该协议提出了一种从发育中的大脑在单个轴突水平上实时成像，飞行嗅觉电路组装的方法。解剖以清洁覆盖发育中的大脑的组织，我们可以从内部大脑收集高质量的图像。这种方法为电路开发的细胞生物学基础提供了有价值的见解。
它可以很容易地修改，以研究其他电路的发展。一个人在显微切割中进行稳定的手部控制需要一些时间。更多的练习会有所帮助。
首先，通过在培养皿的底面上放置0.5厘米厚的Sylgard并使其在室温下固化48小时，准备培养皿以在延时成像期间移动外植体。要准备微型针，以便使用镊子固定该板上的外植体，请将多个微型针固定在胶带上，使锋利的末端在一侧对齐，并用剪刀切割两毫米的尖端。然后使用镊子，将切割的微针插入预制的Sylgard板的Sylgard层中。
使用刷子收集白色蛹，在一小时内形成蛹，并将它们转移到新的小瓶中。将蛹在37摄氏度回火的水浴中孵育40分钟，以诱导随机类型的稀疏ORN克隆。热休克后，将小瓶置于25摄氏度下30小时，使蛹在蛹形成后30小时老化。
然后按照文本手稿中的描述准备用于外植的培养基，并在四摄氏度下储存。在成像当天，将胎牛血清，人胰岛素储备溶液和20羟蜈酮储备溶液溶解在乙醇中，加入含有45毫升施耐德果蝇培养基的50毫升小瓶中。充分混合并将15毫升的全培养基转移到新的50毫升锥形管中，并将剩余的全培养基在4摄氏度下储存一周。
然后用石蜡膜覆盖含有全介质的管开口，并通过无菌的五毫升移液器尖端以每秒一个气泡的速度泵送液体表面下的氧气气泡，使介质氧化20至30分钟。接下来，用70%乙醇对解剖井表面和先前制备的Sylgard板进行灭菌，并在使用前让它们干燥。使用刷子将30小时的APF蛹转移到薄纸上，使蛹的外表面干燥五分钟。
在载玻片上涂上双面胶带后，小心地将干燥的蛹贴在胶带的粘性表面上，背侧朝上。用刷子轻轻按压蛹，将腹侧正确连接到胶带上，而不会损坏蛹。从侧面在棕色蛹壳和蛹之间插入一个尖锐的镊子尖端，并小心地将棕色蛹壳通过一条线到蛹的后端。
一旦打开棕色蛹壳，使用镊子轻轻握住蛹并将其转移到含有一毫升含氧全介质的解剖孔中。将蛹浸入介质中，将其沉入井底。要从蛹中解剖天线脑外植体，用镊子轻轻握住蛹，并用一对微剪刀，从蛹的后侧形成一个小孔，释放蛹内部的高压。
从孔开始，穿过腹侧中线到颈部，然后切开颈部的周长，将头部与蛹的身体分离，并将身体放在不同的井中。接下来，切开覆盖大脑背侧的透明角质层，将脂肪体暴露在大脑顶部，确保保持视网膜和天线附着的角质层，同样，从大脑的腹侧切割角质层。使用P10移液器将培养基移向头部背侧和腹侧的开放区域，以轻轻冲洗掉覆盖大脑和天线的脂肪体。
为了研究双侧ORN轴突或ORN轴突与PN树突靶向的相互作用，通过在角质层和大脑之间小心地放置微剪刀的刀片并切断感兴趣的触角神经，在阶段切断触角神经。为了将解剖的外植体转移到Sylgard板上，在Sylgard表面上放置约200微升的含氧全介质液滴。通过200微升移液器吸头将来自解剖躯干的脂肪体移液几次，用于涂覆内表面，以防止外植体在从解剖孔转移到Sylgard板上的介质液滴的过程中粘附在移液器尖端上。
使用镊子将外植体固定在两个光学波瓣的Sylgard层上，然后小心地将Sylgard板放置在成像站上，用胶带固定板，并使用P1000移液器将10毫升含氧全培养基添加到Sylgard板中。ORN轴突在18小时至36小时APF之间到达触角叶，然后导航触角叶，穿过中线并创新肾小球。在注册之前，轴突随着大脑的发育而表现出一些横向漂移，并且在注册后，漂移被纠正。
通过神经矿标志物和钙粘蛋白的免疫染色揭示了提取的ORN轴突的肾小球特性。通过与内叶图比较，可以确定每个肾小球的身份。在离体培养过程中，细菌生长通常会导致嗅觉回路的静止发育。
因此，在成像前对培养皿和销进行彻底消毒并保持成像室的清洁和隔离非常重要。为了实现更高的空间时间分辨率，该外植体系统可以使用更先进的显微镜，自适应光学晶格光显微镜进行成像。虽然这里以工厂电路开发为例，但该系统可以扩展到研究中枢大脑中的其他电路和发育过程。
