在苹果纸浆中用 Fluo-4/AM 染色细胞质 Ca²⁺

钙作为一种重要的矿物质元素，在苹果等树果的生长和质量控制中起着关键作用，它能调节贮藏过程中的硬度、含糖量、储存期和生理紊乱。钙成像是检测细胞质中钙离子动态变化的最西方式。小分子荧光指标，如荧光-4/AM具有钙离子特异性选择性，可以通过酯化孵化进行非侵入性加载，这种孵化具有灵活性、快速性和非细胞毒性。

该协议将引入一种将小分子化学荧光试剂荧光-4/AM加载到植物原质中的方法。前列提取将 0.5 毫升酶溶液加入 1.5 毫升离心机管中。选择一个健康成熟的苹果，然后切成10倍5倍1立方毫升大小的纸浆。

将纸浆片放入酶溶液中，然后关闭管子。在28度孵化管一小时。晚上 70 点在黑暗中被棚屋。

之后，洗涤纸浆片，吸气所有的酶溶液，然后加入0.5毫升的基本溶液。离心机以 300 g 的速度行驶 2 分钟。前体悬浮可以通过吸气底部溶液获得。

小分子化学荧光试剂染色。准备氟-4/AM装载解决方案，以2毫摩尔氟-4/AM，20%乙基127和10倍磷酸盐缓冲盐水在一比一到二的比例。将氟-4/AM的1微升加载溶液添加到99微升前列座悬架。

荧光染料的最终浓度为5微摩尔。混合溶液，然后关闭管子。同时，兰萨努姆铁钙或小分子化学荧光剂的独特性。

加入一个微升或10微升以上的兰沙南铁，然后一个微升加载溶液的氟-4/AM到98微升原质悬架。兰萨努姆铁的最终浓度为100微摩尔。混合溶液，然后关闭管子。

在37度下在黑暗中孵育30分钟。之后，离心机以300G的速度行驶两分钟。吸气到 17 微升溶液，并添加 17 微升基本溶液。

将原位悬架在 37 度下孵化 30 分钟，以完全启动后，吸气 50 微升原质悬浮并滴入滑梯。在荧光显微镜下观察。选择 20 倍放大倍数和 GFP 通道进行观察。

将亮度均匀调整为 0.5。这个建议方法的关键步骤是清洗原体中的污渍并孵育30分钟。在观察和孵化过程中，洗涤不足会导致荧光的过度背影，从而使细胞质的装载或探针更加充足。

原体可生存性测定在37度孵育30分钟后，采取99微升原质悬浮。在 FD 溶液中加入 1 毫升，以达到原质悬架。通过上下管道多次混合溶液，然后关闭管子。

在室温下在黑暗中停留五分钟。准备幻灯片，并使用 GFP 通道在荧光显微镜上观察幻灯片。我们向您展示结果如下图一。

我们使用酶法从纸浆中获取原质。有些原体有真空，而另一些则没有。原质被FD染色了五分钟，在细胞质中显示荧光，表明高温37度不会影响活性或原质图二。

原质在钙熨斗荧光指示器中不显示荧光，或者没有加载到它们中。比在荧光-4/AM被加载到前列座，细胞托普拉斯特，但没有一个真空成为荧光。有效阻断钙通道的兰萨努姆铁是细胞膜被添加到前列腺氟-4/AM加载。

在100微摩尔的最终浓度，铁可以显著降低钙的荧光强度。这一结果进一步表明，氟-4/AM有效地停留在细胞质中的钙铁中，并显示出钙铁含量的动态变化。图三 使用IMH批准的加6.0软件荧光-4/AM染色，加上兰沙努姆铁，对荧光-4/AM结果进行了分析，显著降低了细胞质钙熨斗的荧光值。

在这段视频中，所有的原质都是通过酶水解获得的。我们成功地将荧光探测器加载到37度的原质中。更过，该方法没有影响原质的生存能力。

综上所述，这里详细描述了这种方法。苹果浆细胞细胞质钙离子的动态变化，为钙相关研究的进一步目的提供了10个相等的支持。