海马神经元培养检测和研究自身免疫性脑炎中涉及的新型致病抗体

该协议意义重大，因为它使我们能够确定患者样本是否含有致病抗体。该技术的主要优点在于它能够区分表面抗原和细胞内抗原之间的反应性，这不容易被其他方法区分。培养海马神经元用于识别新的抗体。

这些新抗体的鉴定最终允许启动特异性单一疗法，以改善患者的预后。这种技术很重要，因为它可以扩展到与针对神经元表面蛋白的致病抗体相关的整个疾病领域。用细弯曲的镊子握住胚胎头，用一对细直镊子以45度角刺穿眼眶。

然后松开细弯曲的镊子。在手术剪刀的帮助下，从枕骨到额骨解剖皮肤和颅骨。然后用一对细小的弯曲镊子取出大脑，并将其收集在六厘米的盘子中，冬眠加B27。

一旦所有胚胎的大脑被恢复，使用细直的镊子将端脑分开。接下来，准备一个 10 厘米的培养皿，将冬眠加 B27 滴在一厘米的距离上成一圈，每滴放置一个端脑，以 1.25 倍放大倍率通过解剖镜进行可视化。在显微镜下工作时，小心地去除丘脑，并剥离脑膜以更好地观察海马体。

然后用精密弹簧剪刀解剖海马体。并将其放入3.5厘米的盘子中，冬眠加B27，并放置两个。重复该过程以收集所有海马体。

对于海马体的酶解离，在含有海马体的50毫升管中加入一毫升2.5%胰蛋白酶。用HBSS将管中的体积降至5毫升后，将管在37摄氏度的水浴中孵育15分钟。为了进一步稀释胰蛋白酶，加入10毫升预热的HBSS，然后将管子放回水浴中，设置为37摄氏度五分钟。

接下来，使用1000微升微量移液管将显示为粘液块的海马体转移到50毫升管中。并如图所示，用六毫升预热的HBSS孵育组织五分钟。为了机械地解离组织，将海马团转移到具有锥形底部的两毫升管中。

加入一毫升预热的DMEM培养基后，用1000微升微量移液管轻轻上下吸气，使沉淀均质化。确保不会产生气泡，用预拉式玻璃移液管重复上下吸液 10 到 20 次，其尖端与管的锥形底部接触，直到混合物半透明。计数细胞，然后将它们均匀地分布在3.5厘米的培养皿上，并交叉摇晃。

完成后，将培养皿放入装有5%二氧化碳的培养箱中。对于14天的体外细胞荧光免疫染色，将含有抗NMDAR抗体的样品添加到盖玻片中，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育。一小时后，用4%甲醛和PBS作为固定溶液在室温下处理样品五分钟。

然后用PBS洗涤样品推力，每次五分钟，然后在室温下加入二抗山羊抗人Alexa Fluor 488，稀释1至1000小时。接下来，用液体封片剂安装装有样品的盖玻片，并吸出任何剩余的液体。用荧光成像可视化神经元。

对于钙成像，使用在盖玻片上生长的体外细胞 14 至 18 天。在成像之前，用编码pAAV2 CAG GCaMP 5G的病毒载体以每毫升2.5乘以10至第10个基因组拷贝数处理细胞5至7天。成像前一天，将细胞与患者样本孵育24小时。

在成像当天，准备设置并将显微镜细胞室设置为37摄氏度。用蒸馏水填充通道，注入5%的二氧化碳以维持细胞生理状况。用细胞外生理溶液覆盖细胞后，将它们转移到显微镜细胞室中。

加入10微摩尔NBQX阻断AMPA和KA受体，并可视化NMDA受体反应。获取四分钟的短片，每100毫秒记录一次帧。开始采集后不久，在培养皿中加入刺激溶液。

刺激后，使用图像 J.It 等处理软件从与对照和患者脑脊液或脑脊液样品孵育的培养物中提取随时间推移的荧光信号，观察到一天体外的细胞均匀分布并粘附在平板上，细胞体周围形成薄片，小神经突开始延伸。培养几天后，神经突延伸了一小段距离，细胞显示出明显的极化。神经元网络不断增长并变得复杂。

在18天时，神经元成熟，相互连接，并构建了神经元网络。代表性荧光图像显示使用选择性标记物在18天时成熟神经元。将培养物与患者样品孵育会产生强烈的荧光信号，因为它含有识别神经元表面存在的NMDA受体的自身抗体。

相反，对照样品在施用于神经元培养物时不产生荧光信号。NMDA的应用增加了荧光强度，如细胞内绿色荧光的变化所示。当应用刺激器时，用对照CSF样本处理的神经元显示出比用患者CSF样本处理的细胞更高的荧光强度差异。

海马体的性质鉴定和解剖决定了培养物的纯度。细胞聚集是一个关键因素，特别是当使用培养物进行成像时。此外，培养的海马神经元与免疫沉淀和质谱技术相结合时，可用于鉴定新型抗体及其靶抗原。

该技术允许表征一类新的抗体介导的疾病。因此，它在纳米免疫学这一新领域的研究中至关重要。