用于细菌筛选、选择和分离的可光降解水凝胶接口

该协议旨在从筛选界面中快速分离细胞以进行基因组表征，并且此功能非常重要，因为它可以将宏观可观察的细胞特征与基因组信息相结合。使用该技术，可以以操作简单的方式分离来自筛选界面的靶向细菌细胞，具有高空间位置。水凝胶可以在其他筛选接口中实现。

水凝胶材料可以很容易地掺入微流体通道中，以便从微流体装置中按需检索细胞。首先接种具有所需细胞密度的交联缓冲液。通过加入12.5微升交联缓冲液和5.6微升PEG ONB二丙烯酸酯溶液，在0.5毫升微量离心管中制备水凝胶前体溶液。

最后，向混合物中加入6.9微升前臂PEG硫醇溶液。对于水凝胶前体溶液中的细胞封装，将硫醇化的基础盖玻片放在干净的培养皿上，并在盖玻片的两个相对侧放置两个垫片。通过将垫片贴在培养皿上，将垫片固定在底盖上。

在非反应性全氟烷基化载玻片上加入所需体积的前体溶液后，将载玻片放在基盖玻片上，并允许水凝胶在室温下完成25分钟。凝胶化完成后，轻轻除去全氟烷基化的载玻片。将底物置于含有补充有抗生素的ATGN培养基的60×15毫米培养皿中。

在微孔阵列底物上播种700微升具有0.1 OD 600的细菌细胞悬浮液，并使用pH 8的12.5微升磷酸盐缓冲盐水ATGN使水凝胶前体溶液如前所述。在非反应性全氟烷基化载玻片上移取12.5微升的前体溶液，并将两个38微米的钢垫片放在微孔阵列基板的两个相对侧，用细胞接种。然后用前体溶液液滴倒置全氟烷基化的载玻片，并将液滴置于微孔基板的中间。

当水凝胶在室温下孵育25分钟后形成时，轻轻地从微孔底物中取出载玻片，并将底物置于含有补充有抗生素的ATGN培养基的培养皿中。将样品放入PDMS支架中，并将定义的培养基添加到样品顶部，以防止样品脱水，并为释放的细胞提供载体溶液。将校准镜就位后，调整显微镜焦点以获得水凝胶或微孔阵列内菌落的清晰图像，并检查以识别感兴趣的菌落或孔。

在这里，设计光模式，同时相机视图显示样品内的菌落，以测试不同的细胞提取模式并保存定义的模式。然后选择会话控制部分，在标题为图案照明工具产品名称的选项卡下添加保存的序列。选择用于刺激图案的选项以查看和调整所需的曝光位置。

接下来，在LED控制选项卡下将光强度调整为60%，将曝光时间调整为40秒，然后开始曝光过程。实时监测水凝胶降解和明场模式，以确保细胞释放。要收集释放的细胞，请将显微镜滤光片从明场更改为TRITC，以肉眼可视化样品的暴露区域。

找到暴露区域后，将管子的末端放在照射的点上，然后将显微镜滤光片更换回明场以实时监测细胞检索。使用连接到管子另一端的注射器小心地抽出含有释放细胞的200微升溶液，并将溶液转移到1.5毫米离心管中进行DNA分析或电镀。使用不同的紫外光微模式从大量水凝胶中提取细胞，这影响了释放细胞的形态。

环形图案的紫外线暴露导致整个菌落释放，封装在保护性PEG水凝胶中。相反，通过将部分或全部菌落暴露在紫外线下，细胞可以作为聚集的细胞簇或游离的单个细胞被提取。水凝胶的细胞接种密度和厚度对于细胞封装很重要。

较薄的水凝胶产生具有最小菌落重叠的微菌落，而厚度增加的水凝胶导致重叠的菌落，这可能导致多个菌落的提取。由于光图案的二维性质，重叠的菌落在提取过程中会导致交叉污染。当一个顶级殖民地成为目标时，底层殖民地也被提取出来。

还评估了各种紫外光微模式对细胞活力的影响。当微菌落暴露于受控剂量的圆形或交叉模式的紫外线时，细胞恢复和DNA纯度不受影响。使用这种方法成功地从微孔阵列中检索细胞，这从代表性的共聚焦显微镜图像中可以明显看出，其中在圆形和环形图案中照射时，细胞以各自的图案被移除。

从微孔阵列中提取后，评估细胞活力和DNA数量。暴露模式既不影响活细胞计数，也不影响DNA质量，表明可以从微孔中选择性地检索活细菌细胞，损害最小，并且它们的DNA可以高纯度分离用于下游基因组分析。在除去全氟烷基化的盖玻片之前，请务必检查水凝胶是否已经形成。

放置用于水凝胶沉积的垫片和使用管道提取细胞需要精确和小心。