在小胶质细胞作的转基因小鼠中鉴定 EcoHIV 感染的细胞

该方案描述了 EcoHIV 感染与 Tmem119-EGFP 小鼠的组合如何为研究 HIV 相关神经认知障碍的啮齿动物模型中的小胶质细胞改变和病毒库提供有价值的生物系统。联合抗逆转录病毒疗法极大地改善了 HIV 感染者的生活质量。要了解 HIV 如何影响中枢神经系统，需要一个可靠且可行的 HIV 模型。

以前，在大鼠模型中开发了一种使用嵌合 HIV 的新型生物系统 EcoHIV 来研究神经认知障碍和突触功能障碍。阐明 EcoHIV 的神经解剖学分布仍然存在重大挑战，特别是它在大脑中各种细胞类型的差异表达。在目前的研究中，具有 mScarlet 荧光标记的 EcoHIV 被修饰并眶后注射到 Tmem119-EGFP 敲入小鼠中，以确定小胶质细胞是否是负责病毒表达的主要细胞类型和大脑中 HIV 的储存库。

首先，将解离的胎鼠脑细胞转移到带有玻璃插件的聚-L-赖氨酸预涂层的 12 孔板中，其中含有 1 毫升 DMEM-F12 和 10% FBS。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育过夜。第二天，用补充有 B27 的 Neurobasal 培养基替换培养基，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下继续培养细胞三周。

然后将 60 微升 EcoHIV-mScarlet 加入脑细胞培养物中并孵育 6 天。孵育后，用 4% 多聚甲醛固定细胞。使用特异性一抗对感染的脑细胞进行免疫染色，并在 40 倍物镜下的共聚焦显微镜上对其进行成像。

小胶质细胞被确定为大鼠脑细胞培养物中的主要感染细胞类型，mScarlet 与 CD11b/c 和 Iba1 标志物的共定位证明了这一点。首先，打开被斩首的成年小鼠的头皮，将脑组织转移到另一个含有 5 毫升无菌 HBSS 的培养皿中。剥去脑膜，将额叶皮层转移到两毫升 HBSS 中。

接下来，向混合物中加入 20 微升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。在室温下孵育 15 分钟，每隔几分钟旋转一次试管。将解离的细胞转移到含有 10 mL DMEM-F12 培养基和 10% FBS 的 poly-L-赖氨酸预涂层的 75 平方厘米烧瓶中。

在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中培养细胞，直到它们达到 90% 汇合。接下来，用两毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化脑细胞。将消化的脑细胞传代培养到含有 5 毫升 DMEM-F12 生长培养基的 35 毫米玻璃底培养皿中，直至它们达到 80% 汇合。

然后将 8 微升 EcoHIV-mScarlet 加入小鼠神经胶质细胞中并孵育两天。成年小鼠原代神经胶质细胞在治疗 2 天后成功感染 EcoHIV-mScarlet。首先，将麻醉的 Tmem119-EGFP 鼠标固定在横向位置。

在冰上解冻 EcoHIV-mScarlet。将病毒溶液填充到带有 33 号钝针的眼内注射器中。将鼠标放在右侧卧位上，头部朝左。

确定眼部区域周围的注射区域。缓慢而轻柔地将针头插入眼睛的内眦。然后将针头推进眼球后面的血管。

将 6.5 微升 EcoHIV-mScarlet 注射到眶后窦中。注射后，小心地取下针头。将麻醉的鼠标仰卧在化学通风橱内。

沿胸中线打开皮肤。然后分开隔膜，用剪刀打开胸部。现在将一根 22 号的一根半针插入左心室。

用剪刀打开右心房。用 50 毫升预冷的 100 毫摩尔 PBS 灌注右心房，然后灌注 100 毫升预冷的 4% 多聚甲醛。移除整个鼠标大脑。

将大脑固定在 4% 多聚甲醛中后，使用组织粘合剂将脑组织固定在振动切片机的金属平台上。用碳钢刀片切割 50 微米厚的冠状切片。接下来，使用刷子将脑切片放在载玻片上。

立即向每个切片添加 0.1 毫升抗褪色封片剂。将 22 x 50 毫米的盖玻片放在脑切片上，并在黑暗中将 Superfrost 载玻片干燥一天。第二天，使用 488 纳米和 594 纳米波长的共聚焦显微镜获取感兴趣大脑区域的多通道图像。

EcoHIV-mScarlet 信号主要在 Tmem119-EGFP 小鼠脑中用 EGFP 标记的小胶质细胞中观察到。在用 EcoHIV-mScarlet 处理的培养大鼠脑细胞中未检测到明显的神经元感染。