猪肠粘膜上皮中靶向氨基肽酶N的单克隆抗体的生产

衍生单克隆抗体主要用于诊断治疗性免疫试剂，强调需要在有限的生产中生产稳定可靠的抗体。本文描述的方法证明，重组抗体生产可以提高单克隆抗体生产效率，并最大限度地降低人工和时间相关成本。这些方法用于开发氨基肽酶和基于抗体的抗体药物偶联物和其他治疗产品，这有助于阐明APN在预防和治疗细菌和病毒感染中的作用。

演示该程序的是我实验室的研究生Yan Li。首先，腹膜内将100微克APN蛋白注射到选定的成年雌性小鼠中以进行最终抗原增强。注射三天后，收集小鼠的脾脏并用DMEM洗涤两次以去除血液和脂肪细胞。

使用200目铜网格过滤脾细胞悬液以去除组织碎片，并使用离心法收获脾细胞以去除脾膜。将小鼠SP20骨髓瘤细胞接种在含有5毫升补充有6%胎牛血清的DMEM的25平方厘米烧瓶中，并在37摄氏度和6%二氧化碳气氛下培养细胞以维持细胞活力。培养五到六天后，复苏后细胞应达到80%至90%汇合，并在显微镜下呈现圆形，明亮和清晰。

杂交前一天，从小鼠的腹膜腔收集巨噬细胞。在96孔板中以0.1至0.2乘以每毫升10至5倍的密度接种腹膜巨噬细胞，每个含有100微升HAT培养基并孵育过夜。对于杂交，用移液器轻轻吸出8至10瓶的SP20细胞，并将其悬浮在10毫升无血清DMEM培养基中。

用新鲜的DMEM洗涤细胞并离心两次，然后将它们重悬于10毫升DMEM中。将定量的脾脏细胞与SB20细胞以10:1的比例混合，并将它们转移到50毫升管中。离心后，弃去上清液并收集管底部的沉淀。

在杂交前轻拍试管以松开沉淀。使用滴管，在 45 秒内将一毫升预热至 37 摄氏度的聚乙二醇 1500 滴加到松散的细胞沉淀中，同时轻轻旋转管底部。然后将一毫升预热至37摄氏度的DMEM缓慢加入混合物中90秒，然后再加入30毫升新鲜DMEM，并将融合管放入37摄氏度的水浴中30分钟。

孵育后，收获细胞。重悬HAT培养基并在接种有腹膜巨噬细胞的96孔板中培养。五天后，向每个孔中加入100微升新鲜HAT培养基。

孵育五天后，再次用HAT培养基替换培养基。使用涂有 5 μg/毫升 APN 蛋白的微量滴定板，在 0.05 摩尔 PBS 中稀释，使用 ELISA 测定法分析杂交瘤上清液中的单克隆抗体。在 0.4 毫摩尔 β-d-1-吡喃半乳糖苷存在下，在 37 摄氏度的轨道振荡器中培养 pET28a 加重组抗体氨基肽酶 NBL21 转化细菌 10 小时。

将每孔100微升0.5乘以10至第五个中国仓鼠卵巢细胞接种到96孔板中，在37摄氏度和6%二氧化碳气氛下孵育18至24小时。当细胞达到 80% 至 90% 汇合时，用 Opti-MEM 稀释 pIRES2-zs Green One 重组抗体氨基肽酶和质粒至终浓度为 0.1 微克/微升。五分钟后，将 50 微升稀释的 pIRES2-zs Green 一重组抗体氨基肽酶和质粒与 1 微升脂质胺 2000 和 49 微升 Opti-MEM 混合。

孵育20分钟后，向含有CHO细胞的96孔板的每个孔中加入100微升混合物。在转染后4至6小时，用补充有10%FBS的DMEM F12替换培养基。孵育48小时后，向每个孔中加入400微克/微升G418，以选择稳定转染的细胞。

使用补充有 10%FBS 和 400 微克/微升 G418 的 DMEM F12 培养基选择 10 天后，用荧光激活细胞分选对细胞进行分选。连续稀释收获的阳性细胞。在96孔板中以平均每孔0.5至2个细胞接种，并在37摄氏度，6%二氧化碳培养箱中培养。

在代表性的显微镜分析中，所有杂交瘤细胞都呈现圆形、明亮和透明。经SDS-PAGE证实，纯化的单克隆抗体具有重50千道尔顿链和轻25千道尔顿链，并在纯化的腹水中发现。此处显示了培养物上清液和腹水中这些抗APN单克隆抗体的滴度。

小鼠单克隆抗体同种分型显示，来源于克隆5B31、5B36、3C48、5C51和6C56的抗体具有免疫球蛋白G2B亚类，而APN 2A20为免疫球蛋白G2A κ型抗体，单克隆抗体APN 3FD9、3F10和10F3属于免疫球蛋白M型，经过加工的kappa轻链。这些单克隆抗体中的大多数显示AV值超过50%，表明它们靶向APN中的不同表位，而APN 5C51抗体识别抗原表位，如APN 3C48，5B31和6C56单克隆抗体识别的抗原表位。将扩增的APN 5B36 VHVL基因连接到pET28a阳性或pIRES2-zs Green载体中，分别构建重组表达质粒pET28a阳性RABS APN和pIRES2-zs Green 1 RABS APN。

使用ELISA和IFA测定纯化和分析pET28a加重组抗体氨基肽酶NBL21和pIRES2-zs Green one重组抗体氨基肽酶NCHO细胞表达的抗体。然而，只有pIRES2-zs绿色一重组抗体氨基肽酶NCHO细胞上清液中表达的抗体才能识别APN蛋白。APN 5B36单克隆抗体与APN蛋白的结合比重组抗体更早达到平衡。

使用蛋白A琼脂糖纯化上清液中的单克隆抗体比使用饱和硫酸氨沉淀更好。