该协议意义重大，因为它使研究人员能够将商业或内部制造的hiPSC-CMs成熟为成人样表型，从而显着提高hiPSC-CMs在心脏毒性筛查中的预测价值。该协议的主要优点是它以高通量形式提供成熟的hiPSC-CM，用于钙或电压变化的光学映射。该方案可用于研究疾病机制或筛查药物的心脏毒性。
演示该程序的将是我实验室的研究助理Jeffrey Creech。首先在心肌细胞铺板前 1 小时用 200 微升汉克平衡盐溶液或 HBSS 洗涤成熟诱导细胞外基质或 MECM 板两次。保持井水充足。
将心肌细胞管从液氮罐转移到干冰上，并通过稍微打开管盖来释放压力。接下来，重新密封管盖并在水浴中解冻 4 分钟。细胞解冻后，在打开试管之前用70%乙醇喷洒试管。
用1毫升移液管将细胞转移到15毫升锥形管中。向冷冻管中加入 1 毫升电镀介质，并将洗涤液转移到 15 毫升锥形管中。然后，慢慢滴入1毫升电镀介质并搅拌管子。
重复此操作，直到转移8毫升电镀介质。将15毫升管以300×g离心5分钟，然后将沉淀重悬于1毫升电镀介质中。取出等分试样，在加入电镀培养基之前用血细胞计数器进行活细胞计数，以获得每毫升第 5 个细胞的 7.5 x 10。
使用多通道移液器在MECM包被的96孔板的每孔中分配100微升细胞悬液，并将细胞孵育2天。接下来，用200微升维持培养基更换培养基，并保持板7天，第5天更换培养基。在第7天，如文本中所述进行EP测定。
确保在选择延长细胞培养物时每隔一天更换一次培养基。为了通过磁性激活细胞分选或MACS纯化hiPSC-CM，吸出细胞培养基并用1毫升HBSS洗涤细胞，然后通过加入1毫升0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸或EDTA来解离细胞，并将细胞孵育10分钟。然后，通过用2毫升电镀培养基重新发送和单调化细胞来灭活胰蛋白酶/ EDTA。
从六个孔中，使用70微米过滤器将细胞收集到50毫升锥形管中。用3毫升电镀介质洗涤过滤器后，计数细胞。计数后，离心并用2毫升冰冷的MACS分离缓冲液洗涤细胞沉淀，然后沉淀并将细胞重新发送到每5 x 10的80微升冷MACS分离缓冲液中至第6个细胞。
加入20微升冷的非心肌细胞消耗鸡尾酒，混合悬浮液，然后在冰上孵育10分钟。用4毫升冷MACS分离缓冲液以300×g洗涤细胞5分钟后，将沉淀重悬于80微升冷MACS分离缓冲液中。向第 6 个细胞中每 5 x 10 加入 20 μL 冷抗生素素微珠，并在冰上孵育 10 分钟之前轻轻混合细胞悬液。
在样品孵育时，将装有30微米预分离过滤器的正去痕柱放在MACS分离器上，并将标记的15毫升收集管放在柱下方。接下来，用 3 毫升冷 MACS 分离缓冲液灌注每根色谱柱。将抗体处理的细胞悬液与2毫升MACS分离缓冲液混合，并将其添加到色谱柱中。
向每根色谱柱中加入2毫升MACS分离缓冲液，并收集12毫升流通心肌细胞悬浮液。离心心肌细胞并弃去上清液，然后将心肌细胞重悬于1毫升电镀介质中。为了确定浓度，在将纯化的心肌细胞接种在MECM 96孔板上之前，对细胞计数并将体积调节到所需的接种密度。
吸出并用 100 μL 电压敏感染料或 VSD、钙敏感荧光团或 CSF 替换心肌细胞维持培养基，每孔 96 孔板。孵育30分钟后，用测定培养基或HBSS替换染料。在使用高通量光学映射设备获取基线数据光学映射之前，在 37 摄氏度下平衡细胞。
为了用用于急性暴露测试的药物处理细胞或绘制长期暴露于目标药物的细胞，请将药物稀释在二甲基亚砜或DMSO中，并将它们作为储备溶液储存在20摄氏度下，然后再将它们稀释到所需的浓度在HBSS中。对于 96 孔板的心脏毒性测试，添加四剂化合物，每剂至少八孔。使用从低于到高于临床有效治疗血浆浓度的剂量，包括有效剂量。
与药物应用前的基线电生理学测量类似，在药物治疗后至少 30 分钟捕获电生理学记录以进行慢性研究。基线记录后，将每种药物至少四剂施用于表达GCaMP6m的成熟hiPSC-CMs单层，每剂至少8个孔。平衡细胞上的药物30分钟，并在数据采集之前和期间将细胞加热至37摄氏度。
在整个板的基线记录之后，向每个孔中加入500纳摩尔异丙肾上腺素，以获得可靠的药物反应数据，并量化异丙肾上腺素对单层跳动率，收缩幅度和钙瞬时持续时间的影响。要获取光学映射数据，请打开前抽屉并将板放在板加热器上。打开采集软件并确定软件中的文件保存位置后，选择10至30秒的采集时长和帧率以获得更高的时间分辨率，然后单击开始采集。
打开分析软件，在"导入过滤器"选项卡中，选择"浏览单个文件"或"平铺多个"以重建板。选择文件并输入行数和列数，然后选择"自动"。接下来，选择更新像素大小，输入每像素的距离，然后使用孔向导确定孔在图像中的位置，然后单击处理保存并移动到下一个选项卡。
打开ROI或感兴趣区域选项卡，然后选择手动，自动或根本不使用ROI绘制ROI，这将考虑用于分析整个板。选择井中的区域后，单击"处理保存"按钮进入下一步。选中隐藏井和仅显示筛选框以可视化投资回报率。
打开"分析"选项卡，选择每个孔或ROI以确认自动拍频检测的准确性。通过选择单个节拍并按键盘上的 Delete 键，在轨迹中添加或删除节拍。完成后，单击保存。
接下来，单击分析选项卡中的时空图按钮并添加线以确定时空图，以可视化每个井的数据或ROI。选择水平线或垂直线后，单击"生成绘图"。确保准确的节拍检测后，进入 出口 选项卡并选择 文件格式，输入 节拍统计 选项，然后单击 出口.
导出后，打开数据文件并运行所选的统计分析例程。相衬成像显示，接种在MECM上的hiPSC-CMs成熟，并且在结构上与重新铺在小鼠ECM上的同一批hiPSC-CMs不同。成熟细胞变成杆状，而未成熟细胞保持圆形。
用α-肌动蛋白抗体染色的心肌细胞显示出在每个ECM条件下培养的细胞的典型形状。与TnI染色一致，α-肌动蛋白染色表明，在MECM上成熟的hiPSC-CMs促进了杆状成熟表型并诱导了更大的肌节组织。在小鼠ECM和MECM上培养的细胞之间的线粒体含量和活性是不同的。
使用VSD和光学映射系统记录的动作电位的电生理数据显示，心房特异性细胞的自发搏动率明显更快，动作电位持续时间（APD80）比心室特异性细胞短。APD80等参数的全板热图揭示了板内给定参数的重现性。成熟hiPSC-CM单层的典型动作电位表明分离和测试的成年心肌细胞的动作电位形态。
还显示了典型的动作电位自发节律。响应异丙肾上腺素，β-1-肾上腺素能受体的激活引起正变时性、正性肌力和正光性。使用 GCaMP6m 钙荧光监测节律，研究了 HiPSC-CM 对人 Ether-a-go-go 相关基因或 hERG 通道阻滞剂（包括 E-4031、多潘立酮、凡德他尼和索他洛尔）的反应。
该研究表明，检测出由E-4031 hERG通道阻断引起的早期后去极化。快速处理悬浮细胞，并通过轻轻移液细胞来避免剪切应力。此外，请仔细更换培养基，以免损坏 hiPS 合胞体。
按照这一程序，细胞适合收集蛋白质、RNA、DNA 和脂质，以便使用研究人员最喜欢的技术进行分析。该技术使研究人员能够使用成人样心肌细胞研究疾病并测试新药的心脏毒性。
