一种用于研究番茄种子发育的有效清除方案（Solanum lycopersicum L.）

这种方法可以帮助研究快速轻松地找到番茄胚胎发育的异常时期。该方案的主要优点是用次氯酸钠处理番茄种子，这为观察番茄胚胎提供了基础。从开花或DAF后3至23天开始化学制备和收获茄子果实。

立即将果实放在冰上，并根据开花后的天数将它们分为早果、中果和晚果。将早期的水果打碎，放在载玻片上，在体视显微镜的1倍至4倍放大镜下用精密镊子仔细收集新鲜种子。对于中后期水果，将水果掰开，用精密镊子直接收集新鲜种子。

在传统方法中，将新鲜收集的种子立即转移到含有1.5毫升FAA固定剂的两毫升离心管中，并在室温下以5rpm的速度将管放在轨道振荡器上四小时。然后将种子在70%95%和100%乙醇中以5rpm的速度在轨道振荡器中脱水一小时。完成后，将种子放入载玻片上存在的三到五滴透明溶液中，并用盖玻片轻轻覆盖。

使用单个凹面载玻片进行中后期种子。根据种子的发育阶段，在室温下孵育它们以进行清除。孵育后，用微分干涉对比观察样品，或配备数码相机的DIC显微镜以10倍，20倍和40倍放大倍率观察样品。

实时调整和优化每个样品和捕获图像的透射光亮度、DIC滑块和聚光镜孔径。将从破碎的水果中收集的新鲜种子转移到装有1.5毫升消毒剂溶液的两毫升离心管中。在室温下将样品在轨道振荡器上以30rpm孵育3至50分钟。

一旦最里面的种皮轮廓清晰可见，就丢弃消毒剂溶液。对于中后期种子，将种子转移到载玻片上。使用镊子和解剖针在体视显微镜的1倍至4倍放大镜下去除种子粘液。

使用镊子将种子转移回原始离心管中。在1.5毫升去离子水中洗涤五次，每次10秒，然后丢弃去离子水。接下来，将双倍体积的澄清溶液添加到种子中。

根据种子阶段，进行0至50分钟的间歇真空处理，每次真空处理10分钟后间隔10分钟。真空处理后，更换澄清溶液。为了便于清除种子，请将离心管置于室温下避光30分钟至7天。

对于晚期胚胎，每天用新鲜的透明溶液替换溶液，然后将种子进行真空处理10分钟。将清除的种子放在载玻片或单个凹面载玻片上。使用配备数码相机的DIC显微镜，实时调整和优化每个样品的透射光亮度，DIC滑块和聚光镜孔径并捕获图像。

在清除石蒜种子的传统方法中，致密的胚乳细胞在3和6 DAF处阻断了早期胚胎的可视化。种子生长过程中渗透率降低导致9 DAF后图像模糊。种子粘液和种皮逐渐变密，从13 DAF开始阻止清除剂的渗透。

尽管延长了7天的治疗时间，但14至19个DAF种子中的胚胎轮廓非常模糊。22 个 DAF 种子的内部结构完全看不见。由种皮表皮细胞产生的剥离种皮粘液从13 DAF开始突出。

次氯酸钠处理能够清晰地识别内种皮和大部分粘附粘液的分离，而不会损坏种子。在优化的清除方案中，种子在所有测试的发育阶段都表现出令人满意的透明度。在3 DAF处观察到种皮的不同细胞层，在5 DAF下可区分胚乳细胞，在7 DAF下观察到棍状胚胎，在9 DAF处观察到球状阶段，在11 DAF下观察到心脏阶段。

在优化方案中，在胚胎发育的各个阶段很容易捕获子叶和枝顶端分生组织的卷曲程度。灭菌可去除种子粘液和种皮色素，从而增强种子渗透和可视化。真空处理可以加速清除溶液的渗透。