使用质谱法表征单个神经元中的RNA修饰

通过该协议，我们引入了第一种能够同时分析单个神经元中多个RNA修饰的方法，从而开辟了涉及单个细胞转录后调控的新研究领域。通过利用优化的样品制备条件和液相色谱串联质谱，可以在每个实验的单个神经元中检测和定量十几种修饰的核苷。单个细胞在功能，形态和化学特征方面是不同的。

重要的是，我们能够测量这些细胞的完整化学马赛克，包括它们的RNA谱，以便足够的细胞了解它们在健康和疾病方面的差异。单神经元分离前神经节准备的程度取决于执行分离的个体的偏好。尝试更长和更短的蛋白酶治疗以确定合适的条件。

首先，将麻醉的加州阿普利西亚腹侧朝上放在解剖托盘中。开始用手术剪刀解剖它，一个钝尖朝向动物，小心地在脚上做一个纵向切口。将动物身体的喙、尾侧和外侧固定，暴露体腔内的内脏和中枢神经系统神经节后，通过手术切断神经和一些起源于神经节的结缔合物，将主要的中枢神经系统神经节与动物隔离开来。

将神经节浸入每毫升蛋白酶XIV型10毫克溶液中，并在34摄氏度下孵育30分钟至1小时。接下来，用人造海水抗生素溶液冲洗神经节六次。然后使用已切割至五毫米开口的聚丙烯转移移液管，将所有神经节转移到装有人造海水抗生素溶液的硅胶聚合物涂层皿中。

保持神经节始终淹没在人工海水中。接下来，要去除神经节鞘，请固定神经节并使用微剪刀和细镊子。通过足够强的酶处理，使用玻璃或金属针头进行出鞘。

直观地识别感兴趣的神经元。使用混合的玻璃毛细管或尖锐的钨针，小心地将识别的细胞与本体神经节分离。将约一微升的人造海水吸入塑料微量移液器后，将分离的细胞转移到含有四微升0.365摩尔乙酸铵的PCR样品管中。

对于空白测量，从含有神经节的培养皿中收集5微升等分试样的人造海水抗生素溶液，并与消化缓冲液混合。通过重复抽吸和省去0.365摩尔乙酸铵中的微量移液器来裂解分离的神经元。有些细胞可能不会立即破裂。

要裂解它们，请用混合的玻璃毛细管在细胞的直径上施加压力。接下来，在向样品中加入3.375微升RNA消化缓冲液之前，在热循环中加热样品。使用微量移液器混合该溶液，方法是多次取出和分配溶液。

使用微型台式离心机旋转任何附着在PCR管壁上的液滴。然后将样品在热循环中在37摄氏度下孵育三小时，然后在10摄氏度下保持，加热的盖子设置为On.一旦样品冷却，立即将7微升溶液转移到装有250微升插入物的自动进样器小瓶中，在自动进样管中不会形成任何气泡。为了制备用于分离规范核苷和修饰核苷的液相色谱系统，使用99%流动相A和1%流动相B在36摄氏度下以每分钟0.2毫升的流速平衡C18色谱柱12分钟。

在正向模式下操作质谱仪，将分流阀设置为在分析的前两分钟内浪费，并在剩余的运行中进行源。然后收集110至600的m / z范围内的质谱。使用从数据库构建的首选质量列表和0.5的隔离窗口，在35至40电子伏特的三秒钟周期时间内选择用于碰撞诱导解离的离子。

使用活性排除在三次光谱后从碎裂中排除离子。为强度分别高于和低于 50， 000 计数的离子设置动态 MS/MS 谱采集，分别为 4 赫兹和 1 赫兹。离子选择的最小阈值为1， 990计数。

对于通过质谱法进行的定量单神经元RNA修饰分析，使用提取的离子色谱图峰面积构建校准曲线，该峰区域以至少五种浓度获得用于修饰核苷标准品，以允许插入未知的内源性分析物浓度。通过质谱法进行单神经元RNA修饰分析涉及将鉴定的神经元手动分离成小样品体积，以进行裂解消化和LC-MS / MS分析。通过质谱分析的单神经元RNA修饰分析常规检测到来自加利福尼亚Aplysia中枢神经系统的单个神经元中的十几种RNA修饰，代表了该动物在单个细胞中近一半的已知上转录组的覆盖率。

结果首次揭示了单个细胞的RNA修饰图谱可能与同一组织中的本体细胞不同。从单独的动物队列中获得对独特修饰的核苷模式的进一步支持，其中对13个RNA修饰进行了成对比较，通常在单个神经元和块组织中检测到。功能不同细胞中的RNA修饰在评分图中形成独特的簇，而同源R2 / LPl1神经元共聚类。

加载图表明，差异主要是由甲基腺苷的位置异构体的丰度驱动的，包括2'O-甲基腺苷和N1-甲基腺苷。生成N1-甲基腺苷、假尿苷、2'O-甲基鸟苷、2'O-甲基腺苷和N6-二甲基腺苷的外部校准曲线。通过插值法测定了脑膜细胞和R2/LPl1细胞对中各修饰核苷的量。

确保将最小体积的人工海水与单个分离的神经元一起转移到PCR管中。这最大限度地减少了样品稀释，最终影响了分析物检测。该方案可用于研究亚细胞结构（如轴突和树突）中RNA修饰的分布，以提高对活性依赖性局部翻译机制的理解。