监测氧诱导视网膜病变小鼠模型中视网膜血管的动态生长

该方案可以帮助研究人员轻松分离小鼠的视网膜，并观察OIR小鼠模型视网膜脉管系统的动态变化。这种方法的主要优点是保持分离视网膜的完整性，并允许每只小鼠作为自己的对照，这使得结果更具可比性。第一次尝试这种方法的研究人员在进行五次定向成像时可能会遇到困难，因为将幼崽放置在正确的位置有点困难。

要收集组织以进行视网膜整体安装，请使用弯曲剪刀将眼球与安乐死的 C57-Black/6 幼犬的眼眶组织断开。然后，将弯曲的镊子插入眼球的后部，夹住视神经并迅速将眼睛从眼眶中抬出。将眼球放入预冷的PBS中，以去除表面的任何毛发和血液。

收集完所有眼球后，将清洁的眼球转移到含有4%多聚甲醛的两毫升微量离心管中，并在室温下孵育15分钟，每分钟孵育12至15转。在孵育结束时，在解剖显微镜下将一滴PBS添加到培养皿的中心，并将一个眼球放入滴中。用一对镊子握住眼球，用一毫升注射器针头小心地刺穿角膜缘处的角膜。

将一把剪刀的尖端插入穿刺中，并沿着角膜缘切割角膜，注意不要割断视网膜。使用镊子去除虹膜和晶状体，并将剩余的眼罩置于4%多聚甲醛中，在摇床上室温孵育45分钟。在孵育结束时，将固定眼罩放在新培养皿中心的一滴新鲜的PBS中。

用一对镊子握住眼罩，用第二对镊子轻轻分开视网膜和巩膜层。将剪刀的尖端放在视网膜和巩膜层之间，然后将巩膜切向视神经。从视网膜上剥离巩膜以获得视网膜杯。

使用镊子，松开径向透明质血管和周边视网膜之间的连接。使用切断吸头的两毫升移液器将视网膜杯转移到 48 孔板的一个孔中，在摇床上的室温 PBS 下进行三次五分钟的洗涤。最后一次洗涤后，将杯子在 PBS 中的 1% Triton X-100 和 5% 普通驴血清中在 4 摄氏度下孵育过夜。

要用异凝集素 B4 标记视网膜脉管系统，将视网膜在 48 孔板的一个孔中孵育在 400 微升补充有异凝集素 B4-594 的 400 微升 0.1% 正常驴血清中，在摇床上以 4 摄氏度过夜。如有必要，可以同时添加另一种一抗。第二天，在摇床上用0.1%PBST洗涤三次20分钟洗涤视网膜。

最后一次洗涤后，将视网膜与适当的高亲和力二抗在室温下孵育一小时，然后用DAPI标记样品20至25分钟。在孵育结束时，在室温下以0.1%PBST振荡洗涤视网膜，每次30分钟洗涤。最后一次洗涤后，将视网膜杯转移到干净的载玻片上，开口朝上，然后使用显微镜在三点钟、六点钟、九点钟和 12 点钟位置从外围向中心放射状切割视网膜，距离视神经头最多 1 到 1.5 毫米。

每次洗涤用几滴PBS冲洗视网膜三次，然后使用干法纸干燥并压平视网膜。在盖玻片的中心加入一滴封片剂，直到液滴的直径覆盖盖玻片的一半。然后快速将盖玻片安装介质面朝下放在展开的视网膜上。

一旦所有视网膜平面支架都准备好了，就可以通过共聚焦荧光显微镜对样品进行成像。对于体内成像，添加20微升散瞳眼药水，以实现持久的瞳孔扩张。五分钟后，将幼崽放在成像设备前面的小加热垫上，处于稳定位置。

为了保持角膜中的水分，请在整个成像过程中定期添加人工泪液。接下来，单击设备上的红外眼底成像，将视神经头调整到屏幕中央。腹腔注射150微升0.5%荧光素钠盐溶液，立即点击成像设备触摸屏上的FA和注射按钮启动定时器。

三分钟后，当视网膜的血液循环进入静脉期时，获得中央视网膜的第一个图像。将成像装置的晶状体水平移动到眼睛的鼻侧，直到视神经头位于图像采集区域一侧的中点，然后拍摄第二张图像。继续移动晶状体并以相同的方式获取颞视网膜、上视网膜和下视网膜的图像。

要在适当的成像处理程序中处理视网膜图像，请打开"文件"菜单并单击"新建"以创建具有黑色背景的新画布。打开中央视网膜的图像。然后单击"文件"以添加第二个图像。

将第二张图像的不透明度调整为 60%，然后移动图像并调整其大小，直到两个图像重叠。单击在自由变换和变形模式之间切换，并在必要时对容器进行细微调整。然后将第二张图像的不透明度设置回 100%选择两个图像，然后单击"自动混合图层"。

选中"全景"作为混合方法，并选中"无缝色调和颜色"和"内容感知填充透明区域"框。单击"确定"完成前两个图像的拼接。接下来，添加第三张图像，并将该图像拼接到前两张图像，如图所示，直到拼接单个视网膜的所有五张图像。

处理完分析中的所有图像后，使用裁剪工具将FFA图像裁剪为均匀大小，以便观察不同发育时间点视网膜脉管系统动力学的变化。暴露于高氧 5 天后，出生后第 12 天幼崽的中央视网膜显示出较大的非灌注区域。在转移到缺氧条件下五天后，视网膜逐渐新生血管化，表现出比周围正常血管中观察到的更强的荧光信号增加。

出生后第 17 天后，病理性新生血管迅速消退，到出生后第 25 天视网膜显示完全正常的外观。通过控制幼崽的窝产仔数和出生后体重增加，可以实现氧诱导视网膜病变模型的良好重复性和稳定性。据观察，血管闭塞通常在产后第 12 天达到峰值，在出生后第 25 天消失，而新生血管形成在出生后第 17 天达到峰值，并在出生后第 25 天消退。

在出生后第15至25天氧诱导的视网膜病变小鼠中，与正常小鼠的视网膜相比，视网膜血管直径增加并变得非常折磨人。左手的镊子主要起辅助作用。注意不要挤压眼球，这可能会使其变形或破裂。