因此，我们研究先天免疫系统中的复合碳水化合物或聚糖以及免疫相关疾病，目前主要关注败血症和癌症。我们的工作涉及分析方法和系统糖生物学，包括糖组学和糖蛋白质组学方法，用于详细表征人类糖蛋白。糖蛋白质组学在过去几十年中取得了巨大的进步，进步不再受到缺乏高质量质谱数据的限制。
相反，挑战在于从光谱数据中解释和生成生物学知识。糖组学指导的糖蛋白质组学方法使糖科学家能够深入准确地了解糖蛋白质组和人类健康指数的硬屏障，糖蛋白质组学具有独特的能力，能够产生对糖蛋白质组的位点特异性见解。但糖肽含量仍然很高。
为了解决这些重现性问题，我们的糖组学糖蛋白质组学方法通过对同一样品的糖组学研究定义聚糖搜索空间中的约束条件，从而实现精确的糖蛋白质组分析。最终，它能够更快、更准确地搜索糖肽。我们的糖组学指导糖蛋白质组学方法可以全面映射各种不同人类标本的糖蛋白质组指数的异质性和动态。
因此，这种方法可以帮助我们更好地了解疾病进展，也可以帮助我们找到针对多种人类疾病的治疗靶点的新诊断生物标志物。糖组学指导的糖蛋白质组学方法使我们能够破译人类糖蛋白质组的复杂性，这反过来又提出了新的生物学问题，例如聚糖结构如何影响蛋白质功能、细胞通讯或免疫反应。它还提出了关于糖基化模式在某些疾病中如何以及为何发生变化的问题。
这些见解可能会带来复杂疾病的发现和新的诊断标志物和个性化疗法。为了将目标蛋白质固定在 PVDF 膜上，使用单孔穿刺，根据要点样的样品数量切割膜。用甲醇润湿切除的膜，然后将它们转移到平底 96 孔板中。
一旦膜接近干燥，每个点应用 2.5 μL 蛋白质样品。将膜在 20 至 25 摄氏度下风干至少三个小时，最好过夜，注意避免污染。向含有点状膜的每个孔中加入 100 微升 1% PDP-40 的甲醇溶液。
在 20 至 25 摄氏度的 PDP-40 溶液中摇动板。5 分钟后，丢弃 PDP-40 溶液。接下来，用 100 μL 超纯水清洗每个含有堵塞蛋白质斑点的孔，并摇动板 5 分钟。
向每个孔中加入 15 微升 PNGase F 溶液。为防止脱水，请在周围的空井中加水。用透明薄膜小心密封板，并在 37 摄氏度下孵育至少 8 小时。
孵育后，对板进行超声处理 5 分钟，以帮助孔侧面蒸发的液滴聚集在底部。将释放的 N-糖样品转移至单独的 1.5 mL 微量离心管中。用 20 μL 超纯水将每个样品充分清洗两次，吸出所有剩余样品并将其混合到新试管中。
接下来，加入 10 微升 100 毫摩尔乙酸铵 pH 5，并将样品在 20 至 25 摄氏度下孵育 1 小时。在真空浓缩系统中干燥 N-糖样品。要制备自制多孔石墨碳或 PGC-C18 固相萃取或 SPE 微量色谱柱，请使用注射器将 C18 圆盘塞住并转移到 10 微升移液器吸头中。
将悬浮在 50% 甲醇中的 10 微升 PGC 树脂浆液移液到 C18 SPE 微量柱中。将微量色谱柱放入带有微量离心机适配器的 2 mL 试管中。旋转试管，制备柱高约为 0.5 cm 的 PGC-C18 SPE 微柱。
接下来，将 50 μL 0.1% 三氟乙酸或 TFA 的乙腈溶液加入微量色谱柱中，并以 2000 G 离心 60 秒，以促进流动相通过微量色谱柱。同样，使用 0.1% TFA 水溶液洗涤和调节微量色谱柱 3 次。将 N-糖样品以高达 40 μL 的上样量添加到每根微量柱中。
在每次版本后旋转微柱，重复直到加载整个样品。用 20 μL 超纯水清洗每个微柱。将微量柱转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。
要洗脱 N-糖，向每根微量色谱柱中加入 40 μL 0.1% TFA 的 50% 乙腈溶液。离心试管并混合每次离心的洗脱液。在真空浓缩器系统中干燥脱盐的 N-糖。
使用适当的软件浏览生成的 LC-MS/MS 原始数据。通过评估窄液相色谱峰宽、N-糖异构体的有效分离、高 MS 准确度、分离度和信噪比以及高 CID MS/MS 碎裂效率，确认高数据质量。根据单同位素母离子质量、CID MS/MS 碎裂模式以及相对和绝对 PGC-LC 保留时间手动鉴定样品中的 N-糖。
对于相对 N-糖定量，生成一个包含所有已鉴定 N-糖异构体的单同位素母离子质荷比的转换列表。从所有 N-糖母离子的提取离子色谱图中确定曲线下面积值。要制备 ZIC-HILIC-C8-SPE 微量色谱柱，请使用注射器将 C8 圆盘塞住并转移到 10 μL 移液器吸头中。
将悬浮在甲醇中的 ZIC-HILIC 树脂浆液沉积到 C8-SPE 微量柱中。将微量色谱柱放入带有微量离心适配器的 2 mL 试管中，确保色谱柱悬浮在中心。离心生成高度约为 1 cm 的 C8-SPE HPLC 微量色谱柱。
向微量色谱柱中加入 50 μL 甲醇，以 2000 G 离心 60 秒，使流动相通过色谱柱。同样，将微柱洗涤 3 次，每次用 50 μL 超纯水清洗，然后用 50 μL 1% TFA 和 80% 乙腈清洗。将指定用于 N-糖肽富集的干燥肽混合物重悬于 50 微升 1% TFA 的 80% 乙腈溶液中，并充分混合。
将条件 ZIC-HILIC-C8-SPE 微量色谱柱放入带有微量离心适配器的新 1.5 mL 试管中。将重悬的肽混合物涂到每个微柱上，并以 2000 G 离心 60 秒。收集流过馏分，并将每个馏分重新上样到同一根 ZIC-HILIC-C8-SPE 微量色谱柱上。
然后依次加入 50 μL 25 毫摩尔碳酸氢铵和 50 μL 50% 乙腈洗脱 N-糖肽。将微量柱转移到新的 1.5 mL 低吸附微量离心管中。要依次洗脱保留的 N-糖肽，请在微量柱中加入 50 μL 0.1% TFA 水溶液，并以 2000 G 离心 60 秒。
然后依次加入 50 μL 0.1% TFA 水溶液，然后加入 50 μL 25 毫摩尔碳酸氢铵和 50 μL 50% 乙腈洗脱 N-糖肽。在真空浓缩系统中收集、合并和干燥富集的 N-糖肽和未修饰的肽流经馏分。N-糖组学数据分析在结直肠癌组织中鉴定出 76 种 N-糖异构体，其中 70% 复合物/杂交聚糖、20% 寡甘露糖和 10% 寡甘露糖。
所有 N-糖结构均通过谱图证据确认，并使用提取离子色谱图的曲线下面积值进行定量。
