基于莱萨特的无细胞系统中的代谢物分析液色谱耦合折射指数或质谱检测

该协议使用折射指数检测来测量碳代谢的副产品，这些代谢通常积聚在基于赖沙特的无细胞系统中。它还利用质谱法检测在代谢活性解剖物中产生的更宽广的中央代谢物面板。本协议中使用的两种技术提供了定量描述基于解质、无细胞系统的化学反应的能力，从而能够检测到更广泛的代谢物，包括复杂解质背景中低浓度的代谢物。

生物科学系的研究生研究员海梅·洛伦佐·丁拉桑和大卫·里维斯将展示这些程序。首先，将不同成分组合在1.5毫升微中心管中，以每毫升总裂解蛋白4.5毫克来准备最终反应。准备无细胞代谢工程（CFME）反应，最终卷为每时间点三升50微升。

通过在每个样本的最终反应量中加入等量的 5%三氯乙酸，立即在适当的时间点终止三叶酸反应。然后通过向每个反应混合物添加两倍的无菌水量来稀释每个样品。要回顾时间零，在添加其他反应成分之前，将 5%三氯乙酸的体积与总最终反应体积与解酯混合。

这种酸化步骤在溶酶显著代谢葡萄糖之前沉淀它们。将样品和离心机以11，600倍 g的速度在台面微中心上漩涡5分钟，并将含有有机分析剂的超分子转移到清洁管中。如果稍后要进行 HPLC 分析，则将样品存储在零下 20 摄氏度。

确保解冻冰上储存的样品，然后再进入下一步。用 0.22 微米的毛孔过滤器过滤每个超纳特。离心机后，将每个过滤器转移到干净的 HPLC 玻璃瓶中。

将小瓶加载到 HPLC 系统的汽车采样器托盘上，该系统已设置用于分析。从菜单栏中选择序列、新序列模板。选择序列。

将序列模板保存为序列模板名称 S.选择序列、序列表。附加 N 行对应 N 小瓶。然后根据它们对自动采样器托盘的排列，分别在 Vial 和示例名称下输入小瓶位置和样品名称。

选择从方法名称下拉菜单中生成的手稿中生成的方法，并输入每个行每小瓶注入 50 微升。单击"应用"，通过选择序列"保存序列模板"来保存序列模板。通过选择序列、负载序列模板、序列模板名称 S.在在线图上实现稳定基线后，通过选择序列、负载序列模板、序列模板名称 S.确保序列模板加载，然后右键单击面板 RID 模块、控制、关闭回收阀，引导溶剂流经 RID 探测器以进行浪费。

要开始数据采集，请从菜单栏中选择序列，然后选择序列表"运行"。从"查看"菜单中选择数据分析视图。从屏幕左侧的文件列表中查找序列文件名。

在屏幕上的中心面板上，前往信号视图选择、RID 信号以查看示例色谱。从屏幕上的顶板中选择与任何样本对应的行。与目标分析相对应的峰值将沿着保留时间轴排列，如葡萄糖、精洁、哺乳酸盐、富甲酸盐、醋酸盐和乙醇，这些样品中都存在所有这些代谢物。

辨别兴趣的高峰是否很好地集成了软件。红线应自动绘制为每个峰值的基数。如果红线是问，自动集成已失败。

然后从集成工具集中选择手动集成按钮，并手动绘制峰值基数以集成峰值区域。从"常见工具集"中选择光标工具，单击正确集成的峰值。峰值区域和选定峰值的相应反应时间将作为屏幕底部面板上的表行进行突出显示。

要出口高峰期，选择文件、出口、整合结果。绘制峰值区域值与电子表格中已知样本浓度的对比。右键单击绘图数据，然后选择"添加趋势线"、格式趋势线、"图表"上的"显示方程"。

在单独的电子表格中，使用标准曲线趋势线的方程将峰值区域值转换为每个样本中每个分析的浓度。计算数据可视化三倍体的平均峰值区域和标准错误值。根据手稿中描述的，在冰上设置每个时间点的三倍反应，时间点除外。

而不是葡萄糖，使用100毫摩尔葡萄糖-13C6的反应的最终浓度。将反应在37摄氏度下孵化一、二、三个小时。首先进行分析，移液器将提取溶剂的等量输送到每个样品中。

如果样品被冷冻，在样品完全解冻之前加入提取溶剂，以防止葡萄糖代谢的重新激活。在冰上执行所有样品处理步骤。为了概括时间零，移液器将提取溶剂的最终体积调整为适当的裂解量，在50微升反应量中达到每毫升4.5毫克的预期最终浓度。

添加上述其他反应组件。这种酸化步骤在溶酶显著代谢葡萄糖之前沉淀它们。用冰上萃取溶剂将样品孵化30分钟，轻轻摇晃。

然后在摄氏4度下以21，000次克离心15分钟，将超高纳特与沉淀蛋白分离。将50微升的超强体转移到自动采样器瓶中，并将小瓶加载到4摄氏度内的托盘上。在准备分析仪器后，使用 LC-MS/MS 系统的数据采集和解释软件设置运行序列。

在路线图、序列设置中，右键单击表以插入与示例一样多的行。对于每行，将喷射体积设置为五微升，并将位置设置为小瓶在自动采样器托盘上各自的位置。将文件名输入为示例名称，并为运行结果设置所需的文件路径。

要开始运行，请突出显示序列中的所有文件名称。从菜单栏中选择操作、运行序列。打开 MZmine，并导入以前获得的原始输出文件。

从菜单栏中选择原始数据方法、原始数据导入，并选择与样本对应的文件。按照手稿中描述的步骤完成 MZmine 分析。将 MZmine 分析结束时的原始峰值区域作为 CSV 文件导出。

打开电子表格，计算葡萄糖代谢中 13C 标记代谢物的质量，以便进行有针对性的搜索。使用计算的 13C 标记代谢物质量来搜索和注释 MZmine 结果中的量电荷功能。手动检查质量浏览器上假定注释的光谱以确认注释。

打开路线图，四等浏览器。从工具栏打开原始文件以导入每个示例的原始 MS 数据。在所需的保留时间范围内绘制一条线，与总离子色谱上的假定注释相对应，以查看质量光谱。

在 HPLC-RID 实验中，葡萄糖在反应后的头三小时内被消耗，主要发酵为乳酸盐。乙醇的积累也显著发生在反应的前三个小时内，并随后停止。醋酸盐最初作为S30缓冲剂的组成部分出现在反应中，直到6小时后才因新陈代谢而积累，当时葡萄糖消耗已经减慢。

因此，乳酸和乙醇可被视为赖氨酸、无细胞葡萄糖代谢的主要发酵最终产品。观察到，甲基和精制被合成为小发酵产品。糖-13C6通过糖溶解明显消耗，糖溶胶中间体的波动就证明了这一点。

与 HPLC 折射指数检测数据一致，葡萄糖累积到乳酸-13C3，并在反应后的头三个小时内发酵至精洁-13C3。将葡萄糖-13C6衍生碳与糖磷酸盐6-磷糖糖酚结合， 还观察了6-磷糖酸盐、核糖-5-磷酸盐和西多赫普托洛-7-磷酸盐，证实了五磷酸盐通路参与裂解葡萄糖代谢。裂解葡萄糖代谢被发现饲料酪氨酸-13C9合成，同时也提供了一个前体的异丁-13C5生产。

控制样本准确表示时间为零非常重要。因此，确保溶解物中的蛋白质在混合含有能量源的溶液之前处于灭活状态。还要确保测试样品、控制样品和标准的峰值自动集成一致，使提取的峰值区域具有可比性。