来自切除人肿瘤标本的 离体 器官型腹膜假粘液瘤肿瘤切片的培养和成像

这项研究展示了一种在临床前环境中研究阑尾癌治疗和病理生物学的新方法。这些方法可能更广泛地适用于其他恶性肿瘤的研究。阑尾癌很难研究，因为在小鼠中没有用于疾病建模的阑尾的情况下，阑尾癌的发病率很低。

该技术允许研究肿瘤微环境中的细胞相互作用。该方法可用于研究具有转移到网膜倾向的多种癌症的生物学，例如结直肠癌和卵巢癌。首先准备运输和培养基。

组织到达后，将腹膜假粘液瘤肿瘤组织转移到35个完整的DMEM中，其中包含6厘米直径的培养皿。除了去除任何液化粘蛋白或高度粘液的组织区域外，还可以去除任何难以用手术刀切割的组织。将肿瘤组织结节大致切成一立方厘米的小块。

对于琼脂糖制备和组织包埋，如果组织到达，则在同一天在PBS中制备5%的低熔点琼脂糖溶液，不含胎牛血清或FBS。将液体5%琼脂糖溶液加入包含两到三个较小肿瘤标本的六厘米培养皿中，直到覆盖标本。将嵌入的组织放入四摄氏度的冰箱中 30 分钟。

拆卸振动切片机上的组织标本，从冰箱中取出凝固的螺旋钻，然后用手术刀切割略大于组织宽度的琼脂糖立方体。将强力胶涂在振动切片机载物台上，然后将琼脂糖立方体轻轻放在强力胶上一到两分钟进行固定。将刀片固定在振动切片机上，并将组织切片的厚度设置为大约 150 至 250 微米，以获得最佳下游成像。

为了培养组织切片，通过在渗透膜上方添加两毫升完整的DMEM培养基和在渗透膜下方添加三毫升来制备可渗透的插入板。接下来，使用细画笔轻轻地将组织切片从振动切片机的切割室中取出，并将两到四个切片放入含有完整DMEM的渗透性培养皿中。将切片在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳中培养长达 7 天。

在培养基更换期间，每 24 小时加入硼替佐米作为细胞杀伤对照，并将可测试的化疗 5-氟尿嘧啶或 5-FU 添加到培养基中以进行药物干预。将肿瘤切片用于共聚焦成像分析，置于含有 1%FBS 的 PBS 的 12 孔培养皿的单孔中。对于钙成像实验，代替PBS，将切片在额外的细胞钙溶液中孵育。

用成像染料对样品进行染色，以确定组织切片的活力。加入活性染料后孵育10分钟至1小时。孵育后，将切片转移到含有具有1%FBS的PBS的光学透明玻璃底培养皿中，用于共聚焦成像设备上的成像。

从一毫升移液器吸头的末端切下一小块以扩大开口，通过移液进行剧烈的机械解离。在 37 摄氏度下在 1 毫升消化缓冲液中旋转孵育切片 5 至 15 分钟，在使用机械解离孵育期间剧烈破坏组织 2 至 3 次。一旦组织被消化，用消化培养基将破碎的组织转移到放置在50毫升锥形管顶部的70微米过滤器上。

使用无菌镊子或移液管挑选较大的碎片。使用塑料五毫升注射器的钝后端，捣碎任何较大的未解离切片，并用含有2%FBS的四毫升PBS清洗。取解离的细胞上清液，以300G离心5至10分钟。

除去上清液，用一毫升含有2%FBS的PBS洗涤沉淀。为了制备用于流式细胞术的样品，加入含有50微升人FC封闭的封闭缓冲液，并在室温下孵育15分钟。使用含有2%FBS的50微升PBS中的相应抗体进行额外的细胞染色。

等分五毫升用于控制和处理条件的完整培养基。在铺在渗透性培养皿上的两到四片上，加入来自对照处理等分试样的培养基和用于下游活性、活死分析的其他联合疗法。将组织切片留在含有完整DMEM的培养物中两到五天，每隔一天更换培养基以及硼替佐米和5-FU。

对于发光活性分析，将500微升PBS加入12孔培养皿中，并使用画笔或1毫升移液器将顺序匹配的组织切片转移到PBS溶液中。从切片中取出 PBS。根据条件加入500微升发光活性溶液，并在室温下在摇床上缓慢旋转孵育30分钟，然后使用发光板读数器读取发光。

使用周期性酸移染色和粘蛋白特异性抗体可视化组织切片中的粘蛋白染色。在钙黄绿素AM和碘化丙啶中孵育决定了健康和活力。细胞核与培养过程中增殖的细胞重叠。

对这些结果进行定量以确定肿瘤切片内增殖细胞的数量。在CD11b PE偶联抗体和Fluo-4AM中孵育的切片，标记CTU中的局部免疫细胞。显示细胞内钙水平的假彩色缩放图像允许可视化细胞内钙的不同水平。

此处显示了突出显示的CD11b阳性免疫细胞内细胞间钙反应之前，期间和之后的自发活动跟踪和时间流逝。定量了CD11b免疫细胞以及其他反应和无反应细胞中钙反应的原始痕迹。此处显示了腹膜假黏液瘤患者肿瘤样本免疫分型的代表性结果。

肿瘤免疫谱的定量表明，供体标本337具有高水平的M2巨噬细胞，表明利用假粘液瘤腹膜衍生的组织切片可以询问患者肿瘤样本的独特供体细胞景观。来自腹膜假粘液瘤人体组织的药物分型和下游分析显示，细胞毒性分析和隧道共聚焦成像证实了肿瘤切片中细胞的杀伤。响应细胞毒性药物硼替佐米和5-氟尿嘧啶。

使用顺序匹配的切片进行发光活性分析。成功生产粘液肿瘤切片需要细致的解剖和去除细胞和无细胞组织成分，如脂肪和致密的腹壁组织。该技术可以模拟癌细胞与肿瘤微环境中多种细胞类型之间的相互作用，例如脂肪，血管和免疫细胞相互作用。