nicht alle Frames erfasst werden.
      HINWEIS: Das rote Fluoreszenzsignal vom Soma ist viel heller als im Axon. Daher wird das Soma ausgeschlossen, um die Gesamtsignalintensität im Axon zu erhöhen. Wechseln Sie zur Registerkarte Zeitmessung .
   4. Legen Sie das Intervall auf 1 Bild pro Sekunde fest, und legen Sie die Gesamtzeit auf 181 s fest.
   5. Klicken Sie auf Ausführen.
   6. Speichern Sie diese Datei als .nds-Datei (ordnungsgemäß beschriftet) und wiederholen Sie den Vorgang ~10 Mal pro MAM-Stabilisator (MAM 1X oder MAM 9X).
      HINWEIS: Die Stärke des Lasers führte manchmal zu einem spürbaren Bleicheffekt auf dem RFP-Signal, wenn er zu lange gescannt wurde. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten, um Videos aufzunehmen.

3. Nachbearbeitung (7 Tage)

HINWEIS: Zur Analyse des Transports und zur Generierung von Kymographen wurden Fiji ImageJ-Makros verwendet. Vesikel, die sich weniger als 0,1 mm/s bewegten, wurden als stationär kategorisiert. Die Häufigkeit der Partikelbewegung wurde berechnet, indem die Anzahl der Partikel, die sich in eine bestimmte Richtung (anterograd, retrograd) oder nicht bewegten (stationär) bewegten, durch die Gesamtzahl der im Kymographen analysierten Partikel dividiert wurde. Die Zeit, die jedes Vesikel mit einer Pause oder Bewegung verbracht hat, wurde berechnet, indem der Prozentsatz der Zeit, die in jeder Bedingung verbracht wurde, für alle Vesikel in jedem analysierten Neuron gemittelt wurde. Die Häufigkeitsverteilung für Geschwindigkeit und Lauflänge wurde berechnet, wobei für jede experimentelle Bedingung nur bewegliche Vesikel verwendet wurden. Die Analyse wurde an 100 mm Axonalbahnen für 3 min durchgeführt.

1. Generieren eines Kymographen
   1. Öffnen Sie die .nds-Datei in Fiji ImageJ.
   2. Gehen Sie zur Registerkarte Bild und klicken Sie auf Eigenschaften. Notieren Sie das Pixel-zu-Mikron-Verhältnis. Dies wird für die spätere Berechnung benötigt.
   3. Klicken Sie auf Datei > Speichern unter > Tiff , um die Datei als .tiff in ihrem Ordner zu speichern (das Makro speichert automatisch alles, was in diesem Ordner generiert wurde).
   4. Ziehen Sie das Kymo-Makro in ImageJ. Der Code wird in der ergänzenden Codierungsdatei 1 bereitgestellt. Klicken Sie auf Ausführen.
   5. Klicken Sie nicht auf OK. Wechseln Sie in das MAX_raw Fenster. Klicken Sie manuell mit der linken Maustaste entlang des Axons und doppelklicken Sie, um die Verfolgung zu beenden.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie das Axon vom Soma bis zum Axonterminal verfolgen. Auf diese Weise werden die anterograden und retrograden Berechnungen korrekt sein.
   6. Drücken Sie den Befehl T oder Hinzufügen auf dem ROI-Manager.
   7. Klicken Sie nun auf OK. Ein Kymograph wird in dem zuvor erstellten Ordner generiert. (Die X-Achse ist die Axonlänge in Mikrometern und die Y-Achse die Zeit in Sekunden).
2. Dem Kymographen auf der Spur
   1. Ziehen Sie den Kymographen in Fiji Image J (er sollte automatisch in dem zuvor erstellten Ordner abgelegt werden).
   2. Ziehen Sie das Spurmakro in Bild J.
   3. Klicken Sie in der folgenden Eingabeaufforderung auf OK. Wenn Sie die Arbeit von zuvor fortsetzen, geben Sie den Zahlenpunkt ein, von dem aus fortgefahren werden soll, und drücken Sie dann OK.
   4. Wählen Sie mit dem Rechteck-Werkzeug in der Auswahlgruppe einen Bereich in der Nähe der Mitte des Kymographen aus, der 60 Pixel hoch ist und immer 100 μm groß ist. Teilen Sie dazu 100 durch das Pixel-Mikro-Verhältnis, das in Schritt 3.1.2 aufgezeichnet wurde.
   5. Nachdem Sie einen Bereich ausgewählt haben, drücken Sie Strg T , um i t zum ROI hinzuzufügen und den ROI in dem Ordner zu speichern, in dem gearbeitet wird (drücken Sie im ROI-Menü Mehr und dann Speichern).
      HINWEIS: Wenn Sie den ausgewählten Bereich durch Drücken von Strg+Umschalt+I umkehren, wird die Verfolgung erleichtert.
   6. Um die Bewegung eines einzelnen Vesikels zu verfolgen, halten Sie die Strg-Taste gedrückt, während Sie mit der linken Maustaste von oben nach unten klicken.
   7. Um dies zu tun, halten Sie die Strg-Taste gedrückt, während Sie mit der rechten Maustaste klicken, und es öffnet sich ein Fenster, in dem angezeigt wird, wo die Axone verfolgt werden. Wenn dies gut aussieht, drücken Sie OK.
   8. Um fortzufahren und ein anderes Vesikel auszuwählen, klicken Sie auf Ja und wiederholen Sie den Vorgang aus den Schritten 3.2.6-3.2.8. Sobald jedes sichtbare Vesikel verfolgt wurde, drücken Sie Nein. Dadurch wird das handverfolgte Overlay automatisch im selben Ordner gespeichert.
3. Messen der Kymographendaten
   1. Erstellen Sie einen neuen Ordner. Ziehen Sie jede generierte Textdatei in den Ordner.
   2. Öffnen Sie die Kymograph-Datei und notieren Sie die Abmessungen.
   3. Ziehen Sie das Makro "Messen" in Bild J.
   4. Geben Sie das zuvor aufgezeichnete Mikron-zu-Pixel-Verhältnis in PixelScale ein.
   5. Ändern Sie die Geschwindigkeitsbegrenzung niedrig auf 0,1. (Vesikel, die sich unterhalb dieser Grenze bewegen, gelten als stationär).
   6. Geben Sie die zuvor aufgezeichneten Kymographenabmessungen ein. Die Zusammenfassungsdatei wird automatisch in dem erstellten Textordner generiert. Jede Zusammenfassung enthält %Die zurückgelegte Zeit, die Gesamtgeschwindigkeit (μm/s), die Gesamtstrecke, das durchschnittlich zurückgelegte Segment, die Anzahl der Stopps und die Anzahl der Rückwärtsfahrten. Der Code zum Generieren, Verfolgen und Messen der Kymographendaten wird als Supplementary Coding File 1 zur Verfügung gestellt.

Bildgebung und kymographische Analysen von lebenden Zellen wurden durchgeführt, um die Motilität von freien Mitochondrien zu messen, die mit Mito-RFP oder ER-gebundenen Mitochondrien von engen (6 nm ± 1 nm) oder lockeren (24 nm ± 3 nm) Kontaktbreiten markiert waren, die durch MAM 1X bzw. MAM 9X stabilisiert wurden, im längsten neuronalen Prozess jedes ReN GA (AD) oder ReN (naiven) Neurons, das mindestens 500 nm lang ist, wobei dies als Axon betrachtet wird (Abbildung 1 und Abbildung 2). Die Häufigkeit der Bewegungen (insgesamt, retrograd und anterograd) wurde berechnet, indem die Anzahl der bewegten oder stationären RFP-markierten Punktzahlen (MAMs) durch die Gesamtzahl in den Kymographen dividiert wurde (Abbildung 1A-E). Die Gesamtaxongeschwindigkeit der MAM 1X-markierten ER-gebundenen Mitochondrien war im Vergleich zu den Mito-RFP-markierten ER-freien Mitochondrien oder MAM 9X-markierten ER-gebundenen Mitochondrien dramatisch verringert (Abbildung 1B). Die quantitative Analyse ergab auch dramatische Unterschiede zwischen den Gesamt- und retrograden Bewegungen der MAM 1X-stabilisierten ER-gebundenen Mitochondrien im Vergleich zu den freien (Mito-RFP) oder MAM 9X-stabilisierten ER-gebundenen Mitochondrien. Während 53,82 % ± 3,3 % der ER-freien Mitochondrien (Mito-RFP) mobil waren, waren nur 26,6 % ± 3,4 % der MAM 1X-markierten ER-gebundenen Mitochondrien mobil, was darauf hindeutet, dass die Stabilisierung der MAMs die axonale Gesamtmobilität der Mitochondrien, die eng mit ER verbunden sind, im Vergleich zu Mitochondrien, die nicht oder locker an das ER gebunden sind, signifikant reduzierte (44,79 % ± 2,6 % der MAM 9X gegenüber 53,82 % ± 3,3 % der Mito RFP, (Abbildung 1C). Konsistent waren sowohl die retrograden als auch die anterograden Bewegungen von MAM 1X-markierten ER-gebundenen Mitochondrien signifikant niedriger als bei MAM 9X-markierten oder freien Mitochondrien (Mito-RFP) (retrograd: 12,33 % ± 2,55 % für MAM 1X gegenüber 25,78 % ± 2,31 % für Mito RFP; anterograd: 14,27 % ± 2,81 % für MAM 1X gegenüber 28,04 % ± 2,48 % für Mito RFP) (Abbildung 1D und E). Tabelle 3 zeigt die genauen Axongeschwindigkeiten der freien Mitochondrien oder derjenigen, die entweder fest oder locker an das ER gebunden sind. Diese Werte können als bemerkenswertes quantitatives Mittel verwendet werden, um den Grad der MAM-Stabilisierung zwischen den straffen und lockeren MAM zu beurteilen, was zu einer Verringerung der Ab-Erzeugung führt. Die mitochondrialen axonalen Transportraten nach Stabilisierung der engen und lockeren MAMs in naiven ReN-Zellen spiegelten die Transportmuster wider, die in ReN-GA-Neuronen beobachtet wurden (Abbildung 1F-G). Die konsistenten Ergebnisse zwischen naiven ReN-Neuronen und_APP-Swe/Lon-exprimierenden ReN GA AD-Neuronen deuten darauf hin, dass der Effekt auf den axonalen Transport hauptsächlich auf den Zustand der MAM-Stabilisierung zurückzuführen ist, unabhängig vom Vorhandensein von APP_Swe/Lon oder der resultierenden Aβ-Produktion.

Abbildung 1: Die Stabilisierung der MAMs durch MAM 1X reduzierte die durchschnittliche Geschwindigkeit und Bewegung (insgesamt, retrograd und anterograd) der ER-gebundenen Mitochondrien in den Axonen von differenzierten ReN GA- und naiven ReN-Zellen. (A) Repräsentative Kymographen der RFP-markierten Puncta, die freie Mitochondrien (Mito-RFP) oder ER-gebundene Mitochondrien repräsentieren, stabilisiert durch MAM 1X (enge MAMs, 6 nm ± 1 nm Kontaktbreite) oder MAM 9X (lose MAMs, 24 nm ± 3 nm Kontaktbreite) innerhalb von Axonen (~100 nm). (B-E) Quantitative Analyse der (B) durchschnittlichen Geschwindigkeit und Bewegung [(C) insgesamt, (D) retrograd und (E) anterograde] von Mito-RFP, MAM 1X oder MAM 9X in Axonen von 10-Tage differenzierten Ren-GA-Zellen. Nr. >7; Es wurde eine Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt. *p < 0,05, **p < 0,001. Stellvertretend für drei unabhängige Experimente. (F) Repräsentative Kymographen der Bewegung von MAM 1X oder MAM 9X in Axonen von 10-Tage differenzierten naiven ReN-Zellen. (G) Quantitative Analyse der prozentualen (%) Bewegung (stationär, retrograd und anterograd) und der Gesamtgeschwindigkeit (Mikrometer/Sekunde; μm/s) von MAM 1X- oder MAM 9X-stabilisierten MAMs in den Axonen naiver ReN-Zellen. n = 9; Es wurde eine Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt. p < 0,0001. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Zellmer et ^al.17 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Lebendzellbilder von Axonen naiver ReN-Zellen, die MAM 1X oder MAM 9X exprimieren. Repräsentative Videobilder von lebenden Zellen, die die Bewegungen der durch MAM 1X oder MAM 9X stabilisierten MAMs in 100 μm langen Axonen von 10-Tage-differenzierten GFP-exprimierenden ReN-Zellen zeigen. n > 10 Bilder aus Duplikatexperimenten. Die Pfeile zeigen den anterograden Transport an. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Zusammensetzung der Expansionsmedien.

Tabelle 2: Zusammensetzung der Differenzierungsmedien.

Tabelle 3: Quantitative Analyse. Lebendzellbildgebung und kymographische quantitative Analyse der durchschnittlichen Geschwindigkeit (Geschwindigkeit) und axonalen Bewegungen (insgesamt, retrograd und anterograd) von Mito-RFP, MAM 9X und MAM 1X. Die bidirektionale ANOVA wurde für die axonale Geschwindigkeit oder Bewegung (%) durchgeführt. n = 9. Für Aβ wurde eine gewöhnliche einfache ANOVA durchgeführt; n = 3, drei unabhängige Experimente. Die Signifikanz wird gegen die nicht transfizierten (Kontroll-)ReN GA-Zellen gemessen. **p < 0,0001; *p < 0,05; Nicht signifikant (NS). Diese Tabelle wurde mit Genehmigung von Zellmer et ^al.17 angepasst.

Ergänzende Codierungsdatei 1: Der Code zum Generieren, Verfolgen und Messen der Kymographendaten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Hemmung des Sigma-1-Rezeptors (S1R) regulierte die MAM-Stabilisierung in den neuronalen Prozessen herunter und reduzierte dramatisch (~90%) die Aβ-Bildung aus Axonen, aber nicht aus Soma eines dreidimensionalen (3D) Kultursystems von humanen neuralen Vorläuferzellen (ReN), die familiäre AD [FAD]-Mutationen im Amyloid-Vorläuferprotein [APP]-Gen (ReN GA) exprimieren23,24,25,27. RFP-markierte konstitutive MAM-Stabilisatoren (MAM 1X und MAM 9X), die für die Stabilisierung von festen (6 nm ± 1 nm) und losen (24 nm ± 3 nm) MAMs^15,26 entwickelt wurden, sind bemerkenswerte Werkzeuge zur quantitativen Messung der MAM-Stabilisierung. Beide Stabilisatoren zeigen nicht nur eine gleiche und stabile Expression in ReN GA-Zellen, die ~10 Tage lang in der 3D-Matrix differenziert sind, sondern detektieren auch MAMs in diskreten Punkten, in Soma und Axonen. Am wichtigsten ist, dass die stabile Expression von MAM 1X in FACS-angereichertem 3D ReN GA die Aβ-Generierung signifikant erhöhte, während die MAM 9X-Expression keinen Effekt hatte¹⁷. Wir haben auch die Wirkung eines konstitutiven MAM-Stabilisators getestet, der 18-Aminosäure-Linker (MAM 18X) enthält und MAMs >25 nm erkennt und stabilisiert. Im Gegensatz zu MAM 1X oder MAM 9X wurden bei MAM 18X ausschließlich somale MAM markiert. FACS-angereicherte MAM-18X-exprimierende ReN GA-Neuronen, reduzierte die Aβ-Generation¹⁷. Diese Befunde deuteten auf die Möglichkeit einer MAM-Stabilitätsschwelle hin, die durch ihre Lückenbreite bestimmt wird und zwischen pathogenen (zunehmende Aβ-Bildung), engen MAMs und nicht-pathogenen (Aufrechterhaltung oder Verringerung der Aβ-Bildung) losen MAMs reicht.Die Suche nach einem effektiven MAM-Modulator und seiner optimalen Konzentration, der die optimale MAM-Stabilisierung erreichen kann, die erforderlich ist, um die Schwelle von pathogenen und nicht-pathogenen MAMs zu überschreiten, wird einen bemerkenswerten therapeutischen Weg zur Senkung des axonalen oder neuronalen Aβ aufzeigen Erzeugung im Gehirn.

Zur Entwicklung von MAM-Modulatoren wurden drei verschiedene Ansätze verfolgt: (1) Modulatoren, die auf MAM-Tethering-Proteine abzielen, (2) Modulatoren, die die Expressionsniveaus von MAM-residenten Proteinen verändern, und (3) Modulatoren von MAM-Strukturen¹⁸. Trotz dieser Ansätze ist das größte Hindernis bei der Suche nach effektiven Modulatoren der MAM-Stabilisierung der Mangel an Methoden zur quantitativen Messung des Grades der MAM-Stabilisierung. Traditionelle Techniken wie die Elektronenmikroskopie (EM) oder die hochauflösende Mikroskopie haben Einschränkungen bei der Erfassung von Echtzeitänderungen oder bei der Bereitstellung ausreichender Details, um die Stabilisierung der MAM zu beurteilen (überprüft in²⁸).

Die hier beschriebene Methode wird das Hindernis überwinden und wichtige Einblicke in die Beziehung zwischen MAM-Stabilisierung und Aβ-Produktion liefern. Die Ergebnisse zeigen, dass MAMs mit einer Dicke von 6 nm ± 1 nm, die eine Gesamtbewegung von 26,6 % ± 3,4 % aufweisen (Tabelle 3), mit der Aβ-Bildung assoziiert sind. Im Gegensatz dazu haben MAMs mit einer Dicke von 24 nm ± 3 nm, die eine Gesamtbewegung von 44,79 % ± 2,6 % aufweisen (Tabelle 3), keinen Einfluss auf die Aβ-Bildung. Die Gesamtbewegung der Mitochondrien (Mito-RFP) betrug 53,82 % ± 3,3 %. Angesichts der Tatsache, dass die MAM-Dicke typischerweise zwischen 6 nm und 80 nm variiert, beschreiben diese Ergebnisse die obere und untere Grenze der MAM-Stabilisierung in Bezug auf die Aβ-Produktion. Folglich kann diese Methode die Identifizierung und Optimierung eines oder mehrerer Modulatoren für die MAM-Stabilisierung unterstützen. Ziel wäre es, die Gesamtbewegung der MAMs von 26,6 % ± 3,4 % auf 53,82 % ± 3,3 % oder ihre durchschnittliche Geschwindigkeit von 0,4 μm/s auf 0,7 μm/s zu verändern (Tabelle 3), wodurch der/die Modulator(en) als potenzielle Therapeutika gegen die Aβ-Produktion positioniert werden.

Die Verwendung von konstitutiven MAM-Modulatoren, die synthetische Linker zunehmender Länge (0-18 Aminosäuren) enthalten, ist eine leistungsfähige Methode zur quantitativen Bestimmung der MAM-Stabilisierungsschwelle, um die MAM-Stabilisierung auf eine umzuschalten, die die Aβ-Erzeugung beibehält oder möglicherweise senkt, anstatt sie zu erhöhen. Um die Effizienz oder Wirksamkeit von MAM-Modulatoren zu beurteilen, sind jedoch induzierbare MAM-Stabilisatoren erforderlich. Es stehen induzierbare FAM-Stabilisatoren auf Basis der FRET/FLIM-basierten FAM-Stabilisatoren (FRET/FLIM) zur Verfügung, bei denen es sich um Expressionsplasmide handelt, die für die YFP-fusionierte OMM-Targeting-Sequenz von mAKAP1 (34-63) und die CFP-fusionierte ER-gerichtete Sac1-Phosphatase (521-587) kodieren. Darüber hinaus stellen die konstitutiven Stabilisatoren möglicherweise nicht die physiologischen MAMs dar, während die FRET/FLIM MAM-Stabilisatoren andererseits die physiologischen MAMs detektieren. Die geteilten GFP-Sonden, bei denen GFP in zwei nicht fluoreszierende Fragmente gespalten wird, die entweder an residente ER- oder mitochondriale Proteine ER-GFP (1-10) und Mito-GFP11 gebunden sind und bei der Bildung von MAMs²⁷ eine biomolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) erzeugen, können ebenfalls verwendet werden. Obwohl die GFP-Fragmente anfällig für spontane Assemblierung sind, hat BiFC die einfachste Auslesung, das klarste Signal und die am wenigsten mit Rauschen verbundene Analyse. Darüber hinaus ist die Wechselwirkung zwischen den gesplitteten GFPs hochgradig reversibel²⁸, so dass ihre Vorteile die Nachteile überwiegen und die BiFC-Methode zur Identifizierung von Modulatoren der MAM-Stabilisierung geeignet machen.

Wir danken Dr. György Hajnóczky, Professor an der Thomas Jefferson University, Philadelphia, für die großzügige Bereitstellung von Expressionsplasmiden, die für RFP-Mito, MAM 1X, MAM 9X und MAM 18X kodieren. Ein besonderer Dank geht an Dr. Lai Ding, Senior Imaging Scientist, Brigham and Women's Hospital, für die Unterstützung beim Schreiben des Codes zum Generieren, Verfolgen und Messen der Kymographendaten. Diese Studie wurde durch den Cure Alzheimer's Fund to RB und den NIH-Zuschuss 5R01NS045860-20 für RET unterstützt.