半翅目肠道中植物病毒和昆虫载体蛋白的免疫荧光标记

该协议可用于研究昆虫的各种运动，昆虫蛋白质的功能以及体内病毒与媒介昆虫之间的相互作用。这种方法高效且信息丰富。当用激光扫描共聚焦显微镜观察时，昆虫肠道和辅助细胞的结构清晰可见。

演示该程序的将是来自我们实验室的张璐博士。首先，将玻璃烧杯中的非病毒性昆虫转移到新鲜的南方水稻黑条纹矮病毒SRBSDV上，受感染的水稻植物用防虫网覆盖，为期两天的病毒获取访问期。然后将昆虫收集在装有新鲜水稻幼苗的玻璃烧杯中。

两天后，使用手动吸气器从玻璃烧杯中收集昆虫，以进行肠道解剖和切除。按照文本手稿中的说明准备 0.01 摩尔 PBS、4% 多聚甲醛和 2% Triton X-100。使用移液器将100微升PBS放在载玻片上，然后将载玻片放在光学显微镜的载物台上。

使用手动吸引器从玻璃烧杯中收集感染SRBSDV的成虫，并将它们放在冰上的1.5毫升管中以麻痹昆虫。将瘫痪的成年人转移到载玻片上的100微升PBS中，腹部向上。用镊子夹住身体，然后用另一组镊子取下头部。

用一组镊子夹住腹部两侧，用另一组夹住产卵器或尾巴的交配器官，然后小心地拉动一个腹部段的节间膜，慢慢暴露腹部的肠道。继续撕开膜，逐渐从腹部拉出完整的肠道。轻轻拉下连接到肠道末端的尾巴，以去除整个肠道。

将切除的内脏放入 200 微升离心管中。在管中加入200微升PBS，并使用移液管彻底清洗内脏。使用移液器将100微升PBS放在载玻片上，然后将载玻片放在光学显微镜的载物台上。

使用手动吸引器从玻璃烧杯中收集感染SRBSDV的若虫，并将它们放入放在冰上的1.5毫升管中以麻痹昆虫。将瘫痪的若虫转移到载玻片上的100微升缓冲液中，腹部朝上。拆下若虫的尾巴，然后夹住昆虫身体轻轻固定，用另一对夹住头部。

轻轻地将头部从身体上拉开，同时仍然保持其与肠道的附着，使头部与身体分离，但肠道仍附着在胸部和腹部。在镊子仍然夹住身体的情况下，用另一对小心地移动头部并逐渐拉出肠道。将肠道从头部分离，以获得完整的肠道，而不会损坏身体。

将切除的内脏放入管中。将PBS添加到管中，然后用移液管轻轻吸出释放溶液以彻底清洗内脏。按照文本手稿中的说明制备抗体和封片剂。

将新鲜切除和PBS洗涤的WBPH肠放入室温下200微升离心管中的100微升4%多聚甲醛中。两小时后，用200微升PBS替换多聚甲醛溶液。10分钟后，取出PBS以消除任何多聚甲醛，并重复PBS洗涤步骤两次。

两次PBS洗涤后，加入200微升非离子洗涤剂Triton X-100以在室温下透化样品。30 分钟后，取出 Triton X-100，用 PBS 洗涤三次 10 分钟，洗掉任何剩余的洗涤剂。用 50 微升公牛血清白蛋白将标记的抗体稀释 1 至 50。

将稀释的抗体加入试管中，并将样品在 4 摄氏度下孵育过夜。在去除抗体后的早晨，用PBS洗涤三次10分钟，洗去剩余的抗体稀释剂。用50微升PBS稀释一微升DyLight 633-鬼笔环肽，并向管中加入50微升稀释的鬼笔环肽，在室温下孵育两小时。

去除鬼笔环肽后，用PBS清洗三次10分钟，彻底洗掉剩余的鬼笔环肽。将一滴含有DAPI的封片剂放在显微镜载玻片上。将内脏转移到培养基上，轻轻地将盖玻片放在样品上，不要产生气泡。

用鬼笔环肽标记后切除成人WBPH肠道的代表性激光扫描共聚焦显微照片显示前肠，中肠和后肠三个部分。其中，中肠是SRBSDV的初始感染部位。肠道的单层上皮细胞结构有助于研究昆虫蛋白的细胞定位以及病毒和昆虫蛋白的共定位。

此处显示了带有 DyLight 488 标记的抗 VAMP-7 和带有 DyLight 549 标记的抗 SRBSDV 抗体的 SRBSDV 病毒粒子的切除 WBPH 内脏。VAMP-7和SRBSDV病毒粒子在细胞质中共定位，表明VAMP-7可能在体内病毒传播中发挥作用。透化的肠道在与荧光素偶联抗体孵育后应彻底清洁，以减少背景和非特异性结合。

这是观察昆虫中病毒、其他病原体和昆虫蛋白定位的可靠方法。它为进一步研究病原体与昆虫之间的关系提供了基础。