一种通过非遗传光刺激研究 Ca²⁺ 传播的心脏微生理系统

该研究旨在通过整合基于材料的光刺激方法来推进体外心脏微生理模型。它侧重于克服寿命和刺激侵入性的限制，为研究心脏生理学、改进药物筛选过程和促进疾病建模应用提供可靠的工具。生物刺激利用的最新进展，例如精确的非侵入性细胞控制。

光遗传学使基因改造能够调节细胞活动，而新兴的基于材料的光传感器则提供非遗传替代方案。这项创新为研究和调节各种应用中的神经元、心肌细胞和骨骼肌细胞提供了重大突破。目前的实验挑战包括实现向深层组织的一致光传输、优化光换能器的生物相容性和稳定性，以及提高基于光的刺激技术的精度。

此外，将这些方法与复杂的生物系统相结合，同时保持细胞活力和功能仍然是一个关键障碍。该协议解决了心脏微生理模型中对无创精确刺激技术需求的研究空白。通过使用基于材料的光换能器，如 Ziapin2，这种方法克服了传统电刺激和光遗传学的局限性，在保持组织活力和功能的同时提供增强的颞部和空间轮廓。

我的发现将通过引入一种非侵入性、基于材料的光刺激技术来推进研究，该技术可提供更高的精度和对心脏组织中细胞活动的控制。这种方法消除了对基因改造的需求，为模拟心脏功能、研究疾病机制和开发更有效的治疗策略提供了一种多功能工具。首先，将两层实验室胶带（一层白色和一层蓝色）粘在 1 毫米厚的透明、防刮擦和抗紫外线亚克力板上。

根据预期的设计在胶带上剪下芯片图案，然后使用二氧化碳激光雕刻机将亚克力板切成圆圈。用镊子撕掉最内层线内的两层胶带。将薯片浸泡在纯漂白剂中 30 分钟至 1 小时，以去除切割时的粗线和黑点，留下尖锐的线条，然后在烧杯中用流动的去离子水冲洗薯片过夜或至少三个小时。

在具有线槽特征的聚二甲基硅氧烷或 PDMS 印章中，在干净的 70% 乙醇中对芯片进行 30 分钟的超声处理 30 分钟。将木片和邮票转移到引擎盖下的干净区域，让它们在气流下干燥大约一到两个小时。接下来，对新鲜制备的明胶进行超声处理 15 分钟，然后将其放回 65 摄氏度的水浴中，直到准备好使用。

将微生物转谷氨酰胺酶或 MTG 管放入干燥器中，盖子略微松动，然后慢慢打开真空以去除气泡。脱气后，将 MTG 管放回 37 摄氏度的水浴中。然后，用干净的 Parafilm 覆盖网格板，并将芯片放在网格上。

将 PDMS 标记放在附近以供使用。将 5 毫升 MTG 加入 5 毫升明胶溶液中，小心移液以避免气泡。现在，将大约 0.5 毫升的明胶混合物快速分装到每个芯片上，确保混合物覆盖芯片区域。

将线型 PDMS 印章放在顶部并施加 200 克的重物，以确保明胶的图案平行于组织的纵轴。所有芯片成型后，用玻璃罐盖住它们，以避免环境干扰，并让它们在夜间交联。将夹在芯片和 PDMS 印记的芯片转移到装满 PBS 的新 P150 培养皿中，使明胶水合 30 分钟至 1 小时，以促进 PDMS 印记与芯片分离。

去除芯片周围任何多余的脱模明胶后，将干净的芯片转移到装满 PBS 的新 P150 培养皿中。将 PDMS 邮票储存在 70% 乙醇中。要对薯片进行消毒，请在引擎盖下将它们浸泡在乙醇中 10 分钟。

将薯片转移到 PBS 中，浸泡 10 分钟，然后进行 3 次 PBS 洗涤。对于包被溶液，在培养基中将 20 μg/mL 纤连蛋白与 1 至 100 稀释的 Geltrex 混合，无需添加添加剂。用这种溶液在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中包被芯片 2 小时。

在含有 10 微摩尔 Y-27632 的 RPMI 培养基中解冻和接种人诱导的多能干细胞衍生的心肌细胞。24 小时后，用不含 Y-27632 的 RPMI 替换培养基。细胞接种后三天，用镊子小心地从芯片上去除白色胶带。

准备光学测绘装置，该装置由配备高速相机的改良串联透镜显微镜和 200 毫瓦汞灯作为激发光源组成。将二向色镜放在指定的钙成像相机前面。对于光学起搏，使用 LED 光源在组织的一端施加光学点刺激，以刺激光换能器Ziapin2。

通过距离组织 1 毫米的时间调节光纤，以 0.5 或 1 赫兹的频率对组织起搏。将样品与添加到培养基中的两个微摩尔 X-Rhod-1 一起在 37 °C 下孵育 30 分钟。用新鲜培养基洗涤芯片后，将其转移到不含酚红的 RPMI 1640 培养基中，并补充有 B-27 减去胰岛素和 HEPES。

将组织芯片放入设置为生理温度的温控培养皿中，并以每秒 2.5 帧的帧速率开始记录。钙波传播被成功地可视化，在 0.5 或 1 赫兹频率的光刺激过程中具有清晰的空间和时间分辨率，传导速度计算为每秒约 4.5 厘米，与生理值一致。光刺激和电刺激之间的钙瞬态参数，包括振幅、上升时间、最大衰减、斜率和衰减时间，在定量上相似，证实了可比的功能反应。