使用多功能系统对人类癌症和正常细胞中Yes相关蛋白的全光学机械生物学询问

这种方法将有助于说明多方面生物学现象的分子机制。如机械生物学、光学电生理学，以及使用自动活细胞成像技术的超分辨率DNA/RNA蛋白成像。该协议可实现自动、多功能、高通量、自漂移校正和长期图像采集。

它与大多数荧光显微镜平台兼容，例如NYCOM。任何第一次尝试这种技术的人都应该了解每个步骤的功能，而不仅仅是严格遵循协议，以确保实验成功。首先将环境室置于倒置显微镜的电动载物台上。

将 CO2 流量设置为每分钟 160 毫升，并调节腔室的温度。然后将40毫升纯净水加入腔室的浴池中。从培养箱中取出装有细胞的玻璃底培养皿，并将其置于环境室中。

打开共聚焦控制器和倒置显微镜。将光路向右切换。使用微管理器观察附着的细胞。

如果有足够的细胞附着在凝胶上，将培养皿转移回培养箱。如果没有，对于B2B，继续细胞孵育30分钟，对于肺癌或PC-9细胞，继续孵育60分钟。切下2小块胶带，并将它们贴在圆孔周围的腔室上。

然后在培养皿将覆盖的胶带区域上涂上一点粘合剂。从培养箱中取出培养皿。慢慢地将培养皿放入腔室中，让培养皿的底部与胶水接触。

按压培养皿的盖子1分钟，让胶水与培养皿完全接触并凝固。轻轻水平推动培养皿，以确保胶水已经凝固，培养皿不会移动。然后合上腔室的盖子。

打开 IntelliJ 并在文件的第 93 行中设置参数 T1 elements_script.java。确保此值大于用于一个视场共聚焦成像的微距和元素的运行时间。单击"运行"按钮以启动 AMFIP IntelliJ 项目。

单击Micro Manager主界面上的实时和多点除法按钮，然后将倒置显微镜的光路切换到右侧以进行明场成像。切换到10倍物镜并打开强度设置为5%的LED灯 单击元件TI2面板中的光路显微镜物镜和LED灯按钮。调整 XY 操纵杆和 Z 平面的旋钮，以在培养皿上找到凝胶的正确位置和聚焦平面。

使用10倍物镜找到附着在凝胶上的多个单细胞的适当视场。选中多维采集窗口中的多个位置 XY 框。单击编辑位置列表按钮，然后观察弹出的阶段位置列表窗口。

将物镜更改为40倍，将LED灯的强度增加到15%重新调整XY电动载物台以定位视野并通过单击载物台位置列表窗口上的标记按钮记录坐标。记录 6 到 7 个所需的视野。单击载物台位置列表窗口中的保存为按钮，记录坐标，并将T1作为成像采集的时间间隔部分输入到多维采集窗口中时间点部分的T1。

打开元件，将光路向右更改为共聚焦成像，然后关闭LED灯。然后单击"删除联锁"按钮，并通过选中FITC框打开用于YAP成像的FITC激光通道。将扫描速度调整为每2秒1帧后，旋转Z平面的旋钮以快速找到所附着单元格的Z位置。

记录 Z 堆栈的下限和上限。单击顶部功能区上的宏，在宏下拉菜单下选择宏编辑器，然后将 Z 堆栈的下限和上限输入到宏文件中。通过选中 DAPI 框来查找并记录磁珠的聚焦 Z 位置，打开 DAPI 激光通道以进行磁珠成像。

转到宏编辑器并将记录的值输入到宏文件中。要设置使用AMFIP移动电动舞台的任务，请转到Micro Manager，单击插件自动化以打开AMFIP的图形用户界面。然后单击添加点或删除点按钮以获取所选视场的确切数量。

将视野的记录坐标输入到坐标面板中。在总实验时间文本字段中定义总实验时间。单击附加时间配置按钮，并定义将电动载物台移动到每个FOV的时间间隔T2。

最大化元素的窗口大小，并将AMFIP的GUI拖动到屏幕右侧，以避免GUI干扰光标的自动操作，然后单击输入按钮。在第一个宏完成后。单击多维采集窗口中的采集按钮。

完成长期成像后，通过单击自动化插件窗口中的暂停按钮和多维采集窗口中的停止按钮来停止AMFIP任务。打开元素并通过单击 ND 采集窗口中的顶部和底部按钮来设置 Z 堆栈成像。将光路向右切换，然后打开 LED 灯。

缓慢而小心地取下腔室和培养皿的盖子，同时监控明场视野是否有任何漂移。使用塑料移液器吸收0.5毫升SDS溶液。小心地将塑料移液管放在培养皿中培养基上方一点，并将1至2滴SDS溶液加入培养基中。

一旦单元格和明场视图溶解，关闭LED灯，将光路切换到左侧，单击"删除联锁"按钮。运行 Z 堆栈成像并将图像堆栈另存为reference_N，其中 N 是每个视场的序列号。单击多维采集窗口中的多个位置 XY 按钮。

然后选择下一个视野并单击转到按钮，将电动载物台移动到第二个FOV。对每个视场重复此步骤。核定位是B2B ells中的yes相关蛋白或YAP随着底物刚度的增加而增加，而PC-9细胞在不同刚度的底物上的细胞核和细胞质中显示出相似的YAP浓度。

B2B细胞随着时间的推移单调增加扩散面积，同时YAP核质比降低，而PC-9细胞在整个10小时扩散过程中保持相对不变的细胞扩散面积，方向和YAP核与细胞质比。在早期扩散的10小时持续时间内，具有代表性的B2B细胞组成性地变形了底物表面，并在整个细胞区域内施加时间演变细胞牵引力。相比之下，具有代表性的PC-9细胞仅在细胞体的2端产生位移和牵引力，其牵引力在7.5小时后减弱。

B2B细胞的YAP核与细胞质的比例和偶极子牵引似乎遵循两种不同的趋势，这表明在实验中可能存在两组B2B细胞共存。在第一组中，YAP核与细胞质的比值和偶极子牵引力随着细胞扩散面积的扩大而增加，并在约1， 000平方米处达到其最大值。在第二组中，YAP核与细胞质的比值和偶极子牵引力随着细胞扩散面积的扩大而以较慢的速度增加，并且在细胞扩散面积继续增加时保持几乎恒定的值。

需要仔细确定所有激光通道的Z层范围，以克服长期成像中载物台移动期间视场的潜在漂移。这种新技术能够实现自动，非侵入性的长期和多位置成像，并可以帮助阐明需要细胞和细胞器的时间和空间跟踪的分子生物学机制。