磷酸钙转染法制备假型H5禽流感病毒及抗体中和活性测定

该协议描述了H5高病原体禽流感假病毒制剂和伪病毒中和测定的程序和关键步骤。此外，它还讨论了这些测定的故障排除限制和修改。高致病性病原体必须在三级生物安全实验室进行，而假病毒可以在二级生物安全实验室安全处理。

首先，在完整的DMEM培养基中制作HEK293 FT细胞的单细胞悬液。将10毫升单细胞悬液加入T75烧瓶中，然后在37摄氏度下孵育。转染前两小时，用10毫升氯喹新鲜完全培养基替换旧培养基。

按照手稿中的说明混合试剂和质粒DNA，然后将该混合物转移到细胞上方的培养基中并轻轻摇动。孵育后，用15毫升新鲜的完整DMEM培养基替换培养基。65小时后，通过离心收获上清液。

收集上清液并等分。为了检测血凝素蛋白表达，将 50 微升 PBS 添加到 96 孔圆底板的第 2 列至第 12 列中。将100微升假病毒加入第一列的孔中。

然后将50微升假病毒从第一列转移到第二列的孔中。进行这种双重稀释，直到第11列，然后轻轻混合。然后丢弃第 50 列中多余的 11 微升。

向每个孔中加入50微升0.5%红细胞，然后轻轻混合。在室温下孵育30至60分钟后，观察并记录假病毒的血凝素滴度。对于假病毒滴定，在完整的DMEM培养基中制成每毫升MDCK细胞10至第四个细胞的5倍单细胞悬液。

将 1， 250、2， 500、5， 000、10， 000、20， 000 和 40， 000 个细胞添加到平底 96 孔板的不同孔中。孵育后，解冻并涡旋假病毒。向96孔圆底板的每个孔中加入六个假病毒HAU，并用高达120微升的完整DMEM补充每个孔。

将100微升混合物转移到96孔板中的细胞中。将培养板孵育 48、60 和 72 小时以感染病毒并进行荧光素酶测定。为了进行荧光素酶测定，通过小心地去除培养基并用200微升PBS冲洗来洗涤细胞。

尽可能多地去除PBS，然后向每个孔中加入50毫升裂解缓冲液。第二天，在室温下平衡板两个小时，然后摇动培养板几次，并将所有细胞裂解物转移到不透明的96孔板中。向每个板中加入50微升基材并充分混合。

使用光度计记录假病毒的荧光素酶滴度。将100微升MDCK细胞的单细胞悬液加入平底96孔板的每个孔中，并在37摄氏度下孵育20小时。孵育后，解冻并涡旋储存在零下80摄氏度的假病毒和血清。

在完全培养基中稀释血清20倍。将 100 微升 DMEM 培养基添加到第 3 列至第 10 列中。将200微升稀释的血清加入第二柱的孔中并进行连续稀释。

然后在第11列中加入100微升DMEM培养基作为阴性对照。向每个孔中加入100微升伪病毒并混合。将100微升混合物从96孔圆底板转移到96孔细胞培养板的相应孔中。

在37摄氏度下孵育60小时后，进行荧光素酶测定。血凝素测定显示，流感假病毒库存中每毫升流感假病毒存在643个HA单位。HA和Gag P24的比率在正常范围内。

蛋白质印迹测定显示存在四种蛋白质类型，包括HA0，HA1，HA2和NA蛋白，表明流感假病毒与野生型病毒相似。假病毒滴定结果表明，相对荧光素酶活性最高的合适条件包括在96孔板的孔中喂养5， 000个细胞，并在病毒感染60小时后检测相对荧光素酶活性读数。DDV组免疫血清对泰国1罐104株假病毒表现出较高的中和滴度，而对照组血清未表现出任何中和活性。

与对照血清相比，免疫血清的中和活性有效，表明免疫血清中有许多抗体指向HA头部。在病毒进入评估期间，免疫血清和对照之间的显着差异表明抗体直接指向免疫血清中的HA干区域。执行此过程时，请记住保持转染溶液和培养基的pH值稳定。