在自制迷你生物反应器中从诱导多能干细胞中生成脑类器官

迄今为止，从多能干细胞中分化的脑类器官是最接近天然人脑组织的体外3D模型。此外，脑类器官同样适用于模拟各种中枢神经系统病理学，测试药理活性物质，也可用于再生医学。同时，这项技术仍处于发展的初始阶段。

该协议可以根据获得聚集体的方法和分化的进一步培养分为两组。第一种包括分化方案和方案，在培养时间和分化诱导剂方面有所不同，随后在特殊的低粘附装置（如市场管或板）中在振荡器中成熟类器官。另一组包括使用特殊的生物反应器。

对各种方案的分析表明，类器官应在循环营养培养基的条件下培养。然而，由于缺乏简单而廉价的系统来获得具有标准尺寸和形态的类器官，因此需要开发这种设备来缩放该过程。在这项工作中，我们描述了我们获得和测试简单而廉价的微型生物反应器的方法，这些反应器可以获得大量高质量的类器官。

将无菌的15毫升离心管切成7或8毫米高的环。高压灭菌环。将经过处理或微生物培养皿上的低聚集物分解成碎屑。

将约1克塑料屑溶解在10毫升氯仿中过夜，以制备液体塑料。在无菌超低粘附力6厘米培养皿的中心制作一个塑料旋钮。有两种同样合适的方法。

首先，将高压灭菌器放在中心的塑料环中，并将半毫升液体塑料涂在环的内部。第二个，没有任何塑料环，在培养皿的中心掉落半毫升的液体塑料。将盘子在层流罩中打开2或3小时，直到完全干燥。

在培养基中培养诱导多能干细胞，用于多能干细胞，在35毫米培养皿中融合高达75%或90%，预先涂覆溶解在冷Dulbecco改性鹰培养基和Fisher-12培养基中的基质。准备培养基 A 加血清替代治疗。用血清替代物在培养基中培养诱导多能干细胞1天。

在分化零天将多能干细胞培养基换成血清替代培养基。准备培养基A.在分化的第2天将培养基改为培养基A。在培养基A中培养细胞2周，每2天在培养皿中清爽培养基。

在第14天，使用特殊的24孔培养板开始形成球体，该培养板在每个孔中含有约1， 200个微孔。准备一个带有微孔的24孔培养板。向每个孔中加入1毫升培养基A，在装有板架的摆动桶形转子中以1， 300g短暂离心5分钟。

在显微镜下控制微孔中没有气泡。准备培养基B.从培养皿中取出培养基。对于细胞脱离，用PBS上制备的1.5毫升EDTA溶液处理细胞。

在显微镜下控制细胞脱离。将细胞收获到15毫升管中。在管中加入5毫升混合的Dulbecco和Fisher培养基，朝向细胞。

以200g离心5分钟。除去上清液并将细胞重新悬浮在2毫升培养基B中，将含有10亿个细胞的细胞悬浮液转移到具有微孔的24孔板的每个孔中。轻轻地上下移液细胞几次，并短暂离心100g1分钟以捕获微孔中的细胞。

在显微镜下控制细胞均匀分布在微孔中。将板孵育过夜，使细胞聚集在球状体中。第二天早上，第15天，在显微镜下检查球体的质量，如果健康，它是透明和光滑的。

小心地将每个孔中的球体收集到15毫升的管中，让球体通过重力沉淀2和3分钟，然后除去上清液。加入2毫升基质的球体，在冰上解冻和暂时解冻。通过移液轻轻混合，并在室温下孵育30分钟。

为了洗涤多余的基质，将8毫升培养基B.移液器轻轻地加入管中，然后在100g下离心管1分钟。除去上清液。加入20毫升培养基B的管中，轻轻移液，然后在小型生物反应器之间拆分球状悬浮液。

然后将迷你生物反应器放入15厘米的培养皿中，以防止水分蒸发和污染。将带有迷你生物反应器的培养皿放在轨道振荡器上。以70，75rpm的旋转速率培养类器官。

在第16天，准备培养基C.将类器官转移到50毫升管中。5分钟，让它们落到底部。吸出上清液并加入5毫升培养基C.在迷你生物反应器中重新加入类器官。

在培养基C中培养球体2周，每2天刷新培养基。在这2周内，每个迷你生物反应器选择约100个球体进行以下培养。第30天，准备培养基D.将培养基改为培养基D，这是一种成熟培养基。

每2或3天刷新一次培养基，持续3周。然后使用溶解在F和GDNF中的培养基D。在培养基A和B中连续培养1个月后，获得大小和形态标准化的类器官。

随着它的增长，他们需要更频繁地更换培养基，每周最多4次也会增加。经过2个月的栽培，它们的直径达到4和5毫米。又过了一个月，5毫米和6毫米，生长停止。

该图显示了类器官酶的外观，用苏木精和曙红涂有清晰的部分。持续 1 个月的免疫组化分析显示存在 SOX2 阳性祖细胞簇，包括中央部分内部。在类器官的外周，神经胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2和噻嗪水解酶阳性。

细胞是浓缩的，这对应于成熟形式的神经元。在某些情况下，在中央部分形成坏死区域的白色簇。这表明该协议对于获得较大的类器官具有局限性。

最有可能的是，生长的限制因素是营养和氧气的扩散速率。球体的各种介质和细胞类型，并测试我们的系统是否存在某些种类的类器官。大量的脑和视网膜，来自肝癌细胞和间充质干细胞的组合类器官，来自资本爆炸间充质干细胞调用的组合类器官以及来自诱导多能干细胞和肠类器官的造血干细胞分化。

它在细胞的初始组成中是可变的吗？分化因子、培养基和培养基、细胞外基质，可能还有气体混合物组成、平台旋转速率和其他参数。有可能在各种器官和组织中获得具有相同形状，大小或形态模型的类器官。

微型生物反应器的使用被提议纳入这项工作。