自动、高通量检测细菌对宿主细胞的粘附

该方法可快速、高通量地检测细菌对宿主细胞的依从性。与传统的电镀方法相比，它减少了定量粘附细菌所需的手动操作时间。这种技术是自动化的，节省时间的，并且非常可重复。

它也广泛地应用于大多数宿主细胞。这种方法，有非常简单。对于第一次试验，必须优化感染的多重性以及宿主细菌共培养时间等条件。

首先通过在室温下以13， 000倍G离心两分钟，在指数阶段收获细菌培养物。用一毫升PBS洗涤细胞托盘后，将细菌调色板重悬于一毫升PBS中。通过测量600纳米处的光密度来确定细菌悬浮液的浓度。

然后，为了染色细菌悬浮液，将两微升的500倍浓缩原液加入绿色或红色染色染料到一毫升细菌悬浮液中，以稀释染料一倍。将细胞在室温下孵育30分钟，在黑暗中轻轻旋转。30分钟后，将染色的细菌以13， 000倍G离心两分钟，并将沉淀重悬于一毫升PBS中。

通过以13， 000倍G离心两分钟收集染色的细菌细胞。将沉淀重悬于一毫升新鲜F12 K培养基中，并在600纳米处测量每种培养物的光密度。随后根据感染的多样性和宿主细胞浓度将培养物稀释至所需浓度。

对于细菌粘附性测定，通过向每个孔中加入100微升温PBS并轻轻地上下移液，将先前培养的A549细胞单层洗涤三次。然后丢弃 PBS。或者，添加 PBS 后，等待 10 秒钟，然后使用真空吸尘器取出 PBS。

为了确定细菌关联的动力学，用具有不同感染多样性的100微升所需浓度的细菌悬浮液覆盖细胞。将细菌旋转下来，并将受感染的A549细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下再孵育一小时。如图所示，用温暖的PBS清洗单层五次，去除未结合的细菌。

接下来，通过在冰上96孔板的所有孔中加入100微升4%甲醛来固定细胞。15分钟后，用PBS清洗板三次以除去固定溶液。在室温下用每毫升50纳克DAPI染色剂在细胞核中染色10分钟。

用PBS洗涤细胞后，用100微升PBS覆盖受感染的A549细胞以避免干燥，然后将板在四摄氏度下在黑暗中储存长达两天或进行成像。为了保持数据完整性，随机和手动选择每个孔的五个位置，以20倍放大倍率捕获图像。在GFP通道下捕获细菌的荧光图像，在DAPI下捕获A549细胞的荧光图像，并且对于由红色荧光染料染色的细菌使用PE Si五通道。

设置滚动球的参数进行平滑处理，并根据目标自动测量图像反卷积的点扩散功能，以实现更好的分辨率。测量宿主细胞和细菌的荧光强度。将宿主细胞和细菌的最弱荧光强度设置为细胞计数阈值，并将15微米距离内靠近宿主细胞的所有细菌计数为粘附细菌。

从所有自动图像中对细胞进行计数后，分析关键读数，例如宿主细胞计数，细胞大小和形状，总细菌计数以及每个宿主细胞的平均细菌帐户，这是确定细菌依从性的最重要指标。经过一小时的co孵育后，铜绿假单胞菌菌株PAO1以剂量依赖性方式粘附在A549细胞上。当革兰氏阳性细菌单核细胞增多性李斯特菌及其阴性对照枯草芽孢杆菌时，也观察到类似的结果。

宿主贴壁铜绿假单胞菌分割的代表性图像表明，使用该协议对细菌细胞进行计数变得容易。自动分析的结果包括细菌和宿主细胞计数，每个宿主细胞的平均细菌计数和宿主细胞大小以及代表宿主细胞健康状态，细菌粘附水平和细菌细胞毒性的区域。除A549细胞外，HUVECs还进行了粘附测定测试。

红沙雷氏菌和无乳链球菌粘附于HUVEC，但不粘附于A549细胞，这表明多个宿主使用该方法研究宿主细菌相互作用的有效检测和适用性。宿主细胞应达到约90%至100%的汇合度，以尽量减少不希望的细菌粘附在孔的底部。这项技术将使研究人员能够探索新的机制，即宿主与害虫的相互作用。