原代人鼻上皮细胞模型的收集、扩增和分化，用于定量纤毛搏动频率

我们描述了从鼻粘膜收集气道干细胞。这些细胞在实验室中扩增并分化成假分层上皮。这是体外扩张和分化，类似于我们体内的气道，这意味着存在可用于量化纤毛搏动频率的特化细胞，例如纤毛细胞。

为了能够对不同个体之间的纤毛搏动频率进行一致且可重复的定量，以及对不同药物的反应，我们对培养条件和图像采集进行了标准化。纤毛搏动频率测量被用作原发性睫状肌运动障碍等疾病的临床工具。我们希望将其确定为囊性纤维化的临床标志物。

演示该程序的是我实验室的博士生Katelin Allan和Laura Fawcett，以及我实验室的博士后Sharon Wong博士。首先要求参与者用嘴呼吸。然后用惯用手拿一把细胞学刷，将第五个手指放在参与者的下巴上以固定手，将细胞学刷插入参与者的鼻腔通道，与参与者的脸部成45度角，然后通过鼻道。

将刷子直立旋转后，使其垂直于参与者的脸部，轻轻但坚定地将刷子靠在下鼻甲下方的鼻子侧壁上，直到它位于下鼻甲的中到后部。将画笔旋转 360 度，最多旋转三次。然后轻轻地将其取出，逆转插入操作，以使细胞不会从画笔上脱落。

将刷子放入带有鼻细胞收集介质的准备好的收集管中，然后将收集管放在冰上。轻轻涡旋将细胞从刷子中移开后，将冰上的收集管转移回生物安全柜。使用血清移液管将培养基从收集管转移到新管中，留下细胞学刷。

然后离心样品。离心后，将细胞沉淀重悬于一毫升有条件的重编程细胞培养基中。然后使用5毫升血清移液器，以圆周运动将细胞通过放置在50毫升管顶部的细胞筛。

要获得单细胞悬浮液，请从管底部收集悬浮液，并将其多次通过筛子。然后丢弃细胞筛。为了将气道上皮细胞接种到准备好的可渗透支撑插入物上，请将细胞充分混合而不会产生气泡，确保它们是均匀的并且悬浮。

然后将150微升细胞悬液添加到制备的渗透性支撑插件的顶端侧。为了分化气液界面处的气道上皮细胞，请将它们在分化或ALI培养基中培养两天。然后吸出培养基，仅向基底隔室中加入750微升ALI培养基以形成气液界面。

为了在ECM圆顶中接种气道上皮细胞，用适当体积的90%ECM重悬解离的气道上皮细胞。然后将移液器垂直保持在尽可能靠近孔底部的90度角，将50微升ECM细胞悬液分配到孔的中心。将板在 37 摄氏度下孵育 20 分钟，直到 ECM 凝固。

当ECM凝固时，将气道类器官播种培养基（AOSM）加热至室温，以防止其引起再液化，并在添加时分解ECM圆顶。孵育后，通过分配孔壁向每个孔中加入500微升加热的AOSM。请勿将培养基直接移液到 ECM 圆顶上。

每两天更换一次介质，持续四到七天。要吸出培养基，请将板倾斜 45 度角，并从孔的底部边缘远离 ECM 圆顶吸出。四到七天后，通过向每个孔中加入 500 微升加热的气道类器官分化培养基 （AODM） 来启动类器官分化，并每两天更换一次培养基，持续 7 天。

将含有气道上皮细胞模型的培养板放入显微镜板插入物中，并关闭显微镜环境室。让样品在预热的37摄氏度，5%二氧化碳填充的显微镜室中平衡30分钟。在显微镜目镜处，聚焦于细胞模型。

然后使用采集软件，单击L100将光路切换到安装摄像机的端口。单击绿色的播放按钮，通过软件可视化显微镜视野。检查纤毛是否对焦，并根据需要进行调整。

要从菜单中获取延时图像，请单击"获取"，然后单击"快速延时摄影"。在弹出窗口中，选择保存位置和文件名，获取 1， 000 帧。要在显微镜视野中预览纤毛，请单击"应用"，然后单击绿色的"播放"按钮。

如果需要，调整 Z 焦点。然后单击立即运行以捕获快速延时摄影。安装必要的软件和工具箱后，将相应的自定义分析脚本和支持脚本文件夹复制到计算机的本地驱动器。

接下来，在计算软件上，单击"主页"选项卡，然后单击"设置路径"。在弹出窗口中，单击"使用子文件夹添加"。在 MATLAB 搜索路径下，选择显示的文件夹。

然后点击保存并关闭。通过检查分析脚本是否显示在左侧面板中来确认它们已链接到计算软件。接下来，将获取的示例原始图像文件传输到计算机的本地驱动器。

然后单击BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove。计算软件中的m分析脚本文件。要运行脚本，请单击"编辑器"选项卡，然后单击绿色的"播放"按钮。

在出现的提示窗口中，选择要分析的原始图像文件。输入每帧采集时间的曝光时间。然后点击确定。运行 GetFirstAmplitude。

m 脚本在包含 AveSpectrum 文件的文件夹中。等待脚本输出第一振幅堆叠。XLSX文件，其中包含最高的振幅频率，并且在气道上皮纤毛跳动的生理范围内。

从第一振幅堆叠中复制频率值。XLSX文件，并使用科学分析软件绘制它们。介绍了在气道上皮细胞ALI模型中测量的纤毛搏动频率的结果，这些模型来自三名囊性纤维化参与者和三名健康对照参与者。

在培养分化的第14天，出现跳动纤毛。从培养分化的第14天，第21天开始，队列之间没有观察到纤毛搏动频率的统计学显着增加。在培养分化的第21天，健康对照组受试者的平均纤毛搏动频率明显高于囊性纤维化受试者。

此外，当在去除粘液后的相同细胞模型中对纤毛搏动频率进行成像时，在健康个体和囊性纤维化的ALI模型中去除粘液时，纤毛搏动频率在统计学上显着增加。必须严格调节成像环境，因为纤毛功能极易受到环境因素变化的影响。该平台有可能建立用于患者特异性药物筛选，以便能够识别调节CFTR功能的药物。