大鼠背根神经节外植体和雪旺细胞共培养中外周轴突的体外髓鞘形成

该模型为体外研究周围神经系统髓鞘形成的各个方面提供了实验机会。它能够进行髓磷脂定量和轴突-雪旺细胞相互作用的检查。共培养从第14天开始形成强大的髓鞘形成。

与解离的神经元培养物相比，DRG外植体培养物具有完整的结构结构优势。该方法可用于筛选周围神经系统炎症和神经退行性疾病的热带化合物。首先，用70%乙醇对安乐死大鼠躯干的工作区域进行消毒。

用剪刀打开大鼠的左下肢，小心地去除二头肌的股骨肌肉。用弯曲的镊子平滑抬高坐骨神经，确保不会瘀伤神经。使用镊子，将夹紧的神经转移到带有冰冷的Leibovitz的L-15培养基的组织培养皿中，每毫升庆大霉素为50微克。

然后，使用体视显微镜，用两对细镊子从神经中取出脂肪、肌肉和血管。识别坐骨神经的近端和远端，用一对细钳在近端到远端方向切除外神经，同时用第二对细钳固定近端神经末梢。将纯化的神经转移到另一个组织培养皿中后，用冰冷的Leibovitz的L-15培养基和庆大霉素，挑逗分离的神经束，以使用两对细镊子分离和分离单个神经纤维。

使用10毫升血清移液管将神经纤维转移到50毫升管中，并尽可能少地吸收培养基。然后将50毫升含有庆大霉素的莱博维茨L 15培养基加入神经纤维中几次。将含有神经纤维的管在 188 G 下在 4 摄氏度下离心五分钟。

除去上清液后，将沉淀与剩余的Leibovitz's L-15培养基转移到60毫米组织培养皿中。用10毫升酶消化溶液冲洗50毫升管，并将其添加到神经纤维培养皿中。用移液管的尖端小心地分布培养皿中的神经纤维。

在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 18 小时。并通过在HBSS中加入10毫升40%FCS来停止酶消化。将消化的神经转移到50毫升的管中，在4摄氏度下以188G离心10分钟。

弃去上清液后，将沉淀重新悬浮在含有10%FCS和每毫升庆大霉素50微克的10毫升DMEM中。接下来，通过100微米的细胞过滤器过滤细胞悬液。在4摄氏度下以188 G离心10分钟后，用4毫升含有FCS和庆大霉素的DMEM重新悬浮沉淀。

将两毫升细胞悬液添加到两个聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的60毫米组织培养皿中。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育，将板在培养箱中保持两天不变。在4摄氏度下以188G离心雪旺细胞悬液10分钟，然后将细胞沉淀重新悬浮在90微升磁性细胞分离缓冲液中，每1次10至第七个细胞。

然后向第七个细胞中加入10微升ti1微珠，每1乘以10。将重悬溶液在黑暗中以8摄氏度孵育15分钟。接下来，在磁性细胞分离缓冲液中加入两毫升到细胞悬液中。

在4摄氏度下以300G离心10分钟后，将沉淀重新悬浮在500微升磁性细胞分离缓冲液中。将磁性细胞分离柱放入细胞分离器中，并用一毫升磁性细胞分离缓冲液润湿色谱柱。然后将细胞施加到其上以收集流过以进行离心。

小心地从安乐死的怀孕大鼠身上取出子宫，并将其放入带有冰冷HBSS的100毫米组织培养皿中。用弯曲的镊子握住子宫，用细镊子打开子宫壁。取出一个羊膜袋，用细镊子捏一个孔小心地打开。

快速从子宫中取出所有胚胎，并将它们转移到装满HBSS的培养皿中。轻轻地，将一个胚胎躯干放入装满HBSS的35毫米培养皿中。在体视显微镜下，打开躯干的背侧部分，将胚胎分成两半。

将一半转向一侧，识别位于胚胎背侧部分线中的背根神经节或DRG链。用细镊子和微型剪刀将DRG整根线剪掉。将DRG放入装有两毫升HBSS的新鲜培养皿中后，使用细镊子和微型剪刀将单个DRG与剩余的组织分开。

在每个孔中取一个含有190微升DRG生长培养基的4孔板，并使用细镊子和刮刀小心地将单个DRG转移到每个孔的中心。然后将DRG外植体培养物置于37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中。第二天，小心地向每个孔中加入50微升DRG生长培养基，并每天使用显微镜观察DRG外植体粘附和轴突生长。

为了在DRG外植体培养的第三天共培养，小心地用250微升共培养基替换DRG生长培养基，每孔含有30， 000个雪旺细胞。为了进行免疫细胞化学染色，通过将DPBS洗涤的细胞在4%多聚甲醛中孵育10分钟来将细胞固定在盖玻片上。使用倒置显微镜在中心DRG外植体周围的八个特定区域拍摄免疫细胞化学染色样品的照片。

这里描述了具有细长和纺锤形形态的雪旺细胞的外观以及共培养中的细DRG轴突。通过对DRG外植体和雪旺细胞的髓鞘碱性蛋白或MBP、β三微管蛋白和DAPI染色，在不同日期评估共培养中的髓鞘形成。共培养中的轴突网络是密集的，并且在观察的时间过程中没有明显变化。

髓鞘形成的最初迹象在共培养的第10天和第12天可见。从第14天开始，MVP信号更加明显，并且检测到髓鞘包裹的轴突。髓鞘形成随着共培养时间的增加而增加，直到第20天。

髓鞘形成被量化为MVP和β三个微管蛋白阳性区域的比率。与第10天相比，在第18天和第20天观察到髓鞘形成显着增加。DRG外植体培养物很脆弱，需要小心处理。

例如，当从培养箱中取出或在更换培养基和固定期间。可以形成共培养样品的基因表达分析，以更详细地研究髓磷脂。在这里，我们在第22天检测到髓鞘标志物PMP22，MAG，Oct6，Egr2，Olig1。